生产5?氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用
【专利摘要】本发明公开了生产5?氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用，构建方法为：(1)在谷氨酸棒杆菌中敲除乳酸脱氢酶编码基因ldhA和乙酸生成基因pta?ackA、pqo和cat，得到的菌株命名为CB4；在CB4菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc前面插入强的sod启动子，得到菌株CB5；在CB5菌株中敲除基因pck，得到菌株CB6；(2)将质粒pXA和质粒pEP2tuf?rhtA转入到CB6菌株中。本发明构建的菌株在以10g/L葡萄糖为碳源的培养基中能够生产2.78g/L 5?氨基乙酰丙酸，这为后续发酵罐连续补料提高5?氨基乙酰丙酸的产量和产率奠定了基础。
【专利说明】
生产5-氨基乙醜丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用
技术领域
[0001] 本发明属生物工程技术与应用领域，具体地设及一种生产5-氨基乙酷丙酸的谷氨 酸棒杆菌菌株及构建及应用。
【背景技术】
[0002] 5-氨基乙酷丙酸，分子量为131.13,烙点为118°C。是一种非蛋白氨基酸。5-氨基乙 酷丙酸具有副作用小、渗透性好的的特点，已经被广泛的应用于皮肤癌、膀脫癌、消化道癌、 肺癌的诊断W及光动力治疗(PDT)中。同时，5-氨基乙酷丙酸在农业上也有很重要的应用如 作为植物生长调节剂、除草剂和绿色农药等。
[0003] 在自然界中，5-氨基乙酷丙酸生物合成主要有W下两条途径：即C4途径和巧途径。 C4途径是由班巧酷CoA和甘氨酸在5-氨基乙酷丙酸合酶作用下缩合生成5-氨基乙酷丙酸， 运条途径存在于动物、真菌和非硫光合细菌中。而巧途径则是在tRNA参与下，经过=步反应 催化生成5-氨基乙酷丙酸，该途径广泛存在于植物、藻类W及细菌中，包括大肠杆菌和谷氨 酸棒杆菌。
[0004] 目前，仅有少量关于谷氨酸棒杆菌利用巧途径生产5-氨基乙酷丙酸的报道，但是 该途径比较复杂，5-氨基乙酷丙酸的产量和得率都很低。
[0005] 据检索，现在尚未有关于谷氨酸棒杆菌利用C4途径生产5-氨基乙酷丙酸的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种生产5-氨基乙酷丙酸的谷氨酸棒 杆菌菌株的构建方法。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种生产5-氨基乙酷丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
[000引本发明的第S个目的是提供一种生产5-氨基乙酷丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的应 用。
[0009] 本发明的技术方案概述如下：
[0010] -种生产5-氨基乙酷丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
[OOW (1)在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032中敲除乳酸脱氨酶编码基因1化A 和乙酸生成基因 pta-ackA、pqo和cat,得到的菌株命名为CB4;在CB4菌株中的憐酸締醇式丙 酬酸簇化酶编码基因 PPC前面插入强的sod启动子，得到菌株CB5;在CB5菌株中敲除憐酸締 醇式丙酬酸簇激酶编码基因 pck，得到菌株CB6;
[0012] (2)将构建好的过表达5-氨基乙酷丙酸合酶基因的质粒pXA和过表达RhtA运输蛋 白的质粒祀P2tuf-rhtA转入到CB6菌株中，获得生产5-氨基乙酷丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株 AL2。
[0013] 上述方法构建的生产5-氨基乙酷丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2。
[0014] 上述生产5-氨基乙酷丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2发酵生产5-氨基乙酷丙酸的用 途。有益效果
[0015] 本发明构建了一株利用C4途径生产5-氨基乙酷丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株，该菌株 在WlOg/L葡萄糖为碳源的培养基中能够生产2.78g/L 5-氨基乙酷丙酸，运为后续发酵罐 连续补料提高5-氨基乙酷丙酸的产量和产率奠定了基础。
【附图说明】
[0016] 图1为基因操作祀点。
[0017] 图2A为质粒阴A的酶切验证图谱，图2B为质粒祀P2tuf-rhtA酶切验证图谱。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术 人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
[0019]本发明所用到的：
[0020] 原始菌株谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum)ATCC 13032购于ATCC(Ame;rican Type Culture Collection,http://www.atcc.org/)；
