一种新型衣壳蛋白基因修饰腺病毒载体及其用图
【专利摘要】本发明涉及生物医学领域，涉及一种新型衣壳蛋白修饰的重组腺病毒载体。具体涉及到一种不影响包装、对人体正常细胞无毒害作用、并且对肿瘤或癌症细胞具有特异性高杀伤力的靶向性腺病毒载体及其用途。
【专利说明】
-种新型衣亮蛋白基因修饰腺病毒载体及其用途
技术领域
【背景技术】
[0001] 溶瘤病毒(Oncolytic Viruses)作为一种极具潜力的生物抗肿瘤手段目前已引起 人们的广泛关注。经过基因改造的病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制，破坏并溶解细胞， 释放出的子代病毒又能感染邻近的肿瘤细胞，产生级联效应，而正常组织细胞在此过程中 不受病毒影响[1 ]。另外，病毒破坏肿瘤细胞的同时会释放细胞因子和肿瘤抗原，改变肿瘤 微环境甚至激活全身免疫。目前，多种人类病毒可通过分子生物学手段改造成具有溶瘤活 性的条件复制型病毒即溶瘤病毒，包括腺病毒、反转录病毒、单纯瘤疹病毒、痘苗病毒和麻 疹病毒等[2-5]。其中，溶瘤腺病毒由于具有感染宿主广、安全易生产、可插入较大外源基因 等优点而受到广泛的研究和应用。
[0002] 结合基因治疗和溶瘤病毒治疗的双重优势，W溶瘤腺病毒为载体介导的基因治疗 是一种十分具有应用前景的恶性肿瘤治疗策略。目前已开展的溶瘤腺病毒或携带抗癌基因 的溶瘤腺病毒制品临床研究很多，包括0117义-015、56500、〔67060、4(15-024-1?；0等[2]。国内 对于溶瘤腺病毒的研究起步较早且一直处于国际先进水平。2005年，国家食品药品监督管 理局（SFDA)批准了世界上首个溶瘤腺病毒产品H101(安柯瑞)用于肿瘤患者的治疗，极大地 推动了国内外溶瘤腺病毒的临床转化应用研究[6]。刘新垣院±团队提出的"癌症的祀向基 因-病毒治疗"策略是溶瘤腺病毒研究和应用的一大创新和突破，其原理是通过溶瘤腺病毒 ZD55表达插入的外源抗癌基因来增强其抗癌作用。在此基础上，他们又提出"癌症的祀向双 基因-病毒治疗（targeting dual gene-virotherapy of cance;r，CTGVT-DG)"，即在ZD55中 插入两个肿瘤治疗基因，两个基因可通过不同机制产生协同效应或互补作用，因此能够增 强其抗癌功能[7,引。此外，他们还针对不同器官癌症如肝癌、肠癌等，利用组织特异性启动 子开展个性化治疗的尝试，也取得了较好的治疗效果[9，10]。
[0003] 尽管溶瘤腺病毒构建策略日趋成熟，然而如何突破腺病毒载体人体应用的限制， 保证病毒安全性的基础上进一步提高有效性仍是研究者追求的方向。另外，溶瘤病毒的传 统给药途径是瘤内注射，局部药物浓度很高，但扩散受限，对于较大肿瘤需要多部位注射， 增加操作次数，且分布不均。而大多数恶性肿瘤手术或放疗后复发都是多中屯、的，所W瘤体 内直接注射病毒并不适宜。溶瘤腺病毒的全身给药目前还未被广泛接受，主要是由于运种 给药方式的溶瘤腺病毒能否到达瘤体的原发部位及转移灶，并在肿瘤内有效的复制再感染 尚未有定论。因此，目前在该领域仍然需要通过基因工程技术进一步改造腺病毒载体，使其 成为新一代增强型溶瘤腺病毒基因治疗载体。本发明就是为了满足此种需求并提供相关 优点，W有利于肿瘤的基因治疗，实现肿瘤祀向、减轻肝毒性W及增强其抗肿瘤效应的目 的，对于溶瘤腺病毒载体的进一步应用具有重要意义。
