OsCOL16基因在控制水稻抽穗期中的应用
【专利摘要】本发明提供OsCOL16基因在控制水稻抽穗期中的应用，基因OsCOL16来自水稻品种日本晴，其cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码具有448个氨基酸的B?box/CCT锌指蛋白，属于CONSTANS?like转录因子基因家族，遗传转化实验表明，过表达OsCOL16基因在短日照和长日照条件下均抑制水稻抽穗。进一步研究发现OsCOL16基因表现为昼夜节律表达，定位在细胞核中并具有转录自激活活性，通过上调Ghd7来抑制Ehd1、Hd3a和RFT1的表达，最终延迟抽穗。
【专利说明】
0SC0L16基因在控制水稻抽穗期中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，具体地说，设及0SC0L16基因在控制水稻抽穗期中 的应用。
【背景技术】
[0002] 抽穗期(作物中称为开花时间）是一个控制品种地区适应性的重要的农艺性状，精 确控制开花时间对于品种的生殖转化十分重要，从而影响作物产量（Cockram et al. (2007)J Exp Bot，58(6): 1231-1244)。在合适的生长季节，晚抽穗导致长的营养生长期从 而促进种子中干物质的积累，然而太晚抽穗可能导致收获时较低的种子成熟度。另一方面， 对于生长季较短的作物来说，提前抽穗对其有利，然而过早抽穗会缩短营养生长期从而导 致减产。因此干物质积累和压力避免之间的平衡对于作物的产量十分重要(Roux et al. (2006)Trends Plant Sci,11(8):375-381；sun et al.(2014)Protein Cell,2014,5(12): 889-898)〇
[0003] 水稻抽穗同时由遗传和环境决定，光周期敏感性是决定开花时间和地区适应性的 重要因素，并且构成了一个复杂的网络（Tsuji et al.(2011)Cu;r;r Opin Plant Biol, (2011)14(1) :45-52.)。水稻是一个典型的短日照作物，在短日照下提前开花，目前为止，在 水稻光周期开花途径中有超过35个基因 ATTLs被克隆（Tsuji et al.(2013)Curr Opin Plant Biol.16(2):228-235;Sun et al.(2014)Protein Cell,2014,5(12):889-898)。水 稻中有3个光周期开花途径，包括短日照促进通路，交汇于Hdl和化dl;长日照促进和长日照 抑制通路，主要交汇于 E；hdl(Tsuji et al.(2011)Cu;rr Opin Plant Biol, (2011)14(1): 45-52.)。册1是拟南芥开花激活子CONSTANS(CO)的同源基因，编码一个锋指转录因子，包含 两个B-box结构域和一个CCT结构域，在短日照条件下通过激活Hd3a促进开花，然而在长日 照条件下抑制Hd3a 从而延迟抽穗化 ayama et al. (2003)化 ture, 422(6933): 719-722)。 化dl编码一个B型响应调节因子，在短日照和长日照条件下通过促进Hd3a和RFTl的表达来 促进抽穗(Doi et al.(2004)Genes Dev，18(8) :926-936)。
[0004] 化dl作为一个水稻开花整合因子，很多开花抑制因子(如化d7，DT册/Ghd8,0sC0L4 和册 16/EL1)和开化促进因子(如 RIDl/0sIDl/Ehd2，mid3，Ehd4,0sMADS50,0sMADS51，册 17/ Os 化 F3 和 OsFKFl)交汇于化 dl(Sun et al.(2014)Protein Cell ,2014,5(12) :889-898)。 化d7编码一个CCT结构域蛋白，在抑制通路中起重要作用(Xue et al.(2008)化t Genet，40 (6):761-767)。化(17同时接收多个来自其他基因的信号如肋16/61^，611(13，肋17/〇36口^3和 OsFKFl 来调节 Hidl 的表达（Sun et al.(2014)Protein Cell ,2014,5(12) :889-898)。