一种过表达tmem88基因质粒、构建方法及其应用

一种过表达tmem88基因质粒、构建方法及其应用
【专利摘要】本发明公开一种过表达TMEM88基因质粒，包括TMEM88基因CDS序列与pEGFP?C2真核表达载体的重组构建而成；其核苷酸如序列表SEQ ID NO:3，位于TMEM88基因的第10?489位；氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。本发明还公开一种过表达TMEM88基因的构建方法及其应用。本发明具有能够显著抑制人肝癌细胞的增殖，并显著促进人肝癌细胞的凋亡的优点。
【专利说明】
-种过表达TMEM88基因质粒、构建方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一种过表达TMEM88基因质粒、构建方法 及其应用。 技术背景
[0002] 肝癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，主要包括原发性和继发性两大类，其中最 常见的是原发性肝癌(PHC)，其发病于肝内胆管上皮细胞或肝实质细胞，具有恶性程度高、 发病率和死亡率高等特点，流行病调查数据显示，PHC位居肿瘤发病率的第5位，死亡率更是 高达第3位，仅次于胃癌和肺癌，给人类的健康和发展带来了巨大的威胁。而且PHC的发病存 在一定的地域性，好发于亚洲和非洲，在我国东南沿海地区，每年被确诊为PHC的患者就高 达30余万人次，在世界新发病例中约占55 %，且近年来还有逐年递增的趋势，因此我国面临 着非常严峻的PHC形势，寻找有效的治疗PHC的手段和药物显得尤为重要。
[0003] 基因工程，又称为基因重组技术，是二十世纪屯十年代发展起来的在体外对DNA进 行操作的一口技术，广泛用于疾病基础研究、基因治疗、基因免疫、基因疫苗等。其=要素分 别为:酶、目的基因、载体。而真核表达载体是基因工程中用于构建真核基因表达系统的一 种载体，近几十年来，各国学者围绕真核表达载体进行了各种疾病、基因等相关研究，在基 因工程方面做了大量工作，为医学科学研究开辟了崭新途径。
[0004] TMEM88是TMEM88蛋白家族亚家族的成员，其基因定位于染色体17pl3.1，Lee等人 证实了在抓赡属胚胎细胞中定位在细胞膜上，是一个两次跨膜蛋白，TMEM88由159个氨基酸 残基组成，其分子量大约为17KD，在159氨基酸中第43-63氨基酸残基组成了第一个跨膜结 构域，而第88-108氨基酸残基组成了第二个跨膜结构域。IWL的PDZ结构域大约有100个氨基 酸，包含6个beta-strands和2个a-helices组成，而和TMEM88的V-W-V序列结合的IWL的PDZ 结构域的序列定位在be1:a-s1:rands和a-helices之间，TMEM88可W通过其C端的V-W-V序列 与DVL1的PDZ结构域结合，通过切断D化与化rizle和LRP5/6的结合而抑制经典的Wnt/b- catenin通路，从而发挥其生物学作用。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种过表达TMEM88基因质粒、构建方法及其应用。并证明所 述重组质粒为TMEM88功能研究提供了良好的实验工具，也为研究人肝癌中TMEM88基因的功 能提供有效实验方法。
[0006] 人源TMEM88基因已在GenBank注册，注册号NM_203411.1，定位于17pl3.1，全长 887bp，其中CDS序列48化P，编码159个氨基酸。人源TMEM88基因的组织表达谱分析显示：该 基因在人的许多肿瘤中均有表达。
[0007]本发明通过下列技术方案解决上述技术问题的：一种过表达TMEM88基因质粒，包 括TMEM88基因 CDS序列与PEGFP-C2真核表达载体的重组构建而成；其核巧酸如序列表SEQ ID N0:3,位于TMEM88基因的第10-489位;氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
[000引一种构建上述过表达TMEM88基因的方法，包括如下步骤：
[0009] (n收集、裂解细胞，提取RNA进行逆转录得到TMEM88CDNA;
[0010] (2)采用PCR技术，扩增出人工TMEM88基因的CDS序列片段；
[0011] (3) TMEM88基因的CDS序列片段的纯化；