[0021] E . col i MG1655购于CGSC(Col i Genetic Stock Center，http :// cgsc.biology.yale.edu/)。
[0022] 原始质粒pK18mobsacB、pEC-XK9犯、pXMJ19和pEP2购买于BioVector NTCC公司 (http://www.biovector.net/)。
[0023] 5-氨基乙酷丙酸标准品从sigma公司化ttp : //www. sigmaaldrich. com/sigma- al化ich)购买。所用限制性内切酶、去憐酸化酶、DM连接酶等分子生物学试剂从化ermo公 司购买化ttp://www. thermoscientif icbio. com/fe;rmen1:as)，所用其他生化试剂从生工生 物工程(上海)股份有限公司购买化ttp://www. sangon.com/)。
[0024] 实施例1:敲除质粒pD-sacB的构建
[00巧]首先W化ndin切割后的地ISmobsacB线性片段作为模板，用如下引物sacB-l(SEQ ID N0.1)/sacB-2(SEQ ID側.2)扩增3日。8基因。将3日。8基因片段经过]?11111/6(3〇1?￥双酶切后 与经过EcoRI/Small双酶切后的质粒祀C-XK9犯进行连接，得到质粒PEC-XK9犯-sacB。用如 下的引物化csacB-1(沈Q ID N0.3)/trcsacB-2(SEQ ID N0.4)，W祀C-XK9犯-sacB质粒作 为模板扩增含有trc启动子的trcsacB片段。
[00%]用如下的引物pD-l(SEQ ID N0.5)/pD-2(SEQ ID N0.6)，W地ISmobsacB质粒作为 模板扩增含有卡那霉素抗性和大肠杆菌复制子的pD片段，最后将经过Aatll酶切的片段 trcsacB和经过相同酶切的pD片段进行连接，得到质粒pD-sacB。
[0027]实施例2:乳酸脱氨酶编码基因 IdhA的敲除和乙酸生成途径基因 pta-ackA、pqo和 cat的敲除
[002引乳酸脱氨酶编码基因1化A的敲除：
[0029] W谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum)ATCC 13032基因组为模板，Wldh-1(SEQ ID NO.7)/1化-2(沈Q ID NO.8)为引物扩增基因1化A的上游片段，1化-3(SEQ ID NO.9)/1化-4 (SEQ ID NO.10)为引物扩增基因 IdhA的下游片段。将两个片段切胶回收后，W等摩尔比例 的片段为模板，Wldh-l/ldh-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用 EcoRI/Hindlll双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB连接，得到质粒pD-1化A。
[0030] 将pD-1化A质粒转入到谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032中，用卡那霉素 筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子接种于5mL册IS液体培养基中，30°C，220巧m过夜 培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点 无抗的BHIS固体平板和含有25yg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而 卡那霉素平板不生长的菌落接种到5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物1化-1/ 1化-4进行PCR验证，得到1化A基因敲除菌株CB1。
[0031 ] p1:a-ackA操纵子的敲除
[0032] WC.glutamicum ATCC13032基因组为模板，WackA-l(SEQ ID N0.11)/ackA-2 (沈9 10^.12)为引物扩增操纵子91日-日。1^\的上游片段，日。1^\-3(569 10^.13)/日。1^\-4 (SEQ ID ^.14)为引物扩增操纵子口*曰-曰〇1^\的下游片段。将两个片段切胶回收后，^等摩 尔比例的片段为模板，WackA-l/ackA-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后 的片段用Sall/Xbal双酶切与经过同样双酶切后的pD-sacB质粒连接，得到pta-ackA操纵子 敲除质粒pD-pta。
[0033] 将pD-p化质粒转入到菌株CB1中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转 化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30°C，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在 BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25iig/mL 卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到 5血BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物ackA-1 /ackA-4进行PCR验证，得到Pta-ackA 操纵子敲除菌株CB2。