册 16/ ELI编码一个蛋白激酶I，在长日照条件下通过憐酸化化d7抑制开花(Dai et al. (2010) Embo J，29(ll):1916-1927;Hori et al.(2013)Plant J，76(l):36-46;Kwon et al. (2013)Plant Cel 1 Environ，37( 1): 101-112)。化(13编码一个植物同源异形域锋指蛋白，在 长日照条件下下调化(17从而促进开花（Matsubara et al.(2011)Plant J,66(4) :603- 612)dHc117/0sELF3是拟南芥ELF3的同源基因，在长日照条件下负调Ghd7促进开花 (Matsubara et al.(2012)Plant Cell Physiol,53(4):709-716；Yang et al.(2013)Mol Plant，6(1) :202-215) dOsFKFI是拟南芥FKFl的同源基因，在短日照和长日照条件下通过下 调化(17从而激活Hidl来促进开花化an et al.(2015)Plant Cell Environ,38(12):2527- 2540) dDT册编码一个CCAAT-box结合蛋白的HAP3亚基，在长日照条件下通过下调化dl表达 延迟开花（Wei et al.(2010)Plant Physiol，153(4):1747-1758;化n et al.(2011)Mol Plant ,4(2): 319-330) e0sC0L4属于CO家族基因，位于Os地yB和Hidl之间抑制开花化ee et al. (2010)Plant J，63( 1): 18-30) eRIDl编码一个C2H2锋指转录因子，在短日照和长日照条 件下均强烈促进开花(Wu et al.(2008)Proc rfetlAcadSciUSA，105(35):12915- 12920；Park et al.(2008)Plant J,56(6):1018-1029；Matsubara et al.(2008)Plant 化ysiol ,148(3) :1425-1435)。化d4编码一个CCCH锋指蛋白，通过化dl上调成花素基因的表 达（Gao et al.(2013)PLoS 〇61161，9(2):61003281)。〇3]^0550和〇3]^0551属于]^05蛋白， 位于化dl上游，分别是长日照和短日照特异的开花促进子化ee et al.(2004)Plant J,38 (5) :754-764;Kim et al.(2007)Plant I^ysiol, 145(4): 1484-1494)。因此在水稻光周期 开花途径中，Ghd7-Ehdl-Hd3a/RFT1是一条重要的开花通路。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供0SC0L16基因在控制水稻抽穗期中的应用。
[0006] 本发明的另一目的是提供0SC0L16基因的等位基因及其在水稻品种改良中的应 用。
[0007] 水稻中共有19个co-like基因，在进化上可W分为4支，部分基因属于第1、11和IV 组已经被克隆，然而第II组的基因研究的较少(Wu et al，（2013)Proc化tl Acad Sci U S A,2013,110(8) :2775-2780) d0sL(RAP-DB数据库中登录号为0s06g0264200，RGAP数据库中 登录号为L0C_0s06gl5330.1)，属于第II组CO-1化e蛋白，与拟南芥C0L16基因具有40.4%的 氨基酸一致性，将其重命名为OsCOLie。
[000引本发明提供的控制水稻抽穗期0SC0L16基因，来自水稻品种日本晴，其cDNA序列见 SEQ ID N0:1，长度为1854bp，其编码区（CDS)序列见SEQ ID N0:2。该基因编码具有448个氨 基酸的B-box/CCT锋指蛋白，包含一个B-box结构域和一个CCT结构域，属于CONSTANS-like 转录因子基因家族，进一步研究发现在短日照和长日照条件下，0sO)L16基因通过上调化d7 来抑制化dl、册3a和RFT1的表达，最终延迟抽穗。