[001^ (4)对所获得的基因片段和祀GFP-C2真核表达载体进行Kpn巧蛇coRI双酶切，并进 行连接；
[0013] (5)将连接产物转化至大肠杆菌TG1中，并挑去阳性克隆进行培养，然后抽提质粒。
[0014] 优选地，提取RNA后，进行变性;具体的工艺步骤:将RNA在65°C中放置5-lOmin后， 转移至冰水中放置。
[00巧]优选地，逆转录的反应体系包括：5XRT Master Mix、RNA、Nuclease-free Water; 具体的工艺步骤包括：
[0016] (1)配制反应体系：5XRT Master Mix 化L+RNA 化L+Nuclease-free Water 化1^;
[0017] (2)将上述反应体系放置37°C，并作用15min;
[0018] (3)将上述反应体系转移至50°C，并作用5min;
[0019] (4)将上述反应体系转移至98°C，并作用5min;
[0020] (5)将上述反应体系转移至4°C，冷却后冻存，即得到cDNA。
[0021] 优选地，根据TMEM88的CDS序列，设计上、下游引物;上、下引物序列分别如下：
[0022] TMEM88-F:5 '-CCGGAATTCCGGATGGCGGATGTCCCCG-3 '
[0023] TMEM88-R:5'-GGGGTACCCCTTAGACCCAGACCTTTCCT-3'。
[0024] 优选地，PCR的反应体系如下：2XPrimeSTAR Max、cDNA样品、上下游引物、高纯水； [00巧]具体的工艺步骤包括：
[0026] (1)配制反应体系：2XPrimeSTAR Max 2^iL+cDNA化L+引物各化L+高纯水22化；
[0027] (2)将上述反应体系混匀后放入PCR仪器，设置如下程序运行：
[0028；
[0029] (3)将上述PCR产物进行1-1.2%琼脂糖凝胶电泳；
[0030] (4)回收目的DNA片段。
[0031] 优选地，对TMEM88的PCR产物和祀GFP-C2载体进行EcoR巧日Kpnl的双酶切；酶切体 系如下：限制性内切酶巧coRI和KpnI)、10XBufferl'ango、TMEM88的PCR产物、祀GFP-C2载 体;具体的工艺步骤包括：
[0032] a)配制反应体系：10XBufferTango2化巧coRI和KpnI各0.扣L+TMEM88的PCR产 物或和祀GFP-C2载体化L
[0033] (2)将上述反应体系放置37°C水浴锅中，并作用4~化；
[0034] (3)进行1 -1.2 %琼脂糖凝胶电泳；
[0035] (4)观察结果并回收目的DNA片段。
[0036] 优选地，在连接之前，对载体进行去憐酸化处理；
[0037] 去憐酸化体系（1化L):CIAP化1、10 X CIAP缓冲液化1、载体祉1
[003引连接体系（10化）：CIAP去憐酸化后的载体0 .化1、10 X T4DNA连接酶缓冲液化1、 T4DNA连接酶化1、PCR酶切纯化产物7.化1;
[0039] 连接方法:将上述反应体系置于0.5ml的离屯、管中混匀，16°C水浴过夜。
[0040] 优选地，
[0041 ] (1)取出储存于-80°C的TG1感受态细胞，冰浴解冻后加入lOiil连接产物，混匀，冰 上静置30min;
[0042] (2)42°C热休克90s，取出置冰上3min;
[0043] (3)加入50化118培养液，37°(：、250巧111振荡培养45111111;
[0044] (4)取出lOOiil转化液涂于带有相应抗性的LB固体培养基上，37°C倒置培养8~ 1化。
[0045] -种使用上述过表达TMEM88基因质粒在抑制人肝癌细胞的增殖、促进人肝癌细胞 的调亡的应用。
[0046] 将所述重组质粒转染入人肝癌细胞系中，能够显著抑制人肝癌细胞的增殖，并显 著促进人肝癌细胞的调亡。因此，本发明有助于研究TMEM88基因功能，并且为研究其在人肝 癌中发病的作用提供了有用分子生物学工具。本发明运用基因重组技术，针对TMEM88基因， 构建重组真核表达载体祀GFP-C2-TMEM88,并将其转染至肝癌细胞株中，研究TMEM88过表达 对肝癌细胞增殖和调亡的影响，为进一步研究TMEM88的功能，W及肝癌的基因治疗奠定了 基础。
【附图说明】
[0047] 图1为本发明真核表达载体祀GFP-C2的结构示意图。
[004引图2为本发明真核重组载体祀GFP-C2-TMEM88的结构示意图。
