一种青蒿bZIP类转录因子编码序列及克隆方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种青蒿AabZIP6基因编码序列的克隆及其应用。具体包括基因AabZIP6的克隆、含有该基因的植物表达载体的构建、该基因对青蒿素生物合成途径特有基因启动子的激活作用。上述青蒿AabZIP6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了AabZIP6基因具有能够激活青蒿素生物合成途径特异基因ADS和ALDH1表达的特性。本发明中AabZIP6基因可应用于青蒿品质改良，可提高青蒿中青蒿素的含量。
【专利说明】
-种青富bZ IP类转录因子编码序列及克隆方法与应用
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，具体设及一种青葛bZIP类转录因子编码序列 AabZIP6及其克隆方法与应用。
【背景技术】
[0002] 植物中新陈代谢分为初生代谢和次生代谢，初生代谢产物（如糖类、脂类和核酸） 存在于所有的植物中，是植物维持细胞生命活动所必需的，而植物次生代谢产物是指植物 中一大类非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其合成与分布具有种属、组织器官 和生产发育特异性。例如，治疗追疾的特效药物成分青葛素只在植物青葛（Artemisia annua L.)植株表面的分泌型腺毛中合成并储存。近年来，随着对中草药成分研究的逐步深 入，发现许多中草药的有效成分均为植物次生代谢产物，例如丹参中的丹参酬，长春花中的 长春生物碱等。
[0003] 大部分植物次生代谢产物其在天然植物中的含量极低，而使用化学合成的方法， 工艺流程复杂、成本太高，并且还有许多植物次生代谢产物的生物合成途径不清晰，无法实 现化学全合成。因此，研究人员开始探索其他的提高植物次生代谢产物含量的方法。考虑到 植物次生代谢产物合成途径复杂，参与反应的基因数量多，且受到发育，环境等多种因素的 影响，对途径上单个基因进行修饰有时难W奏效。而转录因子通常可W调控某个植物次生 代谢产物生物合成途径上的多个酶基因的表达，从而调控该次生代谢产物的生物合成量。
[0004] 目前，在青葛中已有报道发现，转录因子可W有效调控青葛素合成途径特有基因 的表达，从而调控青葛素的生物合成，例如AaORAl转录因子，AabZIPl转录因子，AaMYC2转录 因子等等。因此，克隆能调控青葛素生物合成途径特有基因表达的转录因子，对于改良并提 高青葛中青葛素的含量具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种青葛AabZIP6基因及获得其核巧酸序列的方法，还提 供了该基因的蛋白编码序列，并且提供了该基因生物学功能快速确定的方法。该基因编码 一个bZIP类转录因子，对其部分生物学功能进行了确定。将含有目的AabZIP6基因的农杆菌 和含有青葛素生物合成途径特异基因启动子的报告载体的农杆菌，通过烟草注射侵染瞬时 表达的方法，经双巧光素报告分析发现，该基因能够激活青葛素生物合成途径特异基因启 动子的表达，为青葛素代谢工程改良提供了有效的候选基因。
[0006] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0007] 本发明提供了一种青葛bZIP类转录因子编码序列，该编码序列记为AabZIP6， AabZIP6的核巧酸序列如沈Q ID N0.1所示。
[000引本发明还提供了一种青葛bZIP类转录因子编码序列，AabZIP6编码的氨基酸序列 如沈Q ID NO.2所示。
[0009]本发明还提供了一种多肤，该多肤的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体包含如SEQ ID NO. 1所示的 核巧酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。其构建方法包括 W下步骤：
[OOW 步骤1、根据SEQ ID N0.1序列设计扩增AabZIP6基因开放阅读框序列，扩增引物如 下：
[0012] 正向引物P3:5 ' -CACCATGTCGAGGCCACCTCGACTTCC-3 '
[0013] 反向引物P4:5' -GTTAATATGAAGCTTGCCCATGTC-3' ；
[0014] 步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接祀NTR-T0P0载体；
[0015] 步骤3、将连接入AabZIP6基因的祀NTR-T0P0载体与祀earlygatel04植物表达载体 通过LR反应的方式构建含有目的基因的祀earlygatel04-AabZIP6植物表达载体。
[0016] 本发明还提供了一种重组表达转化体，该重组表达转化体包含如SEQ ID NO. 1所 示的核巧酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017] 进一步地，上述重组表达转化体的宿主菌株为农杆菌。
