结核杆菌16kD?CFP10?19kD融合蛋白构建及鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白16kD?CFP10?19kD，并将其应用于肺结核的临床诊断。选用结核分枝杆菌的三个强抗原表位，利用PCR方法，以H37RV为模板构建的一种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白，利用DNA?水凝胶无细胞体外蛋白表达系统表达融合蛋白，利用金属螯合亲和层析技术对得到的重组蛋白进行纯化，最后以其为抗原，利用斑点金免疫渗滤技术制备新型结核分枝杆菌血清学检测试剂盒。与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、敏感性高等优点，为结核病的筛查和诊断提供更可靠的工具，亦可用于制备蛋白芯片、疫苗、单抗和多抗等。
【专利说明】
结核杆菌16kD-CFP10-19kD融合蛋白构建及鉴定
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体的设及一种结核分枝杆菌=联重组融合蛋白的构 建、鉴定、表达纯化及其应用。
【背景技术】
[0002] 结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterituberculosis，TB)引起的慢性传染病， 严重危害人类健康。世界上约有1/3人口染上结核，每年新发病例约900多万，死亡人数达 200万，由此可见，全球结核病日益盛行，已经成为全球严重的公共卫生和社会问题。研究表 明，受结核菌感染的人群中，10 %的人会发展为结核病。如果不采取有效的控制措施，在未 来的10年，我国可能有近5000万的感染者发生结核病。早期发现并及时治疗是预防控制结 核病的重要工作，然而目前结核病的诊断仍然依赖于临床资料、细菌学检测和疲涂片镜检， 现有的诊断方法虽然是TB诊断的金标准，但是亦存在诸多不足，如涂片法阳性率低，且培养 时间较长，不适用于肺外结核、小儿结合的诊断，远不能满足临床需求。此外，由于肺结核早 期最常见的症状是咳嗽和咳疲，容易使患者和医生误W为是感冒或气管炎而导致误诊，从 而延误最佳治疗时机。由此可见，开发新的快速、简单、方便、敏感性高的结核病诊断工具是 日益增加的活动性肺结核的迫切需要。
[0003] 伴随TB诊断技术的快速发展，血清学检测W其简洁、快速、经济、准确、特异性强而 备受关注，可用于人群筛选。但由于结核分枝杆菌抗原多且复杂，在宿主体内表达的数量、 种类或时机可能随患者的个体免疫背景和病程而有区别，从而表现出不同的抗体谱，只用 单一抗原的结核病血清学诊断敏感性不够。因此，采用多种抗原联合检测的手段，在保证特 异性的基础上有助于改善灵敏度低的缺点。1化D抗原主要存在于结核杆菌的细胞膜上，有 研究表明，可W从85 %的肺结核患者血清中检测到16kD蛋白；CFP10的编码基因位于RD1区， 是重要的T细胞抗原，具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生特异性免疫应答，是结核病 诊断和预防的研究热点；1化D是结核杆菌细胞壁上的一种脂蛋白，其已经被证明是具有免 疫原性的的抗原，可W被TB患者血清中的抗体所识别，一直W来被广泛研究，Lyashchenko 等的研究表明，19kD作为抗原诊断结核病可W增加检测的灵敏度。
[0004] 目前国内外关于19kD融合蛋白的报道较少，因此本研究化D、CFP10、19kD在结 核病血清学检测方面的优势，利用基因工程技术构建了 16kD-CFP10-19kDS联融合蛋白，同 时结合斑点金免疫渗滤技术制备了血清学检测试剂盒，期望能为结核病感染的诊断提供更 为特异、准确的工具。
【发明内容】
[0005] ( - )要解决的技术问题 本发明目的是构建结核分枝杆菌16kD-CFP10-19kDS联重组融合蛋白，利用斑点金免 疫渗滤技术(DIGFA)生产特异性高、假阳性低的新型结核分枝杆菌血清学检测试剂盒，为结 核病提供一种可靠、方便、快速的临床诊断方法。