[0009] 为了实现本发明目的，本发明提供0SC0L16基因在控制水稻抽穗期中的应用。
[0010] 本发明还提供0SC0L16基因在延迟水稻抽穗期中的应用。
[001。 前述的应用，通过在水稻中过表达0SC0L16基因，W延迟水稻植物的抽穗期。
[0012] 在本发明的一个【具体实施方式】中，通过将OsCOLie基因构建到载体PCAMBIA2300 上，用所得重组载体转化水稻，筛选阳性转基因水稻植株。
[0013] 携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII'Academy Press，New York,第411-463页；Geiserson和 Corey, 1998,Plant Molecular Biology,2"*^ Edition)〇
[0014] 优选地，采用农杆菌介导的遗传转化法转化水稻，转化后的材料经过共培养-筛 选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选阳性转基因水稻植株。
[0015] 更优选地，所用农杆菌为EHA105。
[0016] 本发明进一步提供0SC0L16基因在水稻品种改良中的应用。
[0017] 本发明设及的OsCOLie基因的cDNA序列为：
[001引i)沈Q ID NO: 1所示的核巧酸序列；或
[0019] ii)SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核巧酸且 表达相同功能蛋白质的核巧酸序列;或
[0020] iii)在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核巧酸 序列，所述严格条件为在含0.1 % SDS的0.1 X SS阳或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下杂交，并用该溶液洗膜;或
[0021] iv)与i)、ii)或iii)的核巧酸序列具有90%W上同源性且表达相同功能蛋白质的 核巧酸序列。
[0022] 本发明还提供OsCOLie基因的等位基因，所述等位基因的CDS序列如SEQ ID NO. 3 所示。该等位基因来自水稻品种9311。
[0023] 本发明还提供上述等位基因在延迟水稻抽穗期中的应用。
[0024] 本发明通过在水稻中过表达OsCOLl6基因，导致明显的晚抽穗表型，该基因在短日 照和长日照条件下均抑制开花。在杭州自然长日照条件下，共得到18个Ti转基因家系，与转 基因阴性植株相比，转基因阳性植株晚抽穗19-20天左右，株高变高，单株产量也显著增加。 在海南自然短日照条件下，转基因阳性植株的表型与在杭州时一样，也表现为抽穗延迟，株 高变高，产量增加。通过节律表达模式分析发现，0sO)L16基因呈现明显的昼夜节律表达。组 织表达研究发现，0sO)L16基因主要在叶片和叶銷中表达，并且在幼嫩的叶片中表达量较 高，GUS染色分析也证实了运个结果。瞬时表达实验发现，0sO)L16-GFP融合蛋白定位在细胞 核中。转录自激活实验发现OsCOLl 6基因具有很强的转录自激活活性，并且自激活结构域位 于锋指结构域和CCT结构域之间。qRT-PCR实验发现OsCOLie基因位于水稻开花抑制因子 化d7的上游，通过促进化d7的表达从而抑制化dl的表达，最终抑制开花，该结果进一步丰富 了水稻光周期开花调控网络。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明实施例1中OsCOLie基因过表达植株的表型。其中，A-E表示自然长日 照条件下，0sO)L16过表达转基因阳性株（左边)和转基因阴性株(右边）的抽穗期表型(A)， 主茎(B)，剑叶(C)，主穗(D)，单株总巧粒化）。照片摄于转基因阳性株抽穗后1周。F为在自然 短日照和自然长日照条件下，0sO)L16过表达Ti植株的抽穗期。pi指双尾t检测的P值，P2指威 尔科克森符号秩检验的P值。实验中检测的植株数在柱中显示，平均值±3.6.111.。