[0018] 本发明还提供了上述青葛bZIP类转录因子编码序列AabZIP6在提高青葛素含量中 的应用。
[0019] 本发明还提供了上述青葛bZIP类转录因子编码序列AabZIP6的克隆方法，该克隆 方法包括W下步骤：
[0020] 步骤1、总RNA的提取与纯化，采用各种通用的植物总RNA提取试剂盒提取并纯化获 得青葛叶片总RNA;
[0021] 步骤2、用反转录酶将青葛叶片总RNA反转成cDNA;
[0022] 步骤3、W上述cDNA为模板，通过设计基因特异引物，采用PCR的方法扩增，获得PCR 产物，基因特异引物为：
[0023] 正向引物P1:5 ' -GTAGGAATTTGGTCAACTATGTCG-3 '
[0024] 反向引物P2:5 ' -GGGACGGATGGTATCTAAATGC-3 ' ；
[00巧]步骤4、PCR产物回收纯化测序，获得如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[00%]本发明还提供了一种快速检测AabZIP6编码的氨基酸序列的生物学功能的方法， 该方法包括W下步骤：
[0027] 步骤1、根据SEQ ID N0.1序列设计扩增AabZIP6基因开放阅读框序列，扩增引物如 下：
[0028] 正向引物P3:5 ' -CACCATGTCGAGGCCACCTCGACTTCC-3 '
[00巧]反向引物P4:5 ' -GTTAATATGAAGCTTGCCCATGTC-3 ' ；
[0030] 步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接祀NTR-T0P0载体；
[0031] 步骤3、将连接入AabZIP6基因的祀NTR-T0P0载体与祀earlygatel04植物表达载体 通过LR反应的方式构建含有目的基因的祀earlygatel04-AabZIP6植物表达载体；
[0032] 步骤4、将青葛中青葛素合成途径特有ADS基因的启动子ProADS连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双巧光素检测报告载体pGreenllOSOO-ProADS;
[0033 ]步骤5、将青葛中青葛素合成途径特有CYP71 AVI基因的启动子ProCYP? 1 AVI连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双巧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AVl;
[0034]步骤6、将青葛中青葛素合成途径特有DBR2基因的启动子ProDBR2连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双巧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2;
[003引步骤7、将青葛中青葛素合成途径特有ALDH1基因的启动子ProALDHl连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双巧光素检测报告载体pGreenllOSOO-ProALDHl;
[0036] 步骤8、将祀earlygatel04-AabZIP6植物表达载体和植物双巧光素检测报告载体 pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2和 pGreenllOSOO-ProALD化分别转化入农杆菌中，获得包含目的载体的农杆菌工程菌株；
[0037] 步骤9、将包含pEearlygatel04-AabZIP6植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含 植物双巧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合后，通过注射侵染的方式注射到生长5 周的烟草叶片中；
[0038] 步骤10、取注射后培养2天的烟草叶片，用液氮速冻后研磨成粉末；
[0039] 步骤11、采用Promega-Dual-Luciferase检测试剂盒检测巧光强度，确定AabZIPe 基因与青葛素合成途径特有基因启动子的激活作用。
[0040] 进一步地，上述步骤8中，宿主菌为农杆菌GV3101菌株；上述步骤9中，包含 祀earlygatel04-AabZIP6植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含植物双巧光素检测报告 载体的农杆菌工程菌株混合比例为按3:1浓度混合。
[0041] 在本发明中，克隆AabZIP6基因可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包 括质粒、粘粒等。在本发明中构建AabZIP6植物表达载体，也可选用本领域已知的各种载体， 如市售的pCAMBIA系列载体;在本发明中构建启动子双巧光素报告载体，也可选用本领域已 知的各种其他载体，如市售的Promega公司的载体;本发明中所设及的农杆菌为根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101，该菌株可W从市场上公开购买。
