一种靶向基因载体及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种骨靶向基因载体，所述骨靶向基因载体为阿仑膦酸钠改性的脂质体，所述阿仑膦酸钠改性的脂质体包括阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇以及阿仑膦酸钠改性的磷脂，所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构成磷脂层，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂穿插于所述磷脂层中并与所述磷脂层形成囊泡结构，所述阿仑膦酸钠暴露在所述磷脂层之外。该骨靶向基因载体对骨组织有较高的靶向性和转染效率，可以负载基因物质在骨组织附近高效表达。本发明还提供了该骨靶向基因载体的制备方法及应用。
【专利说明】
-种卽向基因载体及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明设及非病毒基因传递系统领域，具体设及一种骨祀向基因载体及其制备方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 基因治疗是一种通过基因载体将目标基因传递到祀细胞内，通过添加、阻断、纠正 基因等方法实现治疗疾病的目的。基因治疗为一些重大疾病提供了一种很有发展前途的治 疗方法。然而，高效、祀向性的基因载体的匿乏，制约着基因治疗在临床上的广泛应用。无疑 成为基因治疗成功与否的关键所在。
[0003] 目前，基因载体主要有病毒型载体和非病毒型载体。应用较多的是无免疫反应、造 价低廉、可大量重复生产的非病毒型载体。非病毒载体主要包括脂质体、聚乙締亚胺(PEI)、 壳聚糖等，运些非病毒载体通过静电作用与DNA复合形成基因传输系统进行基因转染。其 中，脂质体是唯一被FDA批准的纳米载药体系，具有良好的生物相容性、可降解性，因而广泛 地应用于非病毒转基因载体。但脂质体作为非病毒转基因载体的转染效率一般较低、缺乏 祀向性，因此，如何提高脂质体非病毒转基因载体的祀向性W及转染效率成为研究重点。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明旨在提供一种骨祀向基因载体及其制备方法和应用。该 骨祀向基因载体具有双憐酸基，对骨组织有较高的祀向性和转染效率。该载体对基因物质 有较好的稳定作用，可使基因物质在骨组织附近高效表达。该基因载体的毒性低、安全有 效。
[0005] 第一方面，本发明提供了一种骨祀向基因载体，所述骨祀向基因载体为阿仑麟酸 钢改性的脂质体，所述阿仑麟酸钢改性的脂质体包括阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇W 及阿仑麟酸钢改性的憐脂，所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构成憐脂层，所述阿仑 麟酸钢改性的憐脂穿插于所述憐脂层中并与所述憐脂层形成囊泡结构，所述阿仑麟酸钢暴 露在所述憐脂层之外。
[0006] 优选地，所述骨祀向基因载体的粒径为40-200nm。
[0007] 优选地，所述阿仑麟酸钢改性的憐脂与所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇的 摩尔比为(0.01-0.07) :(1-3) :(0.5-1): (0.1-1)。运样的摩尔比，可有助于各个组分之间形 成形貌较规则、分散性良好、粒径分布较均匀、结构稳定的骨祀向基因载体，不易被人体体 液稀释、溶解而解体，有利于祀向到骨细胞，用该骨祀向基因载体包裹基因物质在生物医学 应用有较大优势。