[0006] (二)技术方案 本发明根据NCBI数据库检索得到结核杆菌曲本V标准菌株16kD、CFPl〇W及38kD基因序 列，设计合成引物，经PCR、TA克隆后，酶切纯化3段基因片段，与祀T28a载体进行依次重组， 首先构建祀T28a-16kD重组质粒，鉴定成功基础上继续酶切与CFP10片段连接，鉴定成功后， 进一步酶切与19kD片段连接，酶切鉴定，最终获得pET-28a-16kD-CFP10-l化D重组表达载 体，测序鉴定16kD- CFP10-19kD重组融合序列重组成功。
[0007] 本发明应用DNA-水凝胶无细胞体外蛋白表达系统表达重组融合蛋白。首先合成X- DNA，应用心a /酶切对融合蛋白质粒进行线性化，同无核酸酶水、T4 DNA连接酶、T4 DNA连 接酶缓冲液等组成DNA凝胶反应混合液;然后基于磁力揽拌方式制备DNA凝胶微颗粒，并对 其进行纯化和鉴定;最后按照RTS 100 试剂盒制备商业化无细胞反应液，确定无细 胞反应的最佳解育时间、X-DNAW及基因模版的最适浓度。最终获得一种表达结核分枝杆菌 16kD-CFP10-19kDS联重组融合蛋白的DNA-水凝胶无细胞蛋白表达系统。
[000引本发明应用金属馨合亲和层析介质技术(metal chelate chromatogra地y)纯化 上述步骤中得到的重组融合蛋白，对纯化后的融合蛋白进行氨基酸序列测定，同时应用BCA 法测定融合蛋白浓度，应用化ISA法测定融合蛋白活性。最终获得纯度大于96 %的结核分枝 杆菌16kD-CFP10-19kDS联融合蛋白。
[0009] 本发明将上述获得的高纯度重组融合蛋白包被在硝酸纤维素膜上，用胶体金标记 葡萄球菌A蛋白（SPA)，然后组装渗滤装置，建立并优化斑点金免疫渗滤检测体系，最终获得 基于斑点金免疫渗滤技术的新型结核分枝杆菌血清学诊断试剂盒。临床血清样本检测实验 表明，该试剂盒的敏感性为95.2 %，假阳性为2.8 %。
[0010] (S)有效效益 采用本发明提供的结核分枝杆菌16kD-CFP10-19kD重组融合蛋白制备的诊断试剂盒， 与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，更好的满足了结核分枝杆菌 感染临床诊断的需要。
【附图说明】
[0011] 图1是表达载体祀T-16kD-CFP10-19kD的构建流程图。
[001 ^ 图2是表达载体pET-1化D-CFP10-19kD的酶切电泳图，A:单基因酶切点电泳图，1: Marker，2:l化0,3:〔。？10,4:1940;8:融合基因酶切电泳图，1:]\&1'1?5'，2:酶切前的重组质 粒，3:16kD，4:16kD+CFP 10，5:16kD+CFP 10+19kD。
[0013] 图3是X-DNA的4条寡核巧酸序列及检验电泳图，1:X1，2:X1巧2,3:X1巧化X3,4:X1+ X化X3巧4。
[0014] 图4是DNA-水凝胶蛋白表达系统表达蛋白的金属馨合层析亲和纯化凝胶电泳图， 1: Marker，2:纯化前，3:纯化后。
【具体实施方式】
[00巧]1.1基因融合 通过计算机分析TB H37RV基因组全序列，选择其强抗原表位16kD(GE肥BANK locus: NP_214765)、CFP10蛋白（GE肥BANK lo州s:NP_218391)和 19kD(GE肥BANK lo州s:CP007027) 的DM序列为模板，设计扩增引物为： 16kD扩增引物： 16-CFP10-19a：GGAAGGCATATGAACAATCTCGCATTGTGGTCGC 16-CFP10-19b：TTATTAGGATCCTCCGCCACCCTTCGTGATGGCGATG CFPIO扩增引物： 16-CFP10-19C：GGCCGCGGATCCATGGCAGAGATGAAGAC 16-CFP10-19d：CGGCGGGAATTCGAAGCCCATTTGCGA 19kD扩增引物： 16-CFP10-19e：AATAGAATTCGGAGGTGGCGGTAGTGTGAAGCGTGGACT GA 16-CFP10-19f：GTCCGGAAGCTTTTAGGAACAGGTCACCTCGATTTCG 50 ml 扩增体系：d 地 2〇 31.5 miaOXbuffer 5.0 ml，4XdNTP 4.0 ml,上、下游引物 混液4.0 ml，DNA 1.5 mljaqplus 0.2 ml(lU)。
