整合子In1287的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的整合子In1287，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子是在一种耐药肺炎克雷伯菌KP1262的基因组中发现的。因此本发明的上述整合子的发现一方面对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论和实践意义；另一方面为临床用药提供了一定的指导作用，有利于临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆发性流行。
【专利说明】
整合子I n1287
技术领域
[0001] 本发明属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，设及一种新发现的与肺炎克雷 伯菌耐药性密切相关的整合子Inl287。
【背景技术】
[0002] 肺炎克雷伯菌是一种常见的革兰阴性条件致病菌，为医院内感染的主要病原菌， 易感患者群广泛。在医院感染中，可通过患者间或经呼吸机、静脉通路及医护人员的途径传 播，克雷伯杆菌肺炎病情严重，死亡率极高。起病急，主要症状为寒战、高热，呼吸道症状为 咳嗽、咳疲、呼吸困难及胸痛。典型疲液为粘稠血性，黏液样或砖红色胶冻样或果酱样，无腥 臭，临床描述为无核小葡萄干性胶冻样疲，疲量多。发病早期即可出现毒血症表现、休克，应 警惕本病可能。
[0003] 细菌耐药机制-整合子（integron)系统得到研究者们的广泛注意，并取得了很大 的发展。整合子通过整合酶的作用，具有捕获外源基因并使之成为功能性基因表达的单位， 起源于基因的突变，导致细菌具有耐药及多重耐药特性，造成细菌多重耐药性的传播。在整 合子介导细菌的耐药机制中，一型整合子起着非常重要的作用。大部分的耐药基因水平传 播都是由I型整合子介导的。因此调查研究肺炎克雷伯菌、扩增I型整合子基因和检测I型整 合子分子流行病学情况对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分子机制具有重要的理论 和实践意义。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种含有耐药基因盒的整合子，将其命名为Inl287,其序列如SEQ ID NO. 1所示。该整合子含有catB3和aacA4基因盒。含有该整合子的菌株KP1262对多种抗生 素药物具有抗性。运些抗生素包括:氨基糖巧类抗生素、横胺类抗生素。
[0005] 常见的氨基糖巧类抗生索包括:链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、奈替米 星、阿米卡星。
[0006] 常见的横胺类抗生素包括：横胺异恶挫（SIZ)、横胺二甲喀晚（SM2)、横胺喀晚 (SD)、横胺甲恶挫（SMZ)、横胺间甲氧喀晚（SMM)、柳氮横化晚（SASP)、横胺米隆（SML)、横胺 喀晚银、横胺醋酷(SA)、W及复方新诺明（甲氧节晚+横胺甲恶挫）。
[0007] 本发明的整合子是通过W下方法获得的：
[000引（1)在台州市立医院神经外科病人疲液培养阳性的标本中分离出1株对妥布霉素 和阿米卡星耐药的细菌；
[0009] (2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法(补 充药敏纸片）进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为肺炎克雷伯菌，将其命名为 KP1262;同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著抗性;所述抗生素阿米卡星、妥布霉素、 下胺卡拉、庆大霉素和横胺甲恶挫；
[0010] (3)将KP1262菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒；
[0011] (4)将步骤(3)提取纯化后的质粒使用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段 长度约3，160bp的DNA片段，将该DNA片段W常规方法与PMD19-T载体连接，然后热激转化法 转入感受态细胞E. coli T0P10中，W蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序；
[0012] (5)利用ContigE邱ress Program软件进行序列拼接，分析其结构，鉴定出序列如 沈Q ID NO. 1所示的序列。
[0013] 进一步，步骤(4)的具体操作步骤如下步骤(3)获得的质粒为模板，利用表1中 的引物进行DNA片段扩增：
[0014] 表1引物序列
[0015]