[000引进一步优选地，所述阿仑麟酸钢改性的憐脂与所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆 固醇的摩尔比为(0.01-0.07) :(2-3) :(0.5-1): (0.5-1)。
[0009]本发明中，所述阿仑麟酸钢改性的憐脂包括阿仑麟酸钢W及通过酷胺键与其相连 的憐脂。
[0010] 优选地，所述阿仑麟酸钢改性的憐脂包括聚乙二醇衍生化憐脂和通过酷胺键与聚 乙二醇衍生化憐脂连接的阿仑麟酸钢。
[0011] 优选地，所述阳离子类脂包括（2,3-二油酷基-丙基）甲基氯化锭（1，2- diole〇}d-3-t;rimeth5dammonium-p;ropane ,D0TAP)、（2,3-二油氧基丙基）S甲基氯化锭(N- [1-(2,3-dioley 10巧）propyl]-N,N,N-t;ri-methylammonium chloride,D0TMA)和双十八烧 基二甲基漠化胺(DODAB)中的一种或多种。
[0012] 本发明中，所述阳离子类脂为整个脂质体提高正电荷，在转运基因的过程中起主 要作用，且具有在体外稳定性好、在体内可生物降解的特点。阳离子类脂的疏水尾链会影响 所形成脂质体的稳定性与流动性，而亲水的阳离子头部的电荷特性则会影响到所形成脂质 体的表面特性。
[001引更优选地，所述阳离子类脂为D0TAP。
[0014]优选地，所述中性辅助类脂包括二油酷憐脂酷乙醇胺（1，2-dioleyl-sn-glyce;r〇- 3-phosphatidylethanolamine ,D0阳）、二油酷憐脂酷胆碱（1,2-dioleoyl-sn-glyce;r〇-3- phosphocholine ,D0PC)、二油酷基甘油基憐脂酷丝氨酸（1,2-dioleoyl-sn-glyce;r〇-3- phospho-L-serine ,D0PS)、双（单酷基甘油）憐酸醋（bis (monomyristoylglycero) 地03地曰16,1^?)和卵憐脂(91103911曰1：1(171旨17。61'〇1,?6)中的一种或多种。
[0015] 更优选地，所述中性辅助类脂为二油酷憐脂酷乙醇胺(DOPE)。001^具有很强的细 胞膜去稳定化作用，富含DOPE的阳离子脂质体可辅助DNA转染，提供转染效率。DO阳能促进 脂质体的形成，尤其是在酸性条件下促进脂质体向反六角形相的过渡，有利于与细胞膜进 行融合。
[0016] 本发明的所述述骨祀向基因载体中，胆固醇可镶嵌于阳离子类脂、中性辅助类脂 分子之间，共同形成憐脂层，可W提高所述基因载体包覆基因后形成的基因载体复合物的 体内转染活性。
[0017] 优选地，所述聚乙二醇衍生化憐脂是由聚乙二醇通过共价键和憐脂类物质相连得 到，所述聚乙二醇分子的分子量为200~20000道尔顿。所述憐脂类物质可W为人工合成的 或自然界存在的憐脂，所述憐脂类物质包括但不限于二硬脂酷憐脂酷乙醇胺(DSPE)、二硬 脂酷憐脂酷甘油(DSPG)或胆固醇。具体地，聚乙二醇分子的分子量可W为200、500、1000、 2000、5000、7000、10000、15000或20000。
[0018] 阿仑麟酸钢为双憐酸类化合物，其分子中含有-N出活性官能团，可W理解的是，所 述阿仑麟酸钢改性的憐脂是通过阿仑麟酸钢的氨基与簇基化的聚乙二醇衍生化憐脂通过 酷胺键连接而成。
[0019] 更优选地，所述簇基化的聚乙二醇衍生化憐脂为二硬脂酷憐脂酷乙醇胺-聚乙二 醇-簇酸共聚(DSPE-PEG-C00H)。此时，所述阿仑麟酸钢改性的憐脂为阿仑麟酸钢-聚乙二 醇-二硬脂酷憐脂酷乙醇胺(DS阳-PEG-Aln)。
[0020] 进一步优选地，DSPE-PEG-Aln与所述D0TAP、D0PE、胆固醇的摩尔比为（0.01- 0.07):(1-3):(0.5-1):(0.5-1)。
[0021] 本发明第一方面提供的所述骨祀向基因载体表面修饰有阿仑麟酸的主体部分，该 基因载体对骨组织有较好的亲和性，其分子中的双憐酸基能与径基憐灰石高效地结合，能 够高祀向性地将目的基因物质递送到骨细胞内，有利于目的基因后续的表达。此外，所述骨 祀向基因载体的表面稳定地修饰有阿伦麟酸-聚乙二醇，可w有效、长时间地稳定所述骨祀 向基因载体，延长体内循环的时间，低成本，低毒，安全有效。