[0042] W下将结合附图对本发明作进一步说明，W充分说明本发明的目的、技术特征和 技术效果。
【附图说明】
[0043] 通过阅读参照W下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0044] 图1示出了在一个较优实施例中，烟草瞬时转化AabZIP6基因显著提高ADS和AL畑1 运2个基因启动子的表达活性。
【具体实施方式】
[0045] 下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在W本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克 隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[OOW 实施例1、实施例1青葛AabZIP6基因的克隆
[0047] 1、青葛在人工气候室培养，生长条件为光周期1她/化(光亮/黑暗），25°C;
[004引2、青葛叶片总RNA的提取。取100毫克左右幼嫩的青葛叶片组织材，置于液氮中充 分研磨至粉末状，按照植物总RNA提取试剂盒(天根生化，北京)说明书的方法，提取叶片总 RNA。将获得的植物总RNA取化L进行琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的质量，然后在化no化op (Thermo Fisher,美国）分光光度计上测定总RNA的浓度。
[0049] 3、基因的克隆。W提取的总RNA为模板（500ng)，按照反转录试剂盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(hKaRa，大连）说明书的方法，反转录生产第一链cDNA; 通过设计的特异引物，W cDNA为模板进行PCR扩增，特异引物序列如下：
[0050] 正向引物P1:5 ' -GTAGGAATTTGGTCAACTATGTCG-3 '
[0化 1 ]反向引物P2:5 ' -GGGACGGATGGTATCTAAATGC-3 '
[00对 PCR反应总体积为50化，反应体系为:5化10XK0D缓冲液，5化dNTPs，化L MgS04， 1化正向引物，1化反向引物，化L cDNA模板，化L K0D酶，d地20补齐至50化。
[0053] PCR 扩增条件，预变性 95°C3min，35 个循环：95°C，30sec;54°C，30sec;68°C， lOOsec，最后 68°C 延伸 5min。
[0054] 将PCR产物经回收纯化后，连接平末端载体化B(天根生化有限公司产品）并测序， 获得pLB-AabZIP6质粒载体。
[0055] 通过上述步骤，获得了青葛中AabZIP6基因的序列如SEQ ID N0.1所示，并推导出 其蛋白编码序列如SEQ ID NO.2所示。
[0化引 实施例2、包含AabZIP6基因的植物表达载体的构建 [0化7] 1、中间载体祀NTR-T0P0-AabZIP6的构建。
[0化引根据SEQ ID N0.1序列信息设计扩增AabZIP6基因开放阅读框序列，扩增引物如 下：
[0059] 正向引物P3:5 ' -CACCATGTCGAGGCCACCTCGACTTCC-3 '
[0060] 反向引物P4:5 ' -GTTAATATGAAGCTTGCCCATGTC-3 '
[0061 ] 祀NTR/D-T0P0载体购置于Invihogen公司，为该公司Gateway克隆技术的入口载 体，按照该产品说明书的要求，在正向引物ATG碱基前添加 CACC四个碱基。WpLB-AabZIP6质 粒为模板，用平末端高保真酶K0D进行PCR扩增，PCR产物回收纯化后通过Gateway克隆技术 的方法连接到祀NTR-T0P0载体，具体方法按照Invi化ogen公司祀NTR/D-T0P0克隆试剂盒说 明书进行。
[0062] 2、包含目的基因的植物表达载体构建。按照Invitrogen公司LR Clonase II 化巧me试剂盒将将中间载体祀NTR-T0P0-AabZIP6与祀earlygatel04植物表达载体进行LR 反应，反应体系按试剂盒说明书配制，放置于25°C金属浴反应3小时后转化大肠杆菌D册a感 受态，进行阳性克隆PCR验证，最终获得包含有目的基因的祀earlygatel04-AabZIP6植物表 达载体。
[00创实施例3.青葛素合成途径特异基因启动子双巧光素报告载体的构建
[0064] 1、PCR扩增青葛素合成途径特异基因的启动子。根据NCBI数据库中青葛ADS基因的 启动子(GenBank: DQ448297.1)序列信息，设计ADS基因启动子扩增特异引物，正反特异引物 分别含有Kpn I和Pst I酶切位点，引物序列如下：
[00化]ProADS F 5，-gg化ccACCGGGGACCTCTAGAGATC-3,，
[0066] ProADS R 5'-ctgcagGATTTTACAAACTTTGAA-3'。
[0067] 同样的，根据NCBI数据库中青葛CYP71AV1基因的启动子(GenBank:FJ870128.1)序 列信息，设计分别含有Kpn I和Pst I酶切位点的CYP71AV1启动子特异引物，引物序列如下：