[0004] 本发明的目的是利用肿瘤坏死因子诱导调亡配体(TRAIL)重组蛋白和基于TRAIL 的基因治疗均具有较强抗肿瘤活性的特点，设计构建WTRAIL修饰病毒衣壳蛋白的新型溶 瘤腺病毒基因治疗载体，可在调控病毒载体感染性质、组织分布的同时增强其特异性抗肿 瘤效应。根据腺病毒衣壳蛋白的结构和功能特征，w往对于腺病毒衣壳蛋白的基因修饰主 要是在六邻体、纤维蛋白W及pK上。考虑到结构修饰对病毒包装的影响，我们基于pK设计 了一种全新的改造策略。pK是唯一一个暴露于腺病毒衣壳外表面的次要衣壳蛋白，在病毒 衣壳上有240个拷贝。结构分析显示，每3个pK单体的N末端形成=曲臂型结构将3个六邻体 粘合在一起，而C末端形成反平行的四聚体位于两个六邻体对应面的边缘[11 ]。研究表明， 短肤甚至一些较长肤段可通过与pK的C末端结构域融合修饰到腺病毒的衣壳表面，并且不 影响病毒的包装和复制。利用一些柔性Linker,可将一些较大的蛋白如GFP、单链抗体、单区 抗体等修饰到病毒的衣壳表面，从而标记病毒或使其具有祀向的感染能力[12]。而在另一 项研究中，Glasgow等利用一种亮氨酸拉链异二聚体(Xeucine Zipper Heterodimers)可将 单链抗体分子修饰到腺病毒的纤维蛋白[13]。
[0005] 综合运些研究，我们的设计就是利用运种亮氨酸拉链异二聚体系统，将其中一个 单链Zipper融合到pK的C末端，而将与其配对的Zipper融合到溶瘤腺病毒表达TRAIL的N末 端，运样载体分泌表达的TRAIL将通Zipper配对修饰到完成装配出细胞的病毒的衣壳表面。 该载体的特点是仅W短肤修饰pK，因此不会影响病毒的包装，载体表达的TRAIL除直接诱 导肿瘤细胞调亡外，还将修饰到子代病毒的衣壳蛋白表面，在改变腺病毒载体祀向性等性 质的同时增加了自身稳定性从而使载体获得了更强的肿瘤抑制活性。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种新型的衣壳蛋白基因修饰腺病毒载体，其特点是病毒的衣壳蛋 白表面连接了 TRAIL蛋白。该载体是通过基因工程技术对衣壳蛋白pK进行基因修饰，同时 可表达融合亮氨酸拉链的TRAIL蛋白，表达的TRAIL融合蛋白可通过亮氨酸拉链异二聚体系 统自组装至病毒的衣壳表面。
[0007] 本发明提供的新型重组腺病毒载体，其表达的TRAIL融合蛋白W及连接至病毒表 面的TRAIL蛋白均具有肿瘤细胞调亡活性。同时该载体通过静脉注射时在小鼠体内具有明 显的降低肝富集和肿瘤细胞祀向能力。
[0008] 本发明提供的新型重组腺病毒载体还进一步构建了溶瘤腺病毒载体，该溶瘤腺病 毒载体的祀向性和抗肿瘤活性优于复制缺陷型腺病毒载体和未改造的溶瘤腺病毒。
[0009] 本发明还提供了本发明的重组腺病毒载体用于制备肿瘤治疗药物的用途。
[0010]本发明提供的载体既赋予了其肿瘤祀向能力及潜在的静脉给药能力，又显著增强 了抗肿瘤活性。
【附图说明】
[0011] 图1.新型衣壳蛋白基因修饰腺病毒载体设计原理示意图。
[0012] 图2.新型腺病毒载体基因组示意图。
[0013] 图3.新型腺病毒载体基因组PCR鉴定电泳图，条带l:rAd5-zTRAIL-RFP-SA24Ela， 条带2:rAd5pz-zTRAIL-RFP-S A 24Ela，+/-:阳性、阴性对照。
[0014] 图4.流式细胞技术检测新型腺病毒载体的肿瘤细胞调亡作用。
[0015] 图5.新型腺病毒载体体外抗肿瘤活性检测。
[0016] 图6.新型腺病毒载体静脉注射后肿瘤祀向检测，组织编号1-6分别为:屯、脏、肝脏、 脾、肺、肾脏、肿瘤。
[0017]图7.新型腺病毒载体小鼠体内肿瘤抑审喊验流程图
[0018] 图8.新型腺病毒载体抑制荷瘤鼠肿瘤细胞生长情况检测，40-4:'4(15-1?。？^4(15- zTRAIL-RFP、rAd5pz-zTRAIL-RFP、rAd5-zTRAIL-RFP-S A 24Ela和rAd5pz-zTRAIL-RFP-S A 24Ela〇
【具体实施方式】
[0019] 实施例1新型腺病毒载体骨架质粒和穿梭质粒的构建
[0020] 1、骨架质粒的构建