[0026] 图2为本发明实施例2中OsCOLie基因的表达模式分析。其中，A，B表示在短日照和 长日照条件下，0sO)L16基因的节律表达模式。C表示长日照条件下80天时的野生型植株。D 为通过qRT-PCR的方法分析OsCOLie基因在各组织中的表达水平。L，叶片;LS，叶銷;ASA，茎 尖。E-J表示各组织中GUS染色结果。叶片化），叶銷(F)，穗(G)，茎化），茎横截面（I)，根(J)。 图A、B和D中，0sO)L16基因的转录水平是与水稻UBQ化biquitin)基因的比值。白色和黑色的 方框分别表示光期和暗期。平均值±3.(1.由两次生物学重复和=次技术重复获得。比例尺 IrniTi 〇
[0027]图3为本发明实施例3中OsCOLie蛋白定位于细胞核中并具有转录激活结构域。其 中，A-D为0SC0L16蛋白的亚细胞定位。（A)明场，（B)0sC0L16-GFP融合蛋白，（C)一个核标记 基因0sMADS3-mCher巧融合蛋白，（D)在(A)背景下融合了（B)和(C)的图片。比例尺10皿。巧） OsO)L16基因在酵母菌株AH109中的转录活性分析。左图显示了用于转录活性分析的各种构 图。抓，GAL4-DNA结合结构域;MCS，多克隆位点；ZF，锋指;MR(Middle region)，中间区域。空 载体pGBKT7用于阴性对照。0半乳糖活性（0-gal)使用chlo;rophenolred-0-D- galactopyranoside(CPRG;Roche BiochemicalS)作为反应底物。平均值±3.d.由S次独立 实验获得。
[00%]图4为本发明实施例4和5中在短日照(A，C，E，G，I和K)和长日照(B，D，F，H，J和L)条 件下，Hd3a，RFT1，OsMADS 14，OsMADS 15，Ehd 1 和化(17在OsCOL 16 的 0X- (+) W 及0X-(-)植株中 的节律表达模式。白色和黑色的方框分别表示光期和暗期。平均值±3.(1.由两次生物学重 复和S次技术重复获得。0X-( + )，0sC0L16的转基因阳性株;0X-(-)，0sC0L16的转基因阴性 株。
[0029] 图5为本发明实施例4和5中在短日照(4，(：，6,6，1，1(，1，0,9和5)和长日照(8,0，尸， H，J，L，N，P，R和T)条件下，册 1，化d2，Ehd3，mid4，DT册，0sC0L4，0sMADS50，0sMADS51，册 16和 Hd 17在OsCOL 16的OX-(+) W及OX-(-)植株中的节律表达模式。白色和黑色的方框分别表示 光期和暗期。平均值±3.(1.由两次生物学重复和S次技术重复获得。0X-( + )，0sC0L16的转 基因阳性株;0X-(-)，OsCOLl6的转基因阴性株。
[0030] 图6为本发明实施例4和5中在短日照和长日照条件下，通过qRT-PCR分析OsCOLie 在用CRISPR-Cas9技术得到的各种开花基因的突变体和野生型植株中的转录水平。包括 hd3a(A),;rftl(B),osmadsl4(C),osmadsl5(D),hdl(E),ehdl(F),ghd7(G),ehd3(H),ehd4 (I)，dth8(J)，oscol4化），osmad巧0(L)，osmads51(M)，hdl6(N)和野生型植株。平均值± s.d.由两次生物学重复和=次技术重复获得。
[0031] 图7为本发明实施例6中OsCOLie基因的自然变异和网络分析结果。A表示在水稻核 屯、种质中，0sO)L16基因编码区序列的核巧酸多态共分成22种单倍型。B为126个栽培稻和野 生稻中OsCOLie基因的单倍型分析。单倍型频率与圆圈的大小成正比，线上的数字代表两个 单倍型之间的进化距离。C表示来自80个水稻地方品种的单倍型化p_l，^p_15和化p_22在 杭州自然长日照条件下的抽穗期。pi化ap_l和化P_22之间）为双尾t检测的P值，P2为威尔科 克森符号秩检验的P值，平均值± S. e. m.。
【具体实施方式】
[0032] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratoiy Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0033] 实施例1过表达OsCOLie基因延迟抽穗