[0049]图3为本发明真核重组载体祀GFP-C2-TMEM88的酶切鉴定图谱。
[(K)加 ]图4为本发明真核重组载体祀GFP-C2-TMEM88的测序图谱。
[0化1] 图5为本发明真核重组载体祀GFP-C2-TMEM88在HEK 293T细胞中的表达情况图
[0052] 图6为本发明未转染组的调亡细胞数值的影响情况图
[0053] 图7为本发明真核重组载体祀GFP-C2-TMEM88对肝癌细胞系调亡的影响情况图
【具体实施方式】
[0054] 下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件 的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件、实验室手册中的条件、按照制造厂商所建议 的条件。实施例1
[0化5] 构建过表达TMEM88基因质粒
[0化6] l、TMEM88cDNA 的提取
[0057] (1)取出细胞培养皿弃净培养基，用1ml的PBS缓冲液清洗细胞面(2-3次）。
[005引（2)加入1ml的化izol裂解细胞lOmin，用移液器轻轻混匀细胞后将细胞裂解液转 移至离屯、管中，颠倒混匀后室溫静置5min。
[0059] (3)加入化i201的1/5量的S氯甲烧(4°C预冷），剧烈混匀后室溫静置5min，高速低 溫离屯、15min(4°C，12000;r/min)。
[0060] (4)将0.4ml上层液体转移至新的离屯、管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后静 置 60min(-20°C)，高速低溫离屯、15min(4°C，12000r/min)后弃上清。
[0061 ] (5)加入lml75%的乙醇溶液后振荡混匀，高速低溫离屯、5min(4°C，12000r/min)后 弃上清，并干燥5min。
[0062] (6)加入20iiL无酶水溶解沉淀后，用于逆转录，也可冻存于-80度。
[0063] (7)RNA 的变性
[0064] 将抽提好的RNA进行变性，变性步骤如下:将RNA在65°C中放置5min后，迅速转移至 冰水中放置2min。
[00化]带掉寿后欣化累（10山,）々n下，
[0066]
[0067] 工艺步骤包括：
[0068] (1)将上述反应体系放置37°C，并作用15min;
[0069] (2)将上述反应体系转移至50°C，并作用5min;
[0070] (3)将上述反应体系转移至98°C，并作用5min;
[0071] (4)将上述反应体系转移至4°C，冷却后冻存，即得到cDNA。
[0072] 2、TMEM88基因的克隆
[0073] 根据TMEM88的CDS序列，设计上下游引物，引物序列如下：
[0074] TMEM88-F: 5 ' -CCGGAATTCCGGATGGCGGATGTCCCCG-3 '（含EcoRI酶切位点）
[0075] TMEM88-R: 5 ' -GGGGTACCCCTTAGACCCAGACCTTTCCT-3 '（含Kpnl酶切位点）
[0076] PCR过程中所用的酶优选为化kara公司的PrimeSTAR Max高保真酶，其反应体系和 反应程序如下：
[0077] 反巧体系（50山.）：
[007引
[0079] 将上述反应体系混匀后放入PCR仪器，设置如下程序运行：
[0080] 反应温度 反应时间
[0081；
[0082] (3)将上述PCR产物进行1-1.2%琼脂糖凝胶电泳；
[0083] (4)观察结果并回收目的DNA片段。
[0084] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过与DNA Marker的对比，结果发现在500bp出 得到一条带，大小与TMEM88目的片段(包括酶切位点）的大小基本一致，表明成功扩增出人 TMEM88基因的CDS序列。
[0085] 3、TMEM88目的片段的纯化
[0086] 纯化所用的试剂盒优选为爱思进公司的胶回收试剂盒，纯化步骤如下：
[0087] (1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用滤纸吸尽凝胶表面液体并切 碎。计算凝胶重量，每lOOmg等于10化1体积。
[008引（2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C加热(低烙点琼脂糖凝胶 于40°C加热），间断混合(每2~3min)，直至凝胶块完全烙化。