[0016] 取结核分支杆菌出7Rv的菌体，加100 ml蛋白酶K(10 mg/ml)，置56 °C水浴消化4 h，用常规酪/氯仿法纯化，用上述引物进行PCR扩增。其中，1化D上游引物增加分沁1酶切位 点，下游增加 fe?况酶切位点；CFP10上游引物增加 fem况酶切位点，下游增加&?〇凡酶切位 点；19kD上游引物增加&?〇凡酶切位点，下游增加化'nc/ m酶切位点。
[0017] 将克隆片段进行修饰，产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后切割，将含DNA条带的胶块按 DNA快速纯化试剂盒(购自碧云天公司，产品名称:PCR/DNA纯化试剂盒)说明书进行操作，回 收 DNA。质粒 DNA 和 16kD、CFP10、19kD 片段均经内切酶切，50 ml 体系：10Xbuffer 5.0 ml, DNA 12 ml,化nc/虹和M/e I各15 U，d地2〇补至50 ml;37 °C水浴6 11。50 ml酶切产物经琼 脂糖凝胶电泳分离，切割DM条带琼脂块，利用DM快速纯化试剂盒回收DM。
[0018] 将16kD、CFP10和19kD基因片段依次克隆至祀T28a质粒(具有化'nc/虹和M/e I酶切 位点，购自大连宝生物工程有限公司），即首先构建祀T28a-1化D重组质粒，鉴定成功基础上 继续酶切与CFP10片段连接，鉴定成功后，进一步酶切与19kD片段连接，酶切鉴定。20 ml连 接体系：(1地2〇 15.0 miaOXbuffer 2.0 ml,祀 T28a 2.0 ml,基因片段 1.0 ml，T4 DNA 连 接酶20 U。质粒自身连接对照，20 ml连接反应体系：d地2〇 16.0 ml, 10 X buffer 2.0 ml, pET28a 2.0 ml，T4 DNA连接酶20 U。按上述加样后，混匀、稍离屯、，14 °C-16 °C连接过夜。 转化E.coli涂平板(含有15微克/毫升卡那霉素的LB固体培养基)并挑克隆提质粒测序，确 定序列正确的克隆。重组质粒的酶切(M/e 1/化'nc/虹）电泳图如附图2所示。
[0019] 1.2产物测序 采用T7 promoter:5-'TAATACGACTCACTATAGGG-3'和T7 terminator:5'- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3 '通用引物。所有扩增引物和测序引物的合成W及重组质粒序列 pET28a-16kD-CFP10-19kD的测定都由生工生物工程有限公司提供服务。测得目的融合基因 的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0020] 1.3目的蛋白的表达纯化 1.3.1 X-DNA的制备 X-DNA由四条末端反向互补的40 bp长的DNA分子经过一个特殊的退火程序形成。用于 合成X-DNA的寡核巧酸序列为： XI:5 '-p-CGACCGATGAATAGCGGTCAGATCCGTACCTACTCGGGCC-3, X2:5'-p-CGAGTAGGTACGGATCTGCGTATTGCGAACGACTCGGGCC-3' X3：5'-p-CGAGTCGTTCGCAATACGGCTGTACGTATGGTCTCGGGCC-3' X4：5'-p-CGAGACCATACGTACAGCACCGCTATTCATCGGTCGGGCC-3' 将根据序列合成的四条寡核巧酸分子等量混合(控制每条寡核巧酸分子的终浓度为 0.2 111]\0后置于口0?仪中。退火体系:95°(：变性2 111111，65°(：保持2 111111，60°(：保持5.5 111111， 之后每隔30 S将溫度调低1 °C，一直连续降至20 °CdX-DNA的核酸电泳图如附图3所示。