[0034] 1、过表达载体的构建
[0035] 为了得到水稻过表达OsCOLie基因的表型，本实施例中构建了一个过表达载体。具 体构建方法如下：种植野生型品种日本晴（英文名Nipponbare，已完成全基因组测序)至两 周苗左右，利用plant RNA mini kit(购自天根生物技术有限公司）提取RNA，然后反转录成 cDNA，利用引物2300-0sC0L16-XmaI-F(SEQ ID N0:4)和2300-0sC0L16-XmaI-R(SEQ ID NO: 5)进行PCR扩增得到OsCOLie的全长cDNA序列（SEQ ID N0:1)。然后通过同源重组的方法将 该片段重组至质粒pCAMBIA2300(购自加拿大化men化s公司）的Xma I位点。
[0036] 2、农杆菌介导的水稻遗传转化
[0037] 将得到的测序正确的重组质粒，通过农杆菌菌株EHA105(购自GAMBIA公司)介导的 水稻遗传转化体系，转入隐性基因型亲本NIUDTH2)的愈伤组织中。经过愈伤组织诱导，继 代，预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤组织、分化、生根、炼苗移载，得到转 基因植株。农杆菌介导的梗稻遗传转化体系主要应用化ei等人报道的方法化iei et al， (1996)Plant J 6:271-282)，并在此基础上稍作改进。
[0038] 3、转基因植株的检测和基因功能验证
[0039] 结果发现，在水稻过表达0SC0L16基因，导致明显的晚抽穗表型。在杭州自然长日 照条件下，共得到18个Ti转基因家系，利用引物2300-F(SEQ ID NO: 6)和0sC0L16-JC-R(SEQ ID NO: 7)进行PCR分子检测，与转基因阴性植株相比，转基因阳性植株晚抽穗19-20天左右， 株高变高，单株产量也显著增加（图1，表1)。在海南自然短日照条件下，转基因阳性植株的 表型与在杭州时一样，也表现为抽穗延迟，株高变高，产量增加(图1F，表1)。
[0040] 表1比较0SC0L16过表达转基因阳性和转基因阴性植株之间的各种农艺性状
[0041]
[0042]
[0043] 实施例20SC0L16基因的时空表达模式
[0044] 为了研究0SC0L16的节律表达模式，我们通过实时巧光定量PCR(qRT-PCR)的方法 研究了OsCOLie基因的表达水平，引物序列为qRT-0sC0L16-F(SEQ ID N0:8)和9削- 0sC0L16-R(SEQ ID NO: 9)。在光照培养箱短日照（10小时光照，14小时黑暗)和长日照（14小 时光照，10小时黑暗）条件下，48小时周期中，每4小时收集一次叶片。在短日照条件下， 0sO)L16的表达水平在光期后4小时开始增加，在暗期后10小时达到峰值，随后表达量迅速 降低并且在光期后又开始逐步增加（图2A)。相似地，在长日照条件下，0sO)L16的表达水平 在光期后即开始增加，在暗期后6小时达到峰值，随后表达量迅速降低并且在光期后又开始 逐步增加（图2B)。运些结果说明0SC0L16转录水平表现明显的节律表达。
[0045] 为了研究OsCOLie的空间表达模式，我们利用qRT-PCR检测了 OsCOLie在水稻中各 组织如叶片、叶銷、穗、茎、根和茎尖部位的表达水平（图2C)。利用引物qRT-0sC0L16-F和 qRT-0sC0L16-R。结果显示，OsO)L16的表达水平在各种叶片和叶銷中分别表现明显的梯度， 在幼嫩的叶片中表达量最高（图2D)。同时OsCOLie的表达水平也在穗和茎中检测到，但在根 和茎尖中几乎检测不到。同时我们构建了 P〇sO)L16::GUS载体来研究OsCOLie的组织表达模 式。载体构建方法如下：W日本晴基因组DNA作为模板，用引物0sC0L16-GUS-EcoRI-F(SEQ 10側：10)和03(：化16-61]5-化〇1-1?(569 10側：11)进行？〇?扩增得到03(：化16基因启动子序 列，然后用EcoR I和Nco I酶切载体PCAMBIA1305.1，切掉35S promoter,将OsCOLie基因启 动子序列重组至该位点，酶切位点不保留，然后用农杆菌侵染的方法转化水稻日本晴。组织 化学染色结果显示，GUS信号主要在叶片、叶銷、穗和茎中检测到，在根中未检测到，支持 qRT-PCR的结果（图沈-J)。