[0022] 第二方面，本发明提供了一种骨祀向基因载体的制备方法，包括W下步骤：
[0023] (1)将聚乙二醇衍生化憐脂溶于第一溶剂，并加入催化剂、缩合剂活化，再加入溶 解在第一溶剂中的阿伦麟酸钢，在室溫下进行酷胺化反应8-12h，得到反应液，将所述反应 液经分离纯化后进行冷冻干燥，得到阿仑麟酸钢改性的憐脂，其中，所述聚乙二醇衍生化憐 脂的簇基与阿仑麟酸钢的氨基的摩尔比为(1-10): 1;
[0024] (2)取上述阿仑麟酸钢改性的憐脂，与阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇加入到 反应器中，加入有机溶剂，混合均匀后得到第一混合溶液，通过旋转蒸发法去除所述第一混 合溶液中的溶剂，得到膜状材料；
[0025] (3)加入憐酸盐缓冲溶液溶解所述膜材料，并进行超声处理，得到第二混合溶液， 将所述第二混合溶液采用微孔过滤膜来回挤压过滤多次，得到骨祀向基因载体，其中，所述 骨祀向基因载体为阿仑麟酸钢改性的脂质体，所述阿仑麟酸钢改性的脂质体包括阳离子类 月旨、中性辅助类脂、胆固醇W及阿仑麟酸钢改性的憐脂，所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆 固醇构成憐脂层，所述阿仑麟酸钢改性的憐脂穿插于所述憐脂层中并与所述憐脂层形成囊 泡结构，所述阿仑麟酸钢暴露在所述憐脂层之外。
[0026] 优选地，阿仑麟酸钢改性的憐脂与所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇的摩尔 比为(0.01-0.07) :(1-3) :(0.5-1): (0.1-1)。
[0027] 进一步优选地，所述阿仑麟酸钢改性的憐脂与所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆 固醇的摩尔比为(0.01-0.07) :(2-3) :(0.5-1): (0.5-1)。
[0028] 优选地，所述骨祀向基因载体的粒径为40-200nm。
[0029] 进一步优选地，所述骨祀向基因载体的粒径为50-150nm。
[0030] 优选地，所述阳离子类脂包括D0TAP、D0TMA和D0DAB的一种或多种。
[0031] 更优选地，所述阳离子类脂为D0TAP。
[0032] 优选地，所述中性辅助类脂包括DOPE、D0PC、D0PS、BMP和PG中的一种或多种。
[0033] 更优选地，所述中性辅助类脂为DOPE。
[0034] 优选地，所述阿仑麟酸钢改性的憐脂包括聚乙二醇衍生化憐脂和通过酷胺键与聚 乙二醇衍生化憐脂连接的阿仑麟酸钢。所述憐脂类物质包括但不限于二硬脂酷憐脂酷乙醇 胺(DSPE)、二硬脂酷憐脂酷甘油(DSPG)或胆固醇。
[0035] 进一步优选地，所述聚乙二醇衍生化憐脂是由聚乙二醇通过共价键和憐脂类物质 相连得到，所述聚乙二醇分子的分子量为200~20000道尔顿。
[0036] 更优选地，所述阿仑麟酸钢改性的憐脂为阿仑麟酸钢-聚乙二醇-二硬脂酷憐脂酷 乙醇胺(DSPE-PEG-Aln)。
[0037] 进一步优选地，DSPE-PEG-Aln与所述D0TAP、D0PE、胆固醇的摩尔比为（0.01- 0.07):(1-3):(0.5-1):(0.5-1)。
[0038] 优选地，步骤（1)中，所述第一溶剂包括水、pH值为5.5~6.0的2-(N-吗啡嘟）乙横 酸缓冲液(简称为"MES缓冲溶液"）、pH值为7.0~7.4的憐酸盐缓冲液等。
[0039] 优选地，步骤(1)中，所述分离纯化为采用截留分子量为500-1000化的透析袋进行 透析48-7化。