[0021] 经过基因查找，我们发现在腺病毒载体基因组上，在pIX基因内部和下游，分别有 一个Smal(TAKARA公司）酶切位点。所W我们利用Smal内切酶将R ? R34基因融合至IjpIX的C末 端。首先，采用生物合成技术获得SmaI-pIX-(G4S)3-R ? R34-Smal运段基因，然后使用Smal 工具酶将合成的基因片段回连到pIX基因上。
[0022] PCR 的反应体系（50ul):
[0023] 灭菌水:34.加1
[0024] 10X buffer:5ul
[0025] MgS04(25mM):化1
[0026] dNTP(2mM):加1
[0027] 引物混合物:各0.加 l(20mM)
[0028] 模板:lul
[00巧]高保真hq酶（lunits/ul): lul
[0030] PCR反应程序(30个循环）：
[0031] 预变性：94°C，3min;
[0032] 变性：94°C，30s;
[0033] 退火：54°C，30s;
[0034] 延伸：72°C，2min;
[0035] 再延伸：72°C，10min。
[0036] SmaI-pIX-(G4S)3-R ? R34-Smal序列：
[0037
[003引鉴定引物；
[0039] sense primer:5'-AAGAATATATAAGGTGGGGGTC-3'
[0040] pix上Smal位点的上游片段
[0041 ] antisense primer:5'-GATGTTACGACAACGTCCAAC-3'（库美公司）
[0042] R ? R34的C末端片段
[0043] 通过中间过渡载体采用了分步克隆的技术，最后使用Xbal和Bstll07I(TAKARA公 司）限制内切酶，将改造的pIX基因回连到病毒骨架质粒上。
[0044] 2、穿梭质粒的构建
[0045] 第一步是外周血中PBMC的分离：
[0046] 1)采集2~5血健康的人血液，加入等体积PBS稀释血液。每1血全血加 0.1 mL 160U/ mL的肝素溶液。
[0047] 2)在15ml的离屯、管中，加入血液一半体积的淋己细胞分层液。
[004引3)将离屯、管倾斜45°角，在离分层液面上1cm处，用枪头将血液沿试管壁徐徐加入， 使血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰；也可W将枪头嘴插入离屯、管底部，将分层液 缓慢加入到血液的底部。
[0049] 4)保证在 18 ~20°C 环境下，2000;r/minX 20min。
[0050] 5)离屯、后的内容物明显分为四层，从上到下依次为:血浆（内含血小板）、分层液、 红细胞、粒细胞。PBMC在血浆层和分层液的界面处，很薄一层，呈乳白色。
[0051] 6)用1ml注射器轻轻插入白膜层，抽取PBMC，放到干净的离屯、管中。
[0052] 7)往加入5ml 1640培养基，洗涂2次，混匀，先1500r/minX10min离屯、，再lOOOr/ minX lOmin离屯、，弃上清。
[0化3] 8)用含有10%小牛血清(Gibco公司）的RPMI1640 2ml，重悬细胞并进行细胞计数。
[0054] 9)将细胞浓度为5 X105个/ml,加入24孔板(Corning公司）进行培养，同时加入1U/ ml的IL-2，刺激培养72小时后提取总RNA。
[0化日]第二步是刺激后的PBMC总mRNA提取：
[0056] 1)膜酶消化收集培养好的PBMC，洗涂重悬后进行计数，每5~10 X106个细胞加1ml TrizoK Invitrogen公司）后，反复用枪吹打或剧烈振荡，使细胞裂解充分。
[0057] 2)细胞的化izol裂解液转入EP管中，在室溫15~30C下放置5分钟，核蛋白完全分 解。
[005引3)在上述EP管中，按照化izol:氯仿为5:1的量入氯仿（北京化工厂），满旋震荡仪 上剧烈震荡，15s，室溫放置2~3min后，4°C，12000g X 15min。