[0046] 实施例30SC0L16基因的亚细胞定位和转录自激活活性分析
[0047] l、0sC0L16基因的亚细胞定位
[004引根据水稻基因组注释计划数据库化ttp : //rice . plantbiology .msu . edu)， OsCOLie编码一个预测的CCT/B-box锋指转录因子。N端只有一个B-box结构域(21-58aa)，C 端有一个CCT结构域(391-433aa)。为了确定OsCOLie是否是一个转录因子并且具有核定位 功能，我们进行亚细胞定位实验来验证它的功能。本实施例中构建了一个亚细胞定位载体， 载体构建过程如下：用引物0sC0L16-GFP-BamHI-F(SEQ ID NO: 12)和0sC0L16-GFP-BamHI-R (SEQ ID N0:13)，W0sC0L16的全长cDNA，即沈Q ID N0:1所示序列为模板进行扩增，然后通 过同源重组的方法把该片段重组至pAN580的Bam HI(加拿大化rmentas公司）位点，最终形 成0SC0L16-GFP融合构建。瞬时表达实验显示0SC0L16-GFP融合蛋白定位在水稻叶片原生质 体的细胞核中（图3A-D)。
[0049] 2. OsCOLie的转录自激活活性分析
[0050] 为了进一步分析OsCOLie是否具有转录自激活活性，我们利用PGBKT7载体构建了 0sO)L16的全长和各种缺失构建。首先WOsCOLie的全长cDNA，即沈Q ID NO: 1所示序列为模 板，用引物(表2)扩增OsCOLieCDS和各种缺失片段，然后通过同源重组的方法把运些片段重 组至pG服T7(本实验室保存）的Eco RI (购自加拿大Fermentas公司）位点，并使各片段分别 与GAL4DNA结合结构域完全融合，最终构建如下5个载体:BD-OsCOLie，抓-0sO)L16- A ZF， BD-0sC0L16- A MR，BD-0sC0L16- A CCT和抓-OsCOLie- A ZF/CCT。空载体和所有5个载体都转 化入酵母菌株AH109中，随后分别在-T巧和-T巧/-化s/-Ade的SD培养基上培养。转录自激活 活性分析使用Clontech公司的Matchmaker GALATwo-Hybrid System 3进行。0-半乳糖活性 的测定根据Clontech的操作手册进行（略有修改），用液体培养的方法，使用chlorophenol red-0-D-galactopyranoside(CPRG;Roche Biochemicals)作为反应底物。结果显示， 0sO)L16具有很强的转录自激活活性，并且在4个缺失构建中，除了缺失锋指结构域和CCT结 构域之间区域的酵母菌株没有转录自激活活性，其余菌株均有较强的转录自激活活性（图 3E)。综上，运些结果说明OsCOLie是一个核转录因子并具有转录自激活活性，并且其转录激 活域位于中间区域(MR，Middle region)。
[0051 ]表2用于构建OsCOLie转录自激活载体的引物
[0化2]
[0化3] 实施例40sC0L16基因下调化dl来抑制开花
[0054] 0s(X)L16具有光周期响应和节律表达的特性说明该基因可能参与光周期开花调 控。为了研究0SC0L16在水稻光周期开花调控途径中的作用，我们分别在短日照和长日照条 件下，利用qRT-PCR的方法检测了参与水稻光周期途径的相关基因在0SC0L16过表达阳性 (0X-( + ))和阴性(0X-(-))植株中的表达，引物序列见表3。叶片分别选取自短日照处理40天 和长日照处理51天的水稻植株。