[0040] 步骤(1)中，所述酷胺化反应的方法为本领域的技术人员所熟知。催化剂又可称为 活化剂，常与缩合剂联用，用于酷胺化反应。
[0041] 优选地，步骤（1)中，所述缩合剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸 盐(简称邸C)。
[0042] 优选地，步骤（1)中，所述催化剂包括N-径基班巧酷亚胺(NHSKN-径基硫代班巧酷 亚胺钢盐(Suf 0-NHS)、1 -径基苯并S挫化0BT)中的一种或多种。
[0043] 进一步优选地，所述酷胺化反应的时间为化。
[0044] 优选地，所述活化的时间为1 -4h。可W为化、2h、化或4h。
[0045] 优选地，步骤(2)中，所述有机溶剂为氯仿或者为氯仿和甲醇的混合溶液。
[0046] 进一步优选地，所述有机溶剂的体积为l-3mL。
[0047] 优选地，步骤(2)中，在所述去除第一混合溶液中的溶剂之后，还包括:将烧瓶置于 真空干燥箱中进行抽真空4-化，并干燥过夜。
[004引优选地，步骤(3)中，所述超声处理具体为：
[0049] 先在功率为50W下进行水浴超声30-60min，然后采用探针式超声仪在20曲Z的频率 和750W的功率下进行超声4-8min。
[0050] 优选地，步骤(3)中，所述微孔过滤膜为孔径为0.1-0.2皿的聚碳酸醋膜。
[0051] 进一步优选地，步骤(3)中，将所述第二混合溶液先采用孔径为0.2皿的聚碳酸醋 膜挤压2~5次后，再通过孔径为0.1M1的聚碳酸醋膜挤压2-5次。
[0052] 本发明第二发明提供的所述骨祀向基因载体的制备方法，先通过聚乙二醇衍生化 憐脂与阿伦憐酸钢的酷胺缩合反应形成阿仑麟酸钢改性的憐脂，再通过薄膜分散法将阿仑 麟酸钢改性的憐脂与阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构建阿伦憐酸修饰的脂质体，即骨 祀向基因载体。此方法获得的基因载体的细胞毒性低、生物相容性好、骨祀向效率高、转染 效率显著。所述骨祀向基因载体的制备方法简单，操作方便，条件溫和，具有广阔的应用前 景。
[0053] 第=方面，本发明提供了一种基因递送系统，所述基因递送系统为基因物质和上 述所述的骨祀向基因载体通过静电作用形成的纳米微球，其中，所述骨祀向基因载体与所 述基因物质的氮憐比为(2-12) :1。
[0054] 如本发明所述的，所述"氮憐比"为骨祀向基因载体的阳离子类脂中氨基的摩尔数 与所述基因物质中憐酸根的摩尔数之比。
[0055] 本发明中，骨祀向基因载体中的阳离子类脂与基因物质的氮憐比为（2-12):1,可 W有效地提高基因载体与基因物质的复合效率，W及基因递送系统的表面电荷、胶体稳定 性及粒径大小。
[0056] 优选地，所述基因递送系统的平均粒径为50-200nm。
[0057] 所述基因物质包括但不限于脱氧核糖核酸、质粒DNA、微环DNA、核糖核酸中的一种 或多种。
[0化引更优选地，所述基因物质包括pSDF-1质粒和peSDF-1质粒中的一种或两种。
[0059]所述基因递送系统中，所述骨祀向基因载体表面修饰有阿仑麟酸钢，该基因载体 对骨组织有较好的亲和性，其分子中的双憐酸基能与径基憐灰石高效地结合，能够高祀向 性地将目的基因物质递送到骨细胞内，有利于目的基因后续的表达。
[0060] 第四方面，本发明提供了一种基因递送系统的制备方法，包括W下步骤：
[0061] 将基因物质和上述所述的骨祀向基因载体溶解于灭菌纯水后，得到混合液，然后 室溫静置，所述混合液中的骨祀向基因载体和所述基因物质通过静电作用形成纳米微球， 得到所述基因递送系统，其中，所述骨祀向基因载体与所述基因物质的氮憐比为(2-12) :1。
[0062] 优选地，所述骨祀向基因载体的浓度为0.7-2 . Img/mL(载体自身的浓度，未混合 前）dW体系中阳离子类脂(如D0TAP)的质量含量进行计量。例如，可W是0.7、0.8、1.0、1.2、 1.5、2.0、2.Img/mLo