[0021] 1.3.2 DNA水凝胶微颗粒的制备 使用I酶将验证正确克隆的重组质粒(pET28a-16kD-CFP10-19kD)进行线性化，W 用于进行X-DNA的连接。
[0022] 将Span 80与Tween 80两种表面活性剂分别W4.5 %(wt/wt)W及0.5 %(wt/wt)的 比例添加到矿物油中，充分振荡混匀。冰浴后取出1 ml置于玻璃小杯，加入一颗3 mmX8 mm 规格的磁力揽拌子，并将转速控制为3000 rpm(最大转速）。稳定后迅速将冰浴上配制好的 10 iil DNA凝胶反应混合液Wl:100的体积比加入，继续揽拌1 min,使DNA凝胶反应液（水 相)均匀地分散在矿物油（油相）中，形成油包水乳液。油相中添加的表面活性剂能够有效地 防止分散在油相中的DNA凝胶反应液的小液滴重新聚合，起到了稳定乳液的作用。将分散均 匀的乳液放置于16 °C解育过夜，分散在油相中的小液滴发生交联反应，形成均匀的固体凝 胶微颗粒。
[0023] 10 DNA凝胶反应混合液体系:X-DNA stock solution 3.5山，线性质粒模板2 yl,Nuclease-free water 3 yl, 10 XT4 ligase buffer 1 yl ,T4 ligase(5 U/uDO.S y lo
[0024] 1.3.3 DM-水凝胶微颗粒的收集、纯化 取分散在油相中合成的DNA-水凝胶样品，W矿物油萃取残留的表面活性剂，W正己烧 溶解残余的矿物油。通风楓干燥15 min后，去离子水清洗，清除残留的正己烧。
[0025] 1.3.4使用DNA-水凝胶无细胞蛋白表达体系进行融合蛋白表达 使用商业化无细胞反应液试剂盒（购自Roche公司，产品名称：RTS 100反coJi肌 kit)进行融合蛋白的无细胞表达。将10 iil体积的DNA-水凝胶加入无细胞反应液中，反应体 系在Proteomaster中24 °C、900 rpm振荡。于无细胞反应的不同时间取合成的蛋白进行检 测，筛选最佳无细胞反应的最佳解育时间。
[0026] 1.3.5目的蛋白纯化 对收集的蛋白用Ni柱(GE公司）进行纯化，用如下溶液洗脱:300 mM咪挫，50 mM化is- 肥1，500 ml化CIdI化D、CFP10和19kD融合基因表达蛋白共428个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0027] 1.4融合蛋白鉴定 1.4.1纯度测定 经SDS-PAGE电泳检测（蛋白上样量为7.2 iig)，为单一区带，薄层扫描鉴定纯度为97.9 %，检测结果见附图4。
[002引1.4.2浓度测定 经BCA法测定，W牛血清白蛋白作为标准参比品，融合蛋白浓度为6.28 mg/ml。
[00巧]1.4.3活性测定 W纯化的融合蛋白为抗原包被于酶标板上，包被量2 yg/孔，使用确诊肺结核患者和健 康者的血清测定492 nm波长处0D值。结果如下：
J ^ ;三口 '1 乂刀'1 乂'11 心 b 丄 BU 吗 I 以W rj JiniL、?yiL AV、J3Z1 夕QZX-f》如已、t公 / M J i HU '巧/X?_ 1丄口。'|化 AC> 2.1试剂盒组成及制备 本发明试剂盒W纯化的结核分枝杆菌16kD-CFP10-19kD重组融合蛋白作为TB抗原，将 其包被到硝酸纤维素膜上，作为检测点，该抗原可捕获血清标本中的IgG结核抗体，被捕获 的结核抗体可W与葡萄球菌A蛋白（SPA)胶体金缀合物相结合呈现红色斑点。反应孔中间无 红色斑点，表示血清样品中结核抗体阴性，质控点应出现红色。
[0030] 试剂盒主要组成成分为免疫渗滤装置，主要由塑料小盒、吸水垫料和硝酸纤维素 膜片=部分组成，硝酸纤维素膜上包含检测区和质控区。
[0031] 2.1.1检测点包被重组融合蛋白1化D-CFP10-19kD，包被浓度不作稀释。
[0032] 2.1.2质控点包被羊抗鼠 IgG，包被浓度作1:16稀释。