[0089] (3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于 400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。
[0090] (4)吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离屯、管）中，12，00化pm离屯、 Imin。弃滤液。
[0091] (5)将制备管置回2ml离屯、管，加500iil Buffer Wl，12,000巧m离屯、30s，弃滤液。
[0092] (6)将制备管置回2ml离屯、管，加700iil Buffer W2，12,000rpm离屯、30s，弃滤液。W 同样的方法再用7〇化1 Buffer W2洗涂一次12,000巧m离屯、Imin。
[0093] (7)将制备管置回2ml离屯、管中，12,000巧m离屯、Imin。
[0094] (8)将制备管置于洁净的1.5ml离屯、管中，在制备膜中央加25~30iil Eluent或去 离子水，室溫静置Imin。12000巧m离屯、Imin洗脱DM。
[00M] 4、PCR产物和真核表达载体的双酶切
[0096] 对TMEM88的PCR产物和祀GFP-C2载体进行EcoR I和Kpnl的双酶切，酶切体系和方 法如下：
[0097] 酶切体系（10化）：
[0098；
[0099] 酶切方法:将W上反应体系置于0.5ml的离屯、管中混匀，37°C水浴4~化(溫度和时 间的选择依据内切酶的说明书而定）。1.2%琼脂糖凝胶电泳后迅速观察结果并回收目的 DNA片段(回收方法同2.2.3.3)，避免紫外长期照射。
[0100] 5、酶切产物的连接
[0101] 对TMEM88和祀GFP-C2的双酶切产物进行连接，连接所用的酶优选为T4连接酶。在 连接之前，为避免载体的自身环化，故对载体进行去憐酸化处理。
[0102] 去憐酸化体系（1化L):CIAP化1、10XCIAP缓冲液化1、载体祉1
[0103] 连接体系（10化）：CIAP去憐酸化后的载体0 .化1、10 X T4DNA连接酶缓冲液化1、 T4DNA连接酶化1、PCR酶切纯化产物7.化1;
[0104] 连接方法:将上述反应体系置于0.5ml的离屯、管中混匀，16°C水浴过夜。
[01化]6、连接产物的转化
[0106] 转化所用的大肠杆菌感受态为:TG1，转化步骤如下：
[0107] (1)取出储存于-80°C的TG1感受态细胞，冰浴解冻后加入lOiil连接产物，轻轻混 匀，冰上静置30min。
[0108] (2)42°C热休克90s(不要摇晃），迅速取出置冰上3min。
[0109] (3)加入50化118培养液，37°(：、250巧111振荡培养45111111。
[0110] (4)取出约10化1转化液涂于带有相应抗性的LB固体培养基上，37°C倒置培养8~ 1化。
[017、质粒的小量抽提
[0112] 挑去8个阳性克隆加入含有2mlLB培养基(氨节抗性）的离屯、管中，37°C、250rpm振 荡培养8~12h，然后对菌液进行质粒抽提，所用的试剂盒为爱思进公司的质粒小量抽提试 剂盒，抽提步骤如下：
[0113] (1)用灭菌牙签挑取细菌的单克隆，放入盛2~3ml含有相应抗生素的LB培养液的 15ml离屯、管中，37°C、250巧m振荡培养8~12h。
[0114] (2)将约1ml菌液转入1.5ml离屯、管中，4°C、12,000巧m离屯、Imin，上清。
[0115] (3)加250iil Buffer S1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。
[0116] (4)加250iil Buffer S2,溫和并充分地上下翻转4~6次使菌体充分裂解，直至形 成透亮的溶液。
[0117] (5)加350iU Buffer S3,溫和并充分地上下翻转混合6~8次，12,000rpm离屯、 10min〇
[0118] (6)吸取步骤5中的离屯、上清并转移到制备管（置于2ml离屯、管中），120(K)rpm离屯、 Imin，弃滤液。
[0119] (7)将制备管置回离屯、管，加500iU Buffer Wl，12,000巧m离屯、Imin，弃滤液。