[0034] pqo基因的敲除
[0035] WC.glutamicum ATCC13032基因组为模板，Wpqo-1 (沈Q ID N0.15)/pq〇-2(沈Q 10^}.16)为引物扩增口9〇基因的上游片段，口9〇-3(569 10^.17)/口9〇-4(569 10^.18) 为引物扩增pqo的下游片段。将两个片段切胶回收后，W等摩尔比例的片段为模板，Wpqo- l/pqo-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用Xbal/PstI双酶切与经 过同样双酶切后的pD-sacB连接，得到pqo基因的敲除质粒pD-pqo。
[0036] 将pD-pqo质粒转入到菌株CB2中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转 化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30°C，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在 BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25iig/mL 卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到 5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物pqo-l/pqo-4进行PCR验证，得到pqo基因的 敲除菌株CB3。
[0037] cat基因的敲除
[0038] WC.glutamicum ATCC13032基因组为模板，Wcat-1 (沈Q ID N0.19)/cat-2(沈Q 10^.20)为引物扩增。曰1基因的上游片段，。曰1-3(569 10^.21)八曰1-4(569 10^.22) 为引物扩增cat的下游片段。将两个片段切胶回收后，W等摩尔比例的片段为模板，Wcat- l/cat-4为引物，扩增得到两个片段的融合产物。将融合后的片段用Xbal/Sall双酶切与经 过同样双酶切后的pD-sacB连接，得到cat基因的敲除质粒pD-cat。
[0039] 将pD-cat质粒转入到菌株CB3中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转 化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30°C，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在 BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25iig/mL 卡那霉素的BHIS固体平板。选择在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到 5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物cat-l/cat-4进行PCR验证，得到cat基因的 敲除菌株CB4。
[0040]其中BHIS培养基成分为(g/L):牛脑屯、浸粉37，山梨醇91。
[0041 ] BHIS固体培养基成分为(g/L):牛脑屯、浸粉37，山梨醇91，琼脂2% (W/V)
[0042] BHIS-Sucrose固体培养基(g/L):牛脑屯、浸粉37,山梨醇91，琼脂2%(W/V)，薦
[0043] 糖 10%(W/V)。
[0044] 实施例3:在ppc基因前面插入强的sod启动子和憐酸締醇式丙酬酸簇激酶编码基 因 pck基因的敲除
[0045] ppc基因前面插入强的sod启动子
[0046] WC.glutamicum ATCC13032基因组为模板，W卵C-1 (沈Q ID N0.23)/wc-2(WQ 10^.24)为引物扩增基因口口。的上游片段。3〇(1-1(569 10^.25)/3〇(1-2(569 10^.26) 用于扩增3〇(1基因的启动子。卵。-3(569 10顯.27)/99。-4(560 10^.28)用于扩增卵。基 因的下游片段，分别将3个片段切胶回收后，W等摩尔比例的片段为模板，用ppc-l/ppc-4为 引物，扩增得到S个片段的融合产物。将融合后的片段用Xbal/Hindlll双酶切后与经过同 样双酶切后的质粒载体pD-sacB连接。得到质粒pD-ppc。
[0047] 将构建好的质粒利用电转转入到菌株CB4中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克 隆，挑出的转化子接种于5mL BHIS液体培养基中，30°C，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定 的倍数涂布在BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和 含有25yg/mL卡那霉素的BHIS固体平板。将在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌 落接种到5mL BHIS液体培养基中，提取基因组，送测序，得到在ppc基因前面插入sod启动子 的菌株CB5。
[004引 pck基因的敲除