[0059] 4)离屯、后混合液即分离成S层，上层水相中为RNA。吸取上层RNA水相，放到1.5ml EP管中，WTrizol:异丙醇= 2:1的量加入异丙醇(北京化工厂），室溫放置lOmin。
[0060] 5)4°C，12000gX10min，弃上清。
[0061 ] 6) WTrizol的等体积加入75%乙醇，洗涂，满旋混合，4°C，7500g X 5min，弃上清。
[0062] 7)将化管敞口放置，让mRNA在室溫下自然干燥。
[0063] 8)用foiase-打ee wate;r(TAKARA公司）溶解mRNA沉淀。
[0064] 第S步通过PCR获得zi卵er-TRAIL基因：
[0065] 获得mRNA后，参照说明书配制RT-PCR体系，通过mRNA的反转录获得外周血PBMC的 cDNA。
[0066] WcDNA为模板，PCR获得TRAIL基因。TRAIL引物如下：
[0067] sense primer:5'-ATGGCTATGATGGAGGTCC-3'
[006引 antisense primer:5'-GCTCTAGATTTTTCTTTCCAGGTCAGTTAG-3'（库美公司）
[0069] TCTAGA为插入的Xbal酶切位点
[0070] PCR 的反应体系（50ul):
[0071] 灭菌水:34.加1
[0072] 10X buffer:5ul
[0073] MgS04(25mM):化1
[0074] dNTP(2mM):加1
[0075] 引物混合物:各0.加 l(20mM)
[0076] 模板(cDNA):lul
[0077] 高保真化9酶（lunits/ul): lul
[0078] PCR反应程序(30个循环）：
[00 巧]预变性：94°C，3min;
[0080]变性：94°C，30s;
[0081 ]退火:54°C，30s;
[0082] 延伸：72°C，2min;
[0083] 再延伸：72°C，10min。
[0084] 使用生物合成技术获得zipper的单链E ? 34-(G4S)3基因，在其3'端带有19bp(加 粗）的TRAILS'端的基因，运样就可W采用overlap-PCR获得zipper-TRAIL基因。
[00化]E ? 34-(G4S)3序列：
[00 化]ATGCGTGCAGCTTTCCTGGAGAAGGAGAACACTGCACTGCGTACTGAGGTTGCAGAGCTGGAGAAGGAG GTTGGACGTTGTGAGAACATCGGTGGCGGTGGATCCGGCGGAGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTATGGCTATGAT GGAGGTCC
[0087] overlap-PCR引物：
[0088] sense primer:5'-ATGCGTGCAGCTTTCCT-3'
[0089] antisense primer:5'-GCTCTAGATTTTTCTTTCCAGGTCAGTTAG-3'（即TRAIL的下游引 物）
[0090] 实施例2新型腺病毒载体的包装、扩增、纯化和滴度检测
[0091] 1、重组病毒包装
[0092] 1)复苏低代次HEK293细胞（中国科学院细胞库）（30代W内），传至6孔板。
[009引 2)长至90%-95%，用2%胎牛血清（616。0公司）（或无血清）无抗生素0161 (Invi trogen公司）（37 °C预热）1ml换液，细胞无任何漂起，只有轻微回缩为正常。
[0094] 3)转染，lipo2000( Invi化ogen公司）用7 .化1，质粒用2.化g(腺病毒骨架：穿梭质 粒的mo 1比为1:1，共转），其余遵照1 ipo2000说明书，5 % C02 37 °C培养箱培养化。用3ml 1 % 低烙点琼脂糖化ife Science Products公司）+2%血清+1 %双抗DMEM(胶质培养基，37°C预 热)换液，同时设立不加 lip〇2000和腺病毒质粒的正常对照孔。