[006引 ProCYP F 5'-ggtaccATGGGTCAATTTCGGGTTG-3'，
[0069] ProCYP R 日'-ctgcagTGCTTTTAGTATACTCTTC-3'；
[0070] 根据NCBI数据库中青葛DBR2基因的启动子(GenBank:KC118524.1)序列信息，设计 分别含有Kpn I和Pst I酶切位点的DBR2启动子特异引物，引物序列如下：
[0071] ProDBR2 F 5'-gg化ccAAGATGAGATAGGGAACTAAC-3'，
[0072] ProDBR2 R 5'-ctgcagTATTGAGTTTGATGTTGACC-3'；
[0073] 根据NCBI数据库中青葛ALDHl基因的启动子(GenBank:KC118522.1)序列信息，设 计分别含有Kpn I和Pst I酶切位点的ALD化启动子特异引物，引物序列如下：
[0074] ProALDHl F 5'-ggtaccATGAACCATTAGAAGGGAAGG-3'，
[0075] ProALDHl R 5'-ctgcagCTTTGTTTTTTATGAAA-3'；
[0076] W青葛基因组DM为模板，PCR扩增上述4个启动子片段，回收纯化。
[0077] 2.启动子PCR产物连接入双巧光素报告载体。将上述PCR产物用Kpn I和Pst I双酶 切，回收酶切片段，将4个酶切回收后的片段连入用Kpn I和Pst I双酶切后回收的 pGreenII0800-LUC载体片段，构建植物双巧光素检测报告载体pGreenllOSOO-ProADS、 pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2和pGreenllOSOO-ProALDHl。
[007引实施例4.烟草瞬时转化检测基因与启动子激活作用
[OOW] 1、农杆菌工程菌株的获得，将祀6曰1'17旨曰16104空载体、966曰1'17旨曰16104-4曰621口6 表达载体和4个启动子双巧光检测报告载体通过冻融法转化入根癌农杆菌GV3101菌株中， 获得包含有空载体的农杆菌工程菌株、包含有AabZIP6基因的农杆菌工程菌株和4个包含有 启动子的农杆菌工程菌株。
[0080] 2、农杆菌工程菌株的扩大培养与处理。将上述6个农杆菌工程菌株在包含50mg/L 利福平+20mg/L庆大霉素巧Omg/L卡那霉素 S种抗生素的LB培养液中扩大培养(5mL)，28°C， 220转/分钟，培养过夜。第二天测定菌液浓度，当农杆菌菌液浓度达到0D600值在20D~ 2.50D左右后停止培养。离屯、，收集农杆菌，然后用lOmM浓度MgCl2溶液重悬浮菌体，调整重 悬浮菌液0D值为0.6。向重悬浮菌液中添加乙酷下香酬，其浓度为200mM。将上述重悬浮农杆 菌菌液静置3小时。
[0081] 3、注射侵染法瞬时转化烟草。将上述静置处理后的包含有空载体的农杆菌工程菌 株与4个包含有启动子的农杆菌工程菌株分别按3:1浓度比例混合，作为对照组;将包含有 目的基因 AabZIP6表达载体的农杆菌工程菌株与4个包含有启动子的农杆菌工程菌株也分 别按3:1浓度比例混合，作为实验组。通过1ml的注射器，将混合后的农杆菌菌夜注射到生长 5周左右的烟草叶片中，黑暗培养1天然后转到光下培养。
[0082] 4、Dual-Luciferase检测。用直径为1.0cm的圆形打孔器，取注射后培养2天的烟草 叶片，用液氮速冻后研磨成粉末；采用Promega Dual-Luciferase检测试剂盒检测巧光强 度，按Promega公司说明书的方法操作。
[0083] 本发明中AabZIP6基因能够显著激活青葛素生物合成途径中ADS和AUm运2个重 要的结构基因启动子的表达，与对照组相比，AabZIP6能显著激活运ADS启动子的表达能力， 提高其活性至对照组的3.4倍左右;对ALD化启动子也有一定激活能力，提高至对照组的2.6 倍左右。而对CYP71AV1和DBR2的启动子无显著激活能力。通过本发明为进一步利用该基因 在青葛中过量表达进而提高青葛中青葛素的含量提供了有力的实验证据。
[0084] W上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可W根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可W得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种青蒿bZIP类转录因子编码序列，其特征在于，所述编码序列记为AabZIP6,所述 AabZIP6的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. -种青蒿bZIP类转录因子编码序列，其特征在于，所述AabZIP6编码的氨基酸序列如 SEQIDN0.2**。3. -种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。5. -种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列的开放阅读框序列，所述开放阅读框序列如SEQ ID NO.3所示。6. 