[0120] (8)将制备管置回离屯、管，加700iil Buffer W2，12,000巧m离屯、Imin，弃滤液；W同 样的方法再用70化1 Buffer W2洗涂一次。弃滤液。
[0121] (9)将制备管置回2ml离屯、管中，12,000巧m离屯、Imin。
[0122] (10)将制备管移入新的1.5ml离屯、管中，在制备管膜中央加60~80iil无菌水，室溫 静置Imin，12,000巧111离屯、1111；[]1，弃制备管。
[0123] (11)样品置-20°C备用。图2为真核重组载体祀GFP-C2-TMEM88的结构示意图。
[0124] 8、对质粒进行酶切鉴定和送测序对抽提好的质粒进行EcoR I和Kpnl的双酶切鉴 定，酶切体系和方法如下：
[0125] 酶切体系（10化）：
[012d
[0127] 酶切方法:将上述反应体系置于0.5ml的离屯、管中混匀，37 °C酶切4-化后，琼脂糖 凝胶电泳、紫外分光仪观察、凝胶成像仪拍照保存。并将酶切鉴定正确的质粒送生工生物公 司测序，见图3。其中1: PEGFP-C2双酶切;2: PEGFP-C2-TMEM88双酶切、3: TMEM88的PCR产物。
[0128] 测序结果见图4,测序结果表明，测序图谱由红、黑、绿和蓝色测序峰组成，代表不 同的碱基序列，本实验的测序结果显示四色巧光的信号较强，且较为单一，将测序结果通过 BLAST比对，发现与GencBank中公布的序列一致，目的基因片段长度实为480bp。
[0129] 实施例2:过表达TMEM88基因质粒的表达
[0130] 1、细胞培养
[0131] 本发明所需培养的细胞为:皿K 293T、HepG2，SMMC-7402，SMMC-7721，SGC-7901 细 胞，首先复苏细胞，并用含有体积比为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基于37°C、5%C02的细 胞培养箱中进行培养，并及时换液和传代。
[0132] (1)细胞复苏:将液氮内冻存的细胞取出，迅速浸入37°C的溫水中并轻轻摇晃至完 全融化(复溫时间应控制在两分钟W内），迅速转移细胞悬液至离屯、管中并加入5ml培养基， 低速离屯、（100化/min，2min)后弃尽上清，加入5ml培养基轻轻悬浮细胞后接种至培养皿中 开始培养。
[0133] (2)细胞换液:轻轻弃去旧的细胞培养基，PBS溫和清洗后加入新鲜的完全培养基 (含有10%胎牛血清的高糖DMEM)继续培养(注:PBS和新鲜的培养基需要37°C预热）。
[0134] (3)细胞传代:在细胞中加入1ml的膜酶后置于培养箱中进行消化，在显微镜下观 察细胞形态变化，及时加入完全培养基终止消化，转移细胞悬液至离屯、管中低速离屯、 (100化/min，2min)后弃上清，用PBS洗涂一次后加入0.2ml培养基悬浮细胞并重新接种至培 养皿中继续培养。
[0135] (4)细胞冻存:将传代过程中的细胞悬液低速离屯、（100化/min，2min)后弃上清，加 入1ml细胞冻存液(配方见)轻轻悬浮细胞后分装至细胞冻存管中进行分级冻存，即4°C0.5- 化、-20 °C 1 -化、-80 °C约2地、液氮冻存。
[0136] 2、质粒瞬时转染(脂质体法）
[0137] (1)用25化L的化ti-MEM稀释扣1的脂质体和总量约为化g的DNA，溫和混匀，室溫静 置5min。
[0138] (2)将（1)中的两种溶液溫和混匀，室溫静置20min，W形成DM-脂质体复合物。
[0139] (3)弃去培养皿中的培养液，加入1ml Opti-MEM转染液，将(2)中的DNA-脂质体复 合物缓慢滴加到培养皿中，轻轻摇晃培养皿混匀。
[0140] (4)37°C、5%C02培养化后，用预溫的PBS清洗一次，换新鲜的完全培养液后继续培 养约2地。
[0141] 3、免疫印记
[0142] (1)总蛋白提取:离屯、收集细胞，用PBS清洗2-3次后，加入0.5ml细胞裂解液，冰上 裂解lOmin，然后高速冷冻离屯、lOmin，收集0.4ml上清液，加入上样缓冲液，沸水浴5min，放 置冰上待电泳。
[0143] (2)安装制胶板并检漏，首先配制分离胶(配方见，分离胶浓度的选择根据所观察 蛋白量的大小），用1ml异丙醇压线，待充分凝固后(约化），配制浓缩胶，插入所需梳子，待充 分凝固后使用。