[0033] 2.1.3免疫渗滤反应体系优化 (1)反应膜最佳干燥条件的确定 设置相对湿度梯度20 %、30 %、40 %，干燥时间30 min、40 min、50 min、60 min、70 min,干燥溫度为37 °C，采用阳性血清进行检测，确定最佳干燥湿度及干燥时间。
[00341 亲1后欣瞧午極条件说摇违胳结要
-:阴性反应，+:阳性反应，++:较强阳性反应，+++:强阳性反应 由表1可W看出：相对湿度为20 %条件下，短时间干燥会导致试剂的稳定性差，过长时 间干燥又会影响检测结果的准确性；而在相对湿度为30 %、40 %条件下，干燥时间为40 min、50 min、60 min和70 min时，试剂的敏感性和稳定性都较好，且检测结果比较接近。考 虑到实验过程的易操作性，因此选择将反应膜在相对湿度为30 %-40 %的条件下干燥60 min。
[0035] (2)最佳抗原包被浓度及最适羊抗鼠 IgG工作浓度的确定 将包被抗原稀释为1:1、1:2、1:4、1:8共四个浓度梯度，将羊抗鼠 IgG稀释为1:4、1:8、1: 16、1:32四个浓度梯度，将待测阳性参考血清稀释为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10共六个浓 度梯度，W包被抗原浓度、羊抗鼠 IgG浓度为变量，配合不稀释的金标记SPA分别对六个梯度 的待测阳性参考血清开展棋盘滴定实验，分析实验结果，确定最适抗原包被浓度及羊抗鼠 IgG浓度。
[0036] 表2最佳抗原包被浓度及羊抗鼠 IgG工作浓度选择实验结果 + :阳性，+/-:弱阳性，阴性
由表2确定抗原不作稀释进行包被，羊抗鼠 IgG作1:16稀释后作为工作浓度使用。
[0037] (3)最适金标SPA浓度确定 将金标SPA稀释为1:1、1:2、1:4、1:8、1:10五个浓度梯度，W其为变量，结合已确定的最 适抗原包被浓度和最佳羊抗鼠 IgG工作浓度，分别对六个梯度的待测阳性参考血清开展棋 盘滴定实验，分析实验结果，确定最适金标稀释度。
[0038] 表3最适金标SPA浓度选择实验结果
+:阳性，+/-:弱阳性，-:阴性 由表3可W看出：金标SPA不作稀释为最适工作浓度。
[0039] (4)反应膜最佳封闭方式的选择 将羊抗鼠 IgG点样于硝酸纤维素膜中央作为检测点，分四种不同方式进行封闭后开展 免疫渗滤试验，观察不同封闭方式对反应效果的影响。
[0040] ① W含1 % BSA的0.01 M TBST于室溫下置于圆周振荡摇床上封闭4 h; ② W含5%脱脂奶粉的0.01 M TBST于室溫下置于圆周振荡摇床上封闭4 h; ③ W含1 % BSA的0.01 M TBST于4 °C条件下过夜封闭； ④ W含5 %脱脂奶粉的0.01 M TBST于4 °C条件下过夜封闭； ⑤ W含 1 % BSA的0.01 M TBST于37 °C下封闭45 min; ⑥ W含5 %脱脂奶粉的0.01 M TBST于37 °C下封闭45 min。
[0041] 根据实验结果得出：6组检测点均显色且能够与背景有效区分，但相对于其它组 另IJ，④组中不仅背景低，且显色更加均匀。因此选择含5 %脱脂奶粉的0.01 M TBST作为封闭 液，封闭条件为4 °C下过夜封闭。
[0042] 2.1.4试剂盒的制造 (1)抗原的包被 取1 的抗原蛋白（不作稀释）点样于1X1 cm2大小的硝酸纤维素膜中屯、偏左位置作 为检测点，取1山的羊抗鼠 IgG(l: 16稀释)点样于硝酸纤维素膜中屯、偏右位置作为质控点， 30 %-40 %的条件下干燥60 min。
[0043] (2)封闭 将点样后的抗原膜浸于含有5 %脱脂奶粉的0.01 M TBST封闭液中，4 °C条件下静置过 夜封闭。
[0044] (3)洗膜 弃去封闭液，用超纯水快速洗膜一次，然后将膜浸于0.01 M TBS溶液中，转移到圆周摇 床上，120巧m震荡洗膜5 min,取出后自然惊干。
[0045] (4)组装渗滤装置 将吸水材料置于免疫渗滤卡中，最上层覆盖滤纸，将抗原膜转移到滤纸上，压紧渗滤卡 盖，使渗滤卡孔对准抗原膜中央，完成免疫渗滤装置的组装。成品试剂盒包括反应板、封闭 液、洗涂液、金标液、阳性对照和阴性对照。