[0095] 4)每天观察细胞变化，转染后到包装出病毒颗粒W前转染孔细胞和对照孔细胞没 有任何明显区别为正常，如果到4-5天培养基变黄，可W补加1ml，如果到7-8天变黄，则不做 任何处理，7-12天，转染孔与对照孔相比会出现病毒空斑，同时观察RFP的表达来评价病毒 重组是否成功。
[0096] 5)收病毒:根据空斑现象和RFP表达情况判断某处是否有出毒现象。用marker笔标 记出毒的位置后，再用1ml的移液枪吸头对准记号将此处细胞抽取出来，放到含20化1培养 基的1.5ml化管中。
[0097] 6)病毒3次反复冻融后，全部加入准备好的293细胞的24孔板中，进行二次感染。如 果细胞有出毒现象并RFP表达正常，说明病毒重组成功。
[0098] 包装方案如表所示：
[0099]
[0100] 2、重组病毒筛选
[0101 ] 我们实验室用AdMax? Adenovirus Vector系统，所W在病毒包装过程中会产生野 毒，即E1缺失区重新获得E1而不是目的基因的病毒，要进行病毒筛选过程，把野毒筛选掉。
[0102] 1)包装完成的病毒，反复冻融了3次，400化pm X lOmin，吸取上清病毒液，放到新的 1.5ml化管中。化1/管分装，-80°C保存待检。
[0103] 2)状态良好的293AC051细胞，传至6孔板，培养细胞长至95 % W上后，原始培养基 (即无血清无双抗)1ml换液，细胞无任何漂起，只有轻微回缩为正常。
[0104] 3)将化1的病毒10倍梯度稀释，每梯度1ml感染293AC051细胞(一般从1〇-3~1〇- 7)， 不感染的孔做对照。培养化后铺胶，3ml/孔。
[0105] 4)每天观察，如果2~3天培养基变黄，补加1ml胶质培养基，每两天补一次，5~7天 即可挑病毒斑。
[0106] 5)观察，选择合适密度的稀释孔，先对光观察选中白斑，然后在显微镜下白光鉴定 是否为病毒空斑。若有巧光报告基因，可结合巧光标记病毒隧斑。
[0107] 6)1.5ml化管中加入20化1培养基，用1ml枪头挑取病毒单斑，加到管中。3次冻融， 释放病毒。
[0108] 7)293传至24孔板，培养细胞长至90 %~95 %，原始DMEM培养基200iil换液，加入 lOOiil病毒液感染化，更换2%血清培养基50化1。每天观察，7天左右出现明显拉网现象，收 病毒。将细胞吹起，移至1.5ml化管中，100化pmX 5min，弃上清。
[0109] 8)用SOOiil原始DMEM将沉淀悬起分装到3个1.5m化P管中，为筛选一轮病毒，-80°C 保存。
[0110] 9)取1支分装的病毒，提取病毒基因组，最后加30山溶解DNA。取化1病毒基因组DNA 为模板做PCR鉴定。PCR鉴定基因：目的基因（外源基因，一定要有，有几种PCR几种）、E2b(腺 病毒保守基因，一定要有)野毒鉴定引物如下
[0111] a)野毒wt(987bp):
[0112] sense primer=
[0113] antisense primer= 59.0
[0114] b)病毒保守区 E2b(993bp):
[0115] sense primer= 58.5
[0116] antisense primer= 59.0
[0117] c)骨架改造基因 pIX-zipper(615bp):
[011 引 sense primer= 6
[0119] antisense primer= 8
[0120] d)外源基因：
[0121] Survvin promoter：(SUR,987bp)
[0122] sense primer= 58.2