[0144] (3)安装电泳系统，在电泳槽中加入500ml电泳缓冲液，将10化样品加入上样孔后 开始电泳(80V电泳0.化+100V电泳1.化）。
[0145] (4)电泳结束后，切下SDS-PAGE胶，应用S明治方式（从下往上依次是滤纸+胶+ PVD刊莫+滤纸)进行湿转
[0146] (5)安装电转系统，在电转槽中加入500ml预冷的电转缓冲液(配方见），并将整个 电转槽放入冰水中，开始电转(100V电转化或200mA电转化）
[0147] (6)电转结束后，轻轻取下PVD刊莫，用丽春红染色鉴定转膜是否成功，转膜成功后， 用TBST洗去丽春红，室溫封闭至少化。
[014引（7)封闭完之后，用TBST洗膜(3次，5min)后，加入一抗溶液(一抗:GFP抗体，兔抗， Western-抗稀释液1:500稀释)4°C解育过夜。
[0149] (8)次日，用TBST洗膜(3次，lOmin)后，加入二抗溶液(二抗:辣根酶标记的山羊抗 兔二抗TBST溶液1:5000稀释)室溫解育1 -化。然后用TBST洗膜(3次，20min)。
[0150] (9)用E化发光剂检巧UPVDF上的条带，并用X射线胶片暗室显影。
[0151] 实验结果显示，真核重组表达载体祀GFP-C2-TMEM88在真核细胞内能够正常表达， 为后续的研究奠定了基础，见图5。其中1:未转染的293T细胞裂解液;2:表示转染祀GFP-C2- TMEM88的293T细胞裂解液。
[0152] 实施例3:过表达TMEM88基因后对人肝癌细胞化pG2，SMMC-7402，
[0153] SMMC-7721，SGC-7901 增殖情况的影响
[0154] 将对数生长期的细胞进行传代，得到细胞悬液，并W适当密度(约IX 108 ? 1/1)将 细胞W每孔10化L的量重新接种到96孔板中，培养约2地，待到细胞密度为80%左右，进行 祀GFP-C2-TMEM88的瞬时转染，转染一段时间后在每孔中加入20化适当浓度巧mg ? mL-i)的 MTT，继续培养4h。弃去每孔中的培养基，并加入15化L的DMS0,室溫振荡溶解lOmin后，在 492nm波长处测吸光度(A值），用各组吸光值的均值表示细胞的增殖情况。
[01巧]MTT实验显示：与未转染组相比，转染了PEGFP-C2-TMEM88的肝癌细胞系化epG2, SMMC-7402，SMMC-7721，SGC-7901)出现了明显的增殖现象(P<0.05)，说明过表达TMEM88基 因能够明显抑制人肝癌细胞的增殖，见表1。
[0156]表1过表达TMEM88基因后对人肝癌细胞增殖情况的影响
[0157]
[015引实施例4:过表达TMEM88基因对人肝癌细胞株SMMC-7721调亡的影响
[0159] 将对数生长期的细胞进行传代，得到细胞悬液，并W适当密度(约IX 108 ? 1/1)将 细胞接种至化孔板中，培养约2地，待到细胞密度为80%左右，进行pEGFP-C2-TMEM88的瞬时 转染，转染一段时间后收集细胞悬液。低速离屯、5min，收集细胞，弃去培养基，并用PBS缓冲 液清洗细胞2-3次。用400ul Binding Buffer重新悬浮细胞，加入加1 Annexin V染液，轻轻 混匀后放置4°C避光条件下解育15min。加入1 Oul PI，轻轻混匀后放置4 °C避光条件下解育 5min，上流式细胞仪检测细胞调亡，实验重复3次。
[0160] 流式细胞术结果显示：与未转染组的调亡细胞数值相比，转染了祀GFP-C2-TMEM88 组的调亡细胞数值均有明显升高，且差异存在统计学意义(P<〇. 05)。说明过表达TMEM88基 因能够明显从促进人肝癌细胞的调亡，见图6-7。
[0161] W上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能W此限定本发明实施的范围，即依 本发明申请专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明专利涵盖的范 围内。
【主权项】