[0046] 2.1.5操作方法及结果判定 (1)操作方法 ① 向检测板的反应孔中间加1滴封闭液，待薄膜吸入； ② 取10山血清样本，加入反应孔中间，待薄膜吸入； ③ 在反应孔中间加6滴洗涂液，待薄膜吸入； ④ 在反应孔中间加1滴金标液，待薄膜吸入； ⑤ 在反应孔中间加6滴洗涂液，待薄膜吸入，目测结果。
[0047] (2)结果判定 阳性-质控点显示红色，反应孔中间有红色斑点出现； 阴性-质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点出现或仅痕迹。
[004引2.2试剂盒性能评价 2.2.1血清样本检测 应用实验制备的试剂盒对临床参比血清样本进行检测(60份），根据实验结果判定此检 测系统是否可行。检测结果见表4。 r00491 車/1 GfUArfn谨说女齡；lilll蛙里
-:阴性反应，+:阳性反应，++:较强阳性反应，+++:强阳性反应。
[0050]从实验统计结果可W看出：阴性和阳性符合率均达100 %，因此我们认为采用运一 检测系统是可行的。
[0051 ] 2.2.2皿V、肥V等抗体阳性血清交叉反应检测 采用本发明试剂盒对皿V(乙型肝炎）、HCV(丙型肝炎）患者的血清进行检测，从而进一 步评价试剂盒的特异性，检测结果见表5。
[0化2] 表5皿V、HCV等抗阳性血清的巧叉反应检测结果
从检测结果可W看出，该试剂盒与上述患者血清均无交叉反应发生。
[0化3] 2.2.3同已经商品化的同类产品进行比较 取经商品化试剂盒检测的阳性及阴性血清样本30例，采用本试剂盒进行检测，统计检 测结果，计算试剂盒的灵敏度、特异度、假阳性率、假阴性率W及检测符合率等，实验结果见 下表6。
[nns4i 要fi-i 广林U注公化物I訊姑右版/入
才玄II合的hk标?lU才娃里 从表格可W看出，本发明试剂盒与参比品广州健仑生物科技有限公司试剂盒的检测符 合率为96.7 %。 去c_o b肯由片-/f如化右"K日/.V3：；击文||公故^以古：^;而1：；击4主田
从表格可W看出，本发明试剂盒与参比品上海奥普生物医药有限公司试剂盒的检测符 合率为97.4 %。
【主权项】
1. 一种编码结核分枝杆菌三联重组融合蛋白16kD-CFP10-19kD的融合基因，其特征在 于:它的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白16kD-CFP10-19kD，其特征在于：它是由权利 要求1中的融合基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。3. -种结核分枝杆菌三联重组融合蛋白的表达载体，其特征在于：它是将权利要求1 中的融合基因按照图1所示的构建方式连接到pET28a载体上，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示。4. 一种DNA-水凝胶无细胞蛋白表达系统，其特征在于：它是以由四条寡核苷酸序列退 火结合而成的X-DNA为骨架的水凝胶结构，其合成后验证结果如图3所示。5. -种结核分枝杆菌抗原斑点金免疫快速检测试剂盒，含有渗滤测定装置、点样膜、 标记物和洗脱液，其特征在于:所述的点样膜是点有结核分枝杆菌抗原（三联重组融合蛋 白）的硝酸纤维素膜;所述的标记物为胶体金标记葡萄球菌A蛋白结合物;所述的洗脱液为 pH 7.4的0.01 M TBS缓冲液;抗原和标记物之间采用血清中的连接抗体进行搭桥。6. 根据权利要求5所述的结核分枝杆菌抗原斑点金免疫快速检测试剂盒，其特征在 于:抗原包被浓度不作稀释，胶体金标记葡萄球菌Α蛋白工作浓度不作稀释，质控点羊抗鼠 IgG包被浓度作1:16稀释，反应膜的封闭条件为4 °C过夜封闭，反应膜的干燥条件为在相对 湿度为30 %_40 %的环境中干燥60 min。
【文档编号】C07K19/00GK106047909SQ201510788381
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年11月17日
【发明人】张新慧, 冯书阳, 吕静
【申请人】沈阳万类生物科技有限公司