[0123] antisense primer= 58.0
[0124] zTRAIL：(872bp)
[0125] sense primer=
[01 %] antisense primer:5'-TTTTTCTTTCCAGGTCAGTTAG-3'化=61.0(库美公司）
[0127] 10)筛选至病毒单斑野毒几乎没有。
[0128] 最终筛选的重组腺病毒基因组PCR鉴定如图3所示。
[01巧]3、重组病毒扩增
[0130] 1)将筛选好的病毒感染293细胞6孔板293AC051细胞（80%满），换无血清DMEM 1ml。从-80°C冰箱取出一支筛选好的腺病毒(24孔板1个孔的1/3)，融3次冻2次(-80°C保存 算冻第1次，总共需要反复冻融3次），4°C4000巧m lOmin，上清病毒液加入一个孔中（即1:12 的量感染），同时设不加病毒的对照细胞，5%C02 37°C培养箱培养化，更换2%血清培养基。 36-4化感染孔与对照孔比较出现明显区别，90 %细胞变圆漂起，将感染孔收获，eOOiil培养 基重悬，分出来20iU，用于提取病毒基因组检测野毒是否回复。
[0131] 2)得到病毒滴度后继续感染293AC051细胞，1:10比例感染即可，36-4她收样，重复 冻融、感染，在此过程中始终要有正常细胞对照，从而将病毒数量逐级放大。直到得到4 X 108细胞扩增的病毒，才能做病毒纯化。
[0132] 4、重组病毒纯化
[0133] 1)病毒扩增离屯、后，7ml TD buffer重悬细胞沉淀，分装7个1.5ml化管，3次冻融 裂解后，4°C12000gX10min，取上清。
[0134] 2)制备不连续CsCl密度梯度(每种病毒两管）：
[0135] 准备物品：
[0136] 1)TD buffer(可W用PBS替代）： 25 mM TYis (Genview 公司） 0?技1 控 137 inM NaCl (北京化工厂) 1.6 g 200 ml (pH 8. 0)
[0137] 目mM KCl (北京化工厂） 0. 075g 0. 7 mi俯部热4 ?巧腊0幻白京化工厂） 0.扼控
[013引2)透析液： MgC12. ?畑撕（北京化工厂） 0, 4腑:目:呂 4L (pH 7. 4) 甘細（化京化工厂) 如Q ml 俯幻（化京化工厂） 32 g
[0139] 防:1巧技C化工厂） 0.8 g 贴潍朗4，12股(）（北京化IE厂） 1:4.日1.2 g 紐2P04 (北京化工厂） 化雜g
[0140] 3)高压灭菌:TD buffer、透析液、1.5ml化管、500ml烧杯
[0141] 4)紫外灭菌:超速离屯、管2个、超速离屯、桶其他物品： 就皿1离也筒(Labserve公司） 多个 1 ml注射器（长春民建医疗器械有限公司） 多个
[0142] 5 ml注射器（湖北福蠢医疗器械有限公司） 多个 0. 22 P m无菌滤膜(Mill.ipore公司） 麥个 0. 5~3 mL的10 kDa透析卡（扣e'rmo公司） 每个病毒用2个
[0143] 依次加入0.5ml 1.5g/ml CsCl、3ml 1.35g/ml CsCl、3.5ml 1.25g/ml CsCl、5ml 病毒液。
[0144] 3)离屯、，4°(：，35,00化9111，311。吸出主病毒带，即第二条病毒带，如果需要可^继续 做连续CsCl梯度离屯、。
[0145] 5、病毒透析
[0146] 1)用1ml注射器抽取病毒液，小屯、加到透析卡中，放入500ml的烧杯中，加入400ml 透析液，4°C低速揽拌透析。
[0147] 2)透析满地，换透析液，2次。
[0148] 3)透析完成后收病毒。用1ml注射器将病毒从透析卡中抽出，放到1.5ml化管中，4 °C，4000rpmX lOmin。