[0055] 我们首先检测了两个成花素基因 Hd3a和RFT1的表达，分别是水稻短日照和长日照 条件下的成花素基因 （Tsuji et al.(2011)Cu;rr Opin Plant Biol,14(1):45-52)。结果， 在48小时的周期中，与OX-(-)植株相比，Hd3a和RFTl的转录水平在0X-( + )植株中显著降低 (图4A-D)。有意思的是，在短日照条件下，Hd3a的表达水平明显比RFT1高，然而在长日照条 件下，RFT1的表达水平明显比Hd3a高，该结果与Hd3a是水稻短日照条件下主要的成花素而 RFT1是水稻长日照下主要的成花素相一致化omiya et al. (2009)Development, 136(20): 3443-3450)。随后我们检测了 OsMADSH和0sMADS15的转录水平，两个位于Hd3a和RFTl下游 的花分生组织决定基因 （Tsuji et al.(2011)Qi;r;r Opin Plant Biol,14(1):45-52)。结果 显示OsMADSH和0sMADS15的转录水平0X-( + )植株中较低（图4E-H)。另外，我们通过CRISPR- &s9技术设计出hd3a,rftl ,osmadsl4和osmadsl5突变体，结果发现在运些突变体和相应的 野生型植株中，0SC0L16的表达水平没有显著差异（图6A-D)。
[0056] 接着进一步研究0SC0L16下调成花素基因的表达是否通过Hdl或化dl介导，Hdl和 Hidl 是册 3a 和 RFT1 上游的开花整合基因 （Tsuji et al. (2011 )Cu;rr Opin Plant Biol, 14 (l):45-52)。结果显示，Hdl的表达水平在0X-( + )和OX-(-)植株中差异不显著（图5A，B)，然 而化dl的转录水平在0X-( + )植株中较低（图4IJ)。另外，在hdl和ehdl突变体和相应的野生 型植株中，0sO)L16的转录水平几乎一致（图6E，F)。运些结果表明0SC0L16抑制成花素基因 的表达来抑制开花，并且该结果是通过化dl介导的。
[0化7] 实施例50SC0L16基因位于化d7基因的上游
[005引为了进一步研究OsCOL16-Ehdl参与的光周期开花途径，我们研究化dl上游调控基 因的表达水平。Ghd7是一个主要的开花抑制因子(Xue et al.(2008)化t Genet，40(6): 761-767)，在短日照和长日照条件下，与0X-(-)植株相比，0X-( + )植株中化d7的表达水平显 著提高（图4K，L)。同时，OsCOLie的表达也不受化(17的影响（图6G)，表明OsCOLie位于化(17的 上游。而化dl上游调苄基因，比如mid2，Ehd3，mid4，DT册，0sC0L4，0sMADS50和0sMADS51，在 0X-( + )和OX-(-)植株中表现相似的表达水平（图5C-P)。相反地，运些化dl的调苄基因也不 影响OsCOLie的表达（图細-M)。运些结果表明OsCOLie抑制开花独立于化dl的运些上游调节 因子。
[0059] 接下来，我们研究OsCOLie是否影响化d7的上游调苄基因的表达，包括Hdl6(Ghd7 的正调控因子）和Hdl7(Ghd7的负调控因子）。结果显示，Hdl6和Hdl7的转录水平不受 OsO)L16的影响（图5Q-T)。相反地，运些化d7的调苄基因也不影响OsCOLie的表达（图6N)。综 上所述，qRT-PCR结果表明，OsO)L16抑制开花位于化d7的上游，然而OsCOLie的上游调控基 因还未找到。所用qRT-PCR引物序列见表3。
[0060] 表3qRT-PCR引物序列 rn〇Ai1
[0063] 实施例60sC0L16基因在水稻中的单倍型分析
[0064] 为了进一步了解0SC0L16基因的自然变异对栽培稻抽穗期变化的影响及其进化机 审IJ。又对该基因的编码区在126个样品（包括33个釉稻、48个梗稻和45个野生稻）中进行测 序，并将测序结果做序列比对，结果获得1463bp大小的序列（最长单倍型的序列大小为 1463bp)。用引物0sC0L16-seq-F(SEQ ID N0:14)和0sC0L16-seq-R(沈Q ID N0:15)进行扩 增。共发现42个变异位点，其中6个插入缺失，导致氨基酸变异的位点有18个，蛋白质编码移 码的插入缺失有2个，运些变异位点中有7个仅存在于野生稻中。全部36个SNP和6个插入缺 失共组成22个单倍型，其中18个单倍型是野生稻特有的，3个单倍型化1、H15和H22)是栽培 稻两个亚种和野生稻共有的，册只存在于一个釉稻品种中（图7A)。