1. 一种过表达TMEM88基因质粒，其特征在于:包括TMEM88基因⑶S序列与pEGFP-C2真核 表达载体的重组构建而成；其核苷酸如序列表SEQ ID N0:3,位于TMEM88基因的第10-489 位;氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。2. -种构建如权利要求1所述的过表达TMEM88基因的方法，其特征在于，包括如下步 骤： (1) 收集、裂解细胞，提取RNA进行逆转录得到TMEM88cDNA; (2) 采用PCR技术，扩增出人工TMEM88基因的⑶S序列片段； (3) TMEM88基因的⑶S序列片段的纯化； (4) 对所获得的基因片段和pEGFP-C2真核表达载体进行Kpnl和EcoRI双酶切，并进行连 接； (5) 将连接产物转化至大肠杆菌TG1中，并挑去阳性克隆进行培养，然后抽提质粒。3. 根据权利要求2所述的一种过表达TMEM88基因的构建方法，其特征在于，提取RNA后， 进行变性;具体的工艺步骤:将RNA在65 °C中放置5-1 Omin后，转移至冰水中放置。4. 根据权利要求2所述的一种过表达TMEM88基因的构建方法，其特征在于，逆转录的反 应体系包括：5XRT Master Mix、RNA、Nuclease_free Water;具体的工艺步骤包括： (1) 配制反应体系：5 XRT Master Mix 2uL+RNA 2uL+Nuclease-free Water 6uL; (2) 将上述反应体系放置37°C，并作用15min; (3) 将上述反应体系转移至50°C，并作用5min; (4) 将上述反应体系转移至98°C，并作用5min; (5) 将上述反应体系转移至4°C，冷却后冻存，即得到cDNA。5. 根据权利要求2所述的一种过表达TMEM88基因的构建方法，其特征在于，根据TMEM88 的CDS序列，设计上、下游引物;上、下引物序列分别如下： TMEM88-F:5 '-CCGGAATTCCGGATGGCGGATGTCCCCG-3 ' TMEM88-R:5 '-GGGGTACCCCTTAGACCCAGACCTTTCCT-3 '。6. 根据权利要求2所述的一种过表达TMEM88基因的构建方法，其特征在于，PCR的反应 体系如下:2XPrimeSTAR Max、cDNA样品、上下游引物、高纯水;具体的工艺步骤包括： (1) 配制反应体系：2XPrimeSTARMax 25yL+cDNA lyL+引物各lyL+高纯水22yL; (2) 将上述反应体系轻轻混匀后放入PCR仪器，设置如下程序运行：(3) 将上述PCR产物进行1-1.2%琼脂糖凝胶电泳； (4) 回收目的DNA片段。7. 根据权利要求2所述的一种过表达TMEM88基因的构建方法，其特征在于，对TMEM88的 PCR产物和pEGFP-C2载体进行EcoR I和Kpnl的双酶切;酶切体系如下：限制性内切酶(EcoRI 和Kpnl)、10 X Buf f er Tango、TMEM88的PCR产物、或pEGFP-C2载体;具体的工艺步骤包括： (1) 配制反应体系：10 XBuffer Tango 2yL+EcoRI和Kpnl各0 ? 5yL+TMEM88的PCR产物或 和 PEGFP-C2 载体 7yL; (2) 将上述反应体系放置37°C水浴锅中，并作用4~6h; (3) 将上述酶切产物进行1-1.2%琼脂糖凝胶电泳； (4) 观察结果并回收目的DNA片段。8. 根据权利要求2所述的一种过表达TMEM88基因的构建方法，其特征在于，在连接之 前，对载体进行去磷酸化处理； 去磷酸化体系（1〇此）：CIAPlyl、10 X CIAP缓冲液lyl、载体8yl 连接体系（1〇此）：CIAP去磷酸化后载体0.5yl、10 X T4DNA连接酶缓冲液lyl、T4DNA连接 酶lyl、PCR酶切纯化产物7.5yl; 连接方法:将上述反应体系置于〇. 5ml的离心管中混匀，16 °C水浴过夜。9. 根据权利要求8所述的一种过表达TMEM88基因的构建方法，其特征在于， (1) 取出储存于-80°C的TG1感受态细胞，冰浴解冻后加入10yl连接产物，混匀，冰上静 置30min; (2) 42°C热休克90s，取出置冰上3min; (3) 加入500y 1 LB 培养液，37 °C、250rpm 振荡培养 45min; (4) 取出100yl转化液涂于带有相应抗性的LB固体培养基上，37°C倒置培养8~12h。10. -种使用如权利要求1所述的过表达TMEM88基因质粒在抑制人肝癌细胞的增殖、促 进人肝癌细胞的凋亡的应用。
【文档编号】C12N15/66GK106047927SQ201610425684
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】徐涛, 潘林鑫, 李小枫, 倪明明, 杨扬, 孟晓明, 黄成 , 张磊, 李俊
【申请人】徐涛