[0149] 4)病毒分装，2ul/管XIO,做鉴定、细胞实验；lOul/管X10,50ul/管X5，100ul、 200ul等。-80°C保存，病毒切忌反复冻融。
[0150] 6、病毒滴度检测
[0151] 腺病毒总颗粒数VP，是所有病毒的总数，包括感染性和缺陷性病毒颗粒。一般采用 0D260的方法来测定。将病毒液与含2%SDS的PBS 1:1混合，于56°C放置lOmin。然后检测 260nm处的吸光度，利用W下公式计算病毒的总颗粒数:vp/ml=OD26〇X 1.1 X 1〇12
[0152] 腺病毒的感染力PFU-般采用50 %组织培养感染剂量法(TCID50)进行测定，步骤 如下：
[0153] 1)96孔板铺293细胞，2%DMEM调节细胞浓度对为IXloVml，每孔加入lOOul细胞， 置解箱培养至细胞贴壁神展开，或者培养过夜。
[0154] 2)待测病毒用2%DMEMW10倍梯度稀释8个梯度。向铺准备好的93孔板中加入病毒 稀释液，每孔lOOul，每个梯度做10个复孔，同排的最后两孔只加培养基，作为空白对照。继 续培养。
[0155] 3)培养到第10天，镜下观察CPE现象，计算每一排中出现WE的孔数。有WE出现即 为阳性。
[0156] 4)如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释 度100%阴性，则本测试即为有效。
[0157] 5 )用KARBER统计法精确算出病毒滴度：对于100U1的稀释液，滴度为T = 101 +d(s-0'5)。因为TCID50法测到的滴度d=logl0值比标准空斑法高0.7,所W最终公式如下:T = 10 剛'5p 即/ml
[0158] 实施例始田胞调亡检测分析腺病毒衣壳结合的TRAIL蛋白活性
[0159] l)检测细胞浓度为0.5~lX106/ml，体积为100~20化l，6孔板所铺细胞为lXl(yV 孔，12孔板为5 X 105/孔，24孔板为2 X 10吼。细胞培养过夜(或者贴壁后），加入所需剂量的 病毒，培养至所需时间。
[0160] 2)用去离子水将 10XBinding Buffer稀释成 1 XBinding Buffer。
[0161] 3)细胞收集:膜酶消化细胞坏加抓TA)，消化时间控制好，不易过度，則方引起假 阳性。
[0162] 4)细胞洗涂：lOOOrpm/min离屯、5min收集细胞。预冷PBS 1ml洗涂细胞。lOOOrpm/ min，5min。尽量去除PBS，防止残留PBS的影响Annexin V结合。再用200]il Annexin V (Invitrogen公司）1 X Binding Buffer洗涂一次。800巧m/min离屯、4min。
[0163] 5)加入50]il 1 XBinding Buffer,进行巧光标记，方案如下：
[0164] a)Cont;rol:空白细胞，不加试剂
[01化]b)FITC单染:Annexin V-門TC 2.化1/样，轻轻重选细胞，冰上避光解育15min。
[0166] c)PI单染:PI化1/样，轻轻重选细胞，冰上避光解育5min。
[0167] d)待测样品：Annexin V-FnC按2.扣1/样的量用1 XBinding Buffer稀释，可配制 所需总量，5化1分装重选细胞，冰上避光解育15min。加入化1的PI，避光解育5min。
[016 引 6)800巧111/111；[]1离屯、4111；[]1，弃上清。
[0169] 7)200iU 1 XBinding Buffer重悬细胞，300目纱网过滤。在化内上机检测。
[0170] 结果如图4所示。
[0171 ]实施例4新型腺病毒载体的体外抗肿瘤活性检测