单倍型化（水稻品种日本 晴类型，其CDS序列见SEQ ID N0:2所示)存在于64个品种中，包括45个梗稻（占93.8%的梗 稻），6个釉稻（占18.2%的釉稻)和13个野生稻（占28.9%的野生稻）。单倍型H22(水稻品种 9311类型，其CDS序列如SEQ ID N0:3所示)存在于26个品种中，包括2个梗稻化4.2%的梗 稻），22个釉稻（占66.7%的釉稻），2个野生稻（占4.4%的野生稻）。单倍型化5存在于9个品 种中，包括1个梗稻化2.1%的梗稻），4个釉稻化12.1%的釉稻)和4个野生稻化8.9%的 野生稻）（图7B)。进一步对栽培稻中多于1个品种的单倍型植株抽穗期进行比较，发现单倍 型H1(主要存在于梗稻中）和肥2(主要存在于釉稻中）之间品种的抽穗期具有显著差异(P = 3.16X10-4)，在单倍型H1与H15(P = 0.82)及单倍型H22和H15(P = 0.97)之间没有显著差异 (图7C)。同时进一步对该基因进行亲缘地理学分析发现S个单倍型并不是姐妹单倍型，而 是从不同的野生稻单倍型中进化来的。同时，我们对栽培稻的两个亚种和野生稻群体的遗 传多样性和化jima'D进行计算，也没有发现多样性降低和明显的受选择信号。综合W上分 析认为该基因单倍型在栽培稻中的分布是由于瓶颈效应和遗传漂变导致的。
[0065] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.0SC0L16基因在控制水稻抽穗期中的应用，其特征在于，0SC0L16基因的cDNA序列为： i) SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核昔酸序列;或 iii) 在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序 列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 杂交，并用该溶液洗膜;或 iv) 与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷 酸序列。 2.0sC0L16基因在延迟水稻抽穗期中的应用，其中，0sC0L16基因的cDNA序列同权利要 求1所述。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在水稻中过表达0sC0L16基因。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将0sC0L16基因构建到载体pCAMBIA2300 上，用所得重组载体转化水稻，筛选阳性转基因水稻植株。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用农杆菌介导的遗传转化法转化水稻， 转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选阳性转基因水稻 植株。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所用农杆菌为EHA105。 7. OsCOL 16基因在水稻品种改良中的应用，其中，OsCOL 16基因的cDNA序列同权利要求1 所述。 8.0sC0L16基因的等位基因，其特征在于，所述等位基因的⑶S序列如SEQIDN0.3所 不。9.权利要求8所述的等位基因在延迟水稻抽穗期中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK106047893SQ201610578958
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月20日 公开号201610578958.8, CN 106047893 A, CN 106047893A, CN 201610578958, CN-A-106047893, CN106047893 A, CN106047893A, CN201610578958, CN201610578958.8
【发明人】曹立勇, 吴玮勋, 程式华, 郑晓明, 张迎信, 占小登, 沈希宏, 吴伟明, 陈代波, 于萍
【申请人】中国水稻研究所