[0016] 12345 将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收所有扩增出的片段，然后将该DNA片段 按(4)操作测序。 2 分析SEQ ID NO.1所示的序列，发现该序列与传统的整合子的结构不同，SEQ ID NO. 1中含有的基因盒位于整合子3'-CS序列的下游，而传统的基因盒位于整合子5'-CS和 3'-CS序列中间。为了证明SEQ ID NO. 1中的基因盒确实作为整合子的一部分随着整合子的 转移而转移，本发明利用细菌质粒转导实验来证明SEQ ID NO. 1是一个完整的整合子。具体 操作如下:将KP1262菌株与E.coli J53AzK(对叠氮化钢耐药)菌株共培养，通过含叠氮化钢 (300mg/L)和阿米卡星(0.06mg/L)平板筛选接合子，一方面提取接合子DNA，测序，验证SEQ ID NO. 1作为一个整体存在；另一方面将接合子做药敏试验，证明受体菌拥有供体菌的抗 性。其中，所用阿米卡星可用下列药物代替:链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、奈替米 星、复方新诺明、横胺甲恶挫。 3 本发明的整合子序列可W商业合成。 4 本发明的优点和有益效果： 5 (1)本发明首次发现了序列为SEQ ID N0.1的整合子Inl287,该整合子的核巧酸序 列在现有技术中未见报道。
[0022] (2)本发明整合子序列的发现，一方面对从基因水平上探讨细菌耐药性转移的分 子机制具有重要的理论和实践意义；另一方面为临床用药提供了一定的指导作用，有利于 临床上减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细 菌的爆发性流行。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明的整合子Inl287的结构示意图。
[0024] 具体的实施方式
[0025] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明， 并不意味着限制本发明的保护范围。
[0026] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人， 分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring 化rbor Laboratory Press, 1989)中所描 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[002引实施例1整合子Inl287的鉴定
[0029] UKP1262菌株的分离和鉴定
[0030] 1.1材料
[0031] 细菌药敏卡：法国bioMerieux的AST-GN13eAST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨节 西林、氨节西林/舒己坦、氨曲南、头抱挫嘟、头抱化朽、头抱替坦、头抱他定、头抱曲松、环丙 沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、左氧氣沙星、巧喃妥因、赃拉西林/他挫己坦、妥布霉 索、横胺甲恶挫。
[0032] 补充药敏纸片(药敏平板琼脂扩散实验）：纸片来源于英国化oid公司，有复方新诺 明（30iig)、奈替米星(3化邑）。
[0033] 1.2 方法
[0034] 仪器鉴定:将台州市立医院重症监护室病人脈液培养阳性的菌株转种到血平板上 分离培养（在35°C含5%C02解育箱中培养16-18h)，然后将分离的纯细菌按操作程序在 V口邸2上机作细菌鉴定与药敏试验。
[0035] 补充药敏试验:将0.5麦氏单位的菌液涂抹在MH平板上，按操作程序贴上复方新诺 明、奈替米星纸片，在35°C含5%C02解育箱中培养16-1化后，按化SI 2015标准鉴定药敏结 果。
[0036] 1.3 结果
[0037] 1.3.1仪器鉴定结果
[003引经VITEK 2微生物分析仪鉴定为肺炎克雷伯菌，鉴定概率为99%，将其命名为 KP12620
[0039] 1.3.2药敏实验结果
[0040] 药敏实验结果表明，KP1262菌株对于W下药物产生抗性:阿米卡星、妥布霉素、卡 拉霉素、庆大霉素、奈替米星、复方新诺明、横胺甲恶挫。
[0041] 2、整合子Inl287的获取和鉴定
[0042] 2.1 方法
[0043] 2.1.化P1262菌株的质粒提取
[0044] 采用化KaRa的质粒少量提取试剂盒，按照说明书操作步骤提取细菌质粒DNA，作为 PCR模板，-20°C冰箱保存备用。
[0045] 2.1.2整合子序列扩增
[0046] W上述提取的质粒为模板，利用表1中的引物进行DNA片段扩增。
[0047] 将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收所有扩增出的片段，W常规方法将扩增 片段分别与PMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E. col i T0P10中，W蓝白斑 实验挑选阳性转化子，测序。
[004引 2.1.3序列拼接