[0172] 实验细胞用2%血清的培养基将浓度调为6X103个/ml, W每孔50iil铺96-孔板，37 °05%C02培养2地后，每孔加入50山病毒液进行感染。重组腺病毒rAd5-RFP、rAd5-zTRAIL- RFP、rAd5pz-zTRAIL-RFP、rAd5-zTRAIL-RFP-S A 24Ela和rAd5pz-zTRAIL-RFP-S A 24ElaU 101=0.01、0.05、0.25、1.25、6.25、32.25、156.25五个梯度感染细胞，每个实验梯度5个复 孔，同时W不加病毒感染的细胞做对照孔。继续培养6她后，5mg/ml MTT每孔加20山，37°C继 续培养4h。运时候进行镜下观察，能看到明显的蓝色晶体附着在细胞板上。弃上清，每孔中 加入15化1 DMS0,轻轻震荡10min，490nm检测吸收值(A值）。根据下列公式计算细胞存活率， 其中空白孔为不含细胞和培养液的空孔。
[0173] 细胞存活率（％ )=实验孔A值-空白孔A值/(对照孔A值-空白孔A值)*100%
[0174] 结果如图5所示。
[0175] 实施例5新型腺病毒载体体内注射后肿瘤祀向检测
[0176] 6周龄的BALB/c(nu/nu)雌性裸鼠，2X 106的ZR-75-30细胞皮下注入裸鼠背部右后 侦M寺肿瘤体积长至150~200mm3时，随机选取8只分为4组，重组病毒W5 X l〇WpFU的剂量分 别用瘤内注射(i.t)和尾静脉注射(i.v)方式注入小鼠体内，使用小动物活体成像系统追踪 观察病毒的肿瘤祀向作用。
[0177]
[0178] 静脉给药的两组实验鼠在第10天最后一次观察结束后处死，取出屯、、肝、脾、肺、肾 等器官和肿瘤组织，在活体成像系统化0MK公司）上进行分析观察改造溶瘤腺病毒系统给 药后的器官分布。结果如图6所示。
[0179] 实施例6新型腺病毒载体的体内抗肿瘤活性检测
[0180] 6周龄的BALB/c(nu/nu)雌性裸鼠，2X 106的ZR-75-30细胞皮下注入裸鼠背部右后 侦M寺肿瘤体积长至150~200mm3时，将裸鼠随机分为12组，每组7只（其中2只用于组织免疫 组化分析），PBS和5种重组腺病毒W瘤内/静脉两种注射方式治疗肿瘤。在第0天，每组每只 裸鼠注射1 X 10中即的rAds，连续注射S天，同时PBS组作为对照。每两天记录一次肿瘤体积 (肿瘤体积= l/2x宽径2x长径），到第30天实验结束。上述实验流程如图7所示，实验结果如 图8所示。
[0181]
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【主权项】
1. 一种重组腺病毒载体，其特征在于腺病毒衣壳蛋白表面连接了 TRAIL蛋白。2. 权利要求1所述的重组腺病毒载体，其中所述的腺病毒衍生自人腺病毒、禽腺病毒和 猴、马、牛、羊、猪、狗、鼠等哺乳类动物腺病毒。3. 权利要求2所述的重组腺病毒载体，其中所述腺病毒进一步衍生自人血清5型腺病 毒。4. 权利要求1所述的重组腺病毒载体，其中连接TRAIL蛋白的病毒衣壳蛋白选自六邻 体、五邻体、纤维蛋白和pIX。5. 权利要求4所述的重组腺病毒载体，其中连接TRAIL蛋白的病毒衣壳蛋白进一步选自 pIX〇6. 权利要求1所述的重组腺病毒载体，其中所述的TRAIL蛋白通过亮氨酸拉链异二聚体 系统连接到病毒衣壳蛋白上。7. 权利要求6所述的重组腺病毒载体，其中所述的TRAIL蛋白N端融合了亮氨酸拉链，并 由该腺病毒载体表达。8. 权利要求1所述的重组腺病毒载体，其衣壳蛋白pIX的C末端融合了亮氨酸拉链。9. 权利要求1所述的重组腺病毒载体，进一步构建为溶瘤腺病毒载体。10. 权利要求2-9所述任一项的重组腺病毒载体用于制备肿瘤或癌症治疗药物的用途。
【文档编号】C12N15/861GK106047931SQ201610356356
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】于彬, 于湘晖, 孔维, 王真
【申请人】吉林大学