[0049] WC.glutami州m ATCC 13032基因组为模板，用如下引物进行PCR扩增。pck-l(SEQ 10^.29)/口。4-2(569 10^.30)用于扩增基因口。4的上游片段。口。4-3(569 10顯.31)/ pck-4(SEQ ID ^.32)用于扩增基因9〇4的下游片段。将上游片段经过6(3〇1?1作6曰1双酶切后 与经过相同双酶切后的曲-sacB质粒连接，得到质粒pD-pck(F)，将构建的质粒pD-pck(F)经 过Pstl/Hindlll双酶切后与经过Pstl/Hindlll双酶切的下游片段进行连接，得到pD-pck质 粒。
[0050] 将该质粒转入到菌株CB5中，用卡那霉素筛选重组成功的阳性克隆，挑出的转化子 接种于5mL BHIS液体培养基中，30°C，220rpm过夜培养，将菌液稀释一定的倍数涂布在 BHIS-Sucrose固体平板上。将平板上长出的菌落对点无抗的BHIS固体平板和含有25iig/mL 卡那霉素的BHIS固体平板。将在无抗平板上生长而卡那霉素平板不生长的菌落接种到 5血BHIS液体培养基中，提取基因组，使用引物pck-l/pck-4进行PCR验证，得到基因的敲 除菌株CB6。
[0化1 ] 实施例4:质粒阴A和祀P2tuf-rhtA的构建
[0052] pXA质粒的构建
[0053] 将类球红细菌(I^iodobacter sphaeroides)的5-氨基乙酷丙酸合酶基因 hemA根据 谷氨酸棒杆菌的密码子偏好性进行密码子优化，将优化后的基因用全基因合成的方法进行 合成（如569 10^.39所示），利用引物1161114-1(569 10腸.33)/1161114-2(569 10^.34)扩 增优化后的hemA片段，将得到的hemA片段经过Pstl/Xbal双酶切后与经过相同双酶切后的 穿梭质粒PXMJ19连接，得至IjpXA质粒，图2A为质粒pXA的酶切验证图谱。
[0化4] WC.glutamic皿 ATCC 13032基因组为模板，用Uif-1(SEQ ID NO.35)/tuf-2(SEQ ID ^.36)为引物扩增*证启动子，将化'片段用6(：〇1?1/5曰11酶切后与经过相同酶切的祀口2 质粒连接，得到带有tuf启动子的低拷贝质粒pEP2tuf"WE.coli MG1655基因组为模板，用 rhtA-l(SEQ ID N0.37)/rhtA-2(SEQ ID ^}.38)为引物扩增'的4片段，将片段用乂6曰1/ BamHI双酶切后与经过相同酶切的祀P2tuf质粒进行连接，得到祀P2tuf-rhtA质粒，图2B为质 粒祀P2tuf-rhtA酶切验证图谱。
[005引将构建好的pXA质粒导入到菌株CB6中，利用氯霉素进行筛选，得到带有pXA质粒的 菌株AL1。将构建好的祀P2tuf-rhtA质粒利用电转导入到AL1中，利用氯霉素和卡那霉素进行 筛选，得到最终的5-氨基乙酷丙酸生产菌株AL2。
[0056] 本发明设及的基因操作见图1，图1中"X"表示敲除，下划线表示过表达。
[0057] 表1菌株构建所用引物序列
[0化引
[0化9]
[0060]实施例5:利用构建的菌株进行5-氨基乙酷丙酸的摇瓶发酵 [0061 ]将构建好的菌株AL2在摇瓶中进行发酵。
[0062] 具体发酵方式如下
[0063] 接种方式为:首先在BHIS固体平板上活化菌株，在30°C培养至菌落可视时，挑单菌 落接种至装有5mL终浓度为25yg/mL的硫酸卡那霉素和终浓度为lOyg/mL的氯霉素的BHIS液 体培养基中培养15h后，转接到Ml培养基中，在培养至对数中后期时，将种子接种到M2培养 基中。培养基中添加终浓度为〇.5mM的异丙基硫代-0-D-半乳糖巧作为诱导剂。发酵结束后 检测生成5-ALA的产量为2.78g/L。
[0064] Ml培养基成分为(g/L):葡萄糖10,酵母抽提物10,膜蛋白腺10，NaCl 2.5。
[00化]M2培养基成分为(g/L):葡萄糖10,酵母抽提物10,膜蛋白腺10,化C1 2.5,3-(N-吗 嘟)丙横酸21，甘氨酸7.5。
【主权项】
1. 一种生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步 骤： (1) 在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)ATCC 13032中敲除乳酸脱氢酶编码基因 ldhA和乙 酸生成基因 pta_ackA、pqo和cat，得到的菌株命名为CB4;在CB4菌株中的磷酸稀醇式丙酮酸 羧化酶编码基因 ppc前面插入强的sod启动子，得到菌株CB5;在CB5菌株中敲除磷酸烯醇式 丙酮酸羧激酶编码基因 pck，得到菌株CB6; (2) 将构建好的过表达5-氨基乙酰丙酸合酶基因的质粒pXA和过表达RhtA运输蛋白的 质粒pEP2tuf-rhtA转入到CB6菌株中，获得生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2。2. 权利要求1所述的方法构建的生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2。3. 权利要求2的生产5-氨基乙酰丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株AL2的用途。
【文档编号】C12N15/77GK106047916SQ201610408674
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】王智文, 冯丽丽, 陈涛, 赵学明
【申请人】天津大学