[0049] 将上述扩增出的DNA片段利用ContigExpress Program软件进行序列拼接，分析结 构，鉴定出序列如SEQ ID NO. 1所示的整合子，其结构示意图如图1所示。
[0050] 实施例2质粒转导实验研究整合子Inl287的功能
[0051] 1、方法
[0052] (1)供体菌为KP1262菌株，受体菌为E.coli J53AzK(对叠氮化钢耐药）。将供体菌、 受体菌分别接种于LB平板上，35°C过夜培养。挑取单个菌落分别接种于4mL的LB肉汤中，37 °C 22化/min摇菌培养至对数生长期。各取0.5血供、受体菌于4血的LB肉汤中，37 °C静止过夜 培养。接合子W膜大豆琼脂（TSA)平皿筛选，平板中含叠氮化钢（300mg/L)和阿米卡星 (0.06mg/L)。置35°C解育18-2地。提取耐药菌株的质粒(步骤同实施例1)为PCR扩增模板，使 用表1中的引物检测整合子基因序列是否存在。
[0053] (2)选取包含上述基因片段的阳性菌株进行药敏实验，步骤同实施例1。
[0054] 2、结果
[0055] 测序结果显示，接合子中含有完整的整合子Inl287序列，序列信息如SEQ ID N0.1;药敏实验结果显示，整合子Inl287序列表达阳性菌株的药敏反应同KP1262菌株相同。 上述实验结果表明整合子Inl287序列接合转移成功，且该整合子导致了接合细菌产生了对 下列药物的抗性:阿米卡星、妥布霉素、卡拉霉素、庆大霉素、奈替米星、复方新诺明、横胺甲 恶挫。
[0056] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种整合子，其特征在于，所述整合子序列如SEQ ID NO.1所示，所述整合子命名为 Inl287〇2. -种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒中包含权利要求1所述的整合子。3. 根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的制备过程中使用的载 体质粒为PMD19-T载体。4. 一种接合细菌，其特征在于，所述接合细菌中含有权利要求1所述的整合子;所述接 合细菌是由KP1262菌株与E.coliJ53 AzR菌株制备。5. -种重组细菌，其特征在于，所述重组细菌中含有权利要求1所述的整合子;所述重 组细菌是将权利要求2或3所述的重组质粒转入E.coli T0P10菌株中制备而成。6. 权利要求1所述的整合子的获取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 在台州市立医院神经外科病人痰液培养阳性的标本中分尚出1株对安布霉素和阿 米卡星耐药的细菌； (2) 然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法进行细 菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为肺炎克雷伯菌，将其命名为KP1262;同时，试验证实此 菌株对多种抗生素有显著抗性;所述抗生素阿米卡星、妥布霉素、卡拉霉素、庆大霉素、复方 新诺明和磺胺甲恶唑； (3) 将KP1262菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒； (4) 将步骤(3)提取纯化后的质粒使用BamM酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段长度 约3，160bp的DNA片段，将该DNA片段以常规方法与pMD 19-T载体连接，然后热激转化法转入 感受态细胞E. coli T0P10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序； (5) 利用ContigExpress Program软件进行序列拼接，分析其结构，鉴定出序列如SEQ ID NO. 1所示的序列。7. -种权利要求4所述的接合细菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作 步骤如下：将KP1262菌株与E.coli J53 AzR菌株共培养，通过含有叠氮化钠和KP1262菌株 耐受药物的平板筛选接合子。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述KP1262菌株耐受药物是阿米卡 星。9. 一种权利要求5所述的重组细菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体操作 步骤如下：将整合子Inl287克隆入pMD19-T载体中，然后将重组质粒转化入野生型E.coli T0P10中，通过含有阿米卡星的平板选阳性克隆。
【文档编号】C12N15/10GK106047900SQ201610329150
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】王冬国, 杨林军, 陈佳玉
【申请人】王冬国