根据权利要求1或2所述的青蒿bZIP类转录因子编码序列AabZIP6在提高青蒿素含量 中的应用。7. 根据权利要求1所述的青蒿bZIP类转录因子编码序列AabZIP6的克隆方法，其特征在 于，所述克隆方法包括以下步骤： 步骤1、总RNA的提取与纯化，采用各种通用的植物总RNA提取试剂盒提取并纯化获得青 蒿叶片总RNA; 步骤2、用反转录酶将所述青蒿叶片总RNA反转成cDNA; 步骤3、以所述cDNA为模板，通过设计基因特异引物，采用PCR的方法扩增，获得PCR产 物，所述基因特异引物为： 正向引物PI: 5 '-GTAGGAATTTGGTCAACTATGTCG-3 ' 反向引物P2:5 ' -GGGACGGATGGTATCTAAATGC-3; 步骤4、PCR产物回收纯化测序，获得如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。8. 根据权利要求4所述的重组表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以 下步骤： 步骤1、根据SEQ ID N0.1序列设计扩增AabZIP6基因开放阅读框序列，扩增引物如下： 正向引物P3:5 ' -CACCATGTCGAGGCCACCTCGACTTCC-3 ' 反向引物P4:5 ' -GTTAATATGAAGCTTGCCCATGTC-3 ' ； 步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接pENTR-TOPO载体； 步骤3、将连接入AabZIP6基因的pENTR-TOPO载体与pEearlygatel04植物表达载体通过 LR反应的方式构建含有目的基因的pEearlygate104-AabZIP6植物表达载体。9. 一种快速检测根据权利要求2所述的AabZIP6编码的氨基酸序列的生物学功能的方 法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 步骤1、根据SEQ ID N0.1序列设计扩增AabZIP6基因开放阅读框序列，扩增引物如下： 正向引物P3:5 ' -CACCATGTCGAGGCCACCTCGACTTCC-3 ' 反向引物P4:5 ' -GTTAATATGAAGCTTGCCCATGTC-3 ' ； 步骤2、将PCR扩增产物回收纯化后连接pENTR-TOPO载体； 步骤3、将连接入AabZIP6基因的pENTR-TOPO载体与pEearlygatel04植物表达载体通过 LR反应的方式构建含有目的基因的pEearlygate104-AabZIP6植物表达载体； 步骤4、将青蒿中青蒿素合成途径特有ADS基因的启动子ProADS连接入pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProADS; 步骤5、将青蒿中青蒿素合成途径特有CYP71AV1基因的启动子Pr〇CYP71AVl连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProCYP71AVl; 步骤6、将青蒿中青蒿素合成途径特有DBR2基因的启动子Pr〇DBR2连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProDBR2; 步骤7、将青蒿中青蒿素合成途径特有ALDH1基因的启动子ProALDHl连接入 pGreenII0800-LUC载体，构建植物双荧光素检测报告载体pGreenII0800-ProALDHl; 步骤8、将所述pEearlygate104-AabZIP6植物表达载体和所述植物双荧光素检测报告 载体 pGreenII0800-ProADS、pGreenII0800-ProCYP71AVl、pGreenII0800-ProDBR2 和 pGreenII0800-Pr〇ALDHl分别转化入农杆菌中，获得包含目的载体的农杆菌工程菌株； 步骤9、将包含所述pEearlygatel04-AabZIP6植物表达载体的农杆菌工程菌株和包含 所述植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合后，通过注射侵染的方式注射到生 长5周的烟草叶片中； 步骤10、取注射后培养2天的所述烟草叶片，用液氮速冻后研磨成粉末； 步骤11、采用Promega-Dual-Luciferase检测试剂盒检测焚光强度，确定AabZIP6基因 与青蒿素合成途径特有基因启动子的激活作用。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤8中，宿主菌为农杆菌GV3101菌 株;所述步骤9中，包含所述pEearlygatel04_AabZIP6植物表达载体的农杆菌工程菌株和包 含所述植物双荧光素检测报告载体的农杆菌工程菌株混合比例为按3:1浓度混合。
【文档编号】C12Q1/66GK106047895SQ201610680529
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月17日
【发明人】唐克轩, 沈乾, 马亚男, 吕宗友, 潘琪芳, 唐岳立
【申请人】上海交通大学