[0063] 优选地，所述基因物质和所述骨祀向基因载体的体积比为1:1。
[0064] 优选地，所述解育的时间为10-50min。所述解育直接在室溫下进行反应，无须加热 或降溫，所述解育溫度为20-37 °C。
[0065] 第五方面，本发明第一方面所述的骨祀向基因载体或如本发明第=方面所述的基 因递送系统在制备基因治疗药物(优选为祀向投递药物）中的应用。
[0066] 本发明的有益效果在于：
[0067] (1)本发明提供的所述骨祀向基因载体，其表面修饰有阿仑麟酸钢，所述骨祀向基 因载体对对骨组织有较好的亲和性、祀向性，其分子中的双憐酸基能与径基憐灰石高效地 结合；
[0068] (2)所述骨祀向基因载体具有良好的生物相容性和骨祀向性，能够有效与基因物 质进行复合形成基因递送系统，将基因物质携带进入骨细胞，进而促进基因物质在骨组织 局部高表达祀向目标物质，基因转染效率高，安全有效；
[0069] (3)可W通过调节阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇与及阿仑麟酸钢改性的憐脂 之间的用量来调控制备的骨祀向基因载体的大小、稳定性；
[0070] (4)所述骨祀向基因载体的制备方法简单，操作方便，条件溫和，具有广阔的应用 前景。
【附图说明】
[0071 ]图1为本发明实施例一制得的骨祀向基因载体的结构示意图；
[0072] 图2为本发明实施例一中制得的阿伦麟酸钢改性的憐脂的核磁谱图表征；
[0073] 图3为本发明实施例一制得的骨祀向基因载体的透射电镜图；
[0074] 图4为本发明实施例二制得的骨祀向基因载体的祀向效率图；
[0075] 图5为本发明实施例一制得的骨祀向基因载体对GFP质粒的细胞转染效果图；
[0076] 图6为本发明实施例一制得的骨祀向基因载体对pGk3control质粒的转染效率柱 状图。
【具体实施方式】
[0077] W下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0078] pGL3-con化〇1运种质粒DNA中包含有北美蛋火虫尾部的巧光素酶基因，它可W在 哺乳动物细胞中表达出巧光素酶。而生成的巧光素酶作为一种生物催化剂可W催化某类化 学反应，在发生化学反应的同时会产生生物巧光。所W采用该质粒DM作为报告基因可W充 分保证排除实验干扰，并且由于所发出巧光的强度可W用蛋光计检测，从而可W通过测量 转染后的巧光强度来定量的表征所制备的阳离子脂质体的转染效率。
[0079] 实施例一
[0080] -种骨祀向基因载体的制备方法，包括W下步骤：
[0081 ] (1)制备阿伦麟酸钢改性的憐脂DS阳-PEG2000-Aln:
[0082] Wl-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺化DC)和N-径基班巧酷亚胺(畑S)作 为活化剂，将〇.24mmol的DS阳-PEG2000-C00H在室溫下溶于MES缓冲溶液（0.05mol/L，pH = 5.5 )中，向上述溶液中加入EDC和NHS在冰水浴条件下反应活化簇基2h，其中，DSPE- PEG2000-C00H:邸C: N服的摩尔比为0.03:1.25:0.8;
[008；3] 将0.5mmol的阿伦憐酸钢预先溶于适量的MES缓冲溶液(0.05mol/L，pH = 5.5)中， 再加入上述活化后的反应液中，在揽拌条件下进行酷胺化缩合反应8h，将得到的反应液用 截留分子量为1〇〇〇化的透析袋在去离子水中透析48小时，W除去未反应的DSPE-PEG2000- C00H、阿伦憐酸钢等；将透析后的产品进行冷冻干燥得到白色固体，即为DSPE-PEG2000- Aln;其中，DSPE-PEG2000-C00H的簇基与阿仑麟酸钢的氨基的摩尔比为2.08:1;
[0084] (2)骨祀向基因载体的制备：
[0085] 将D0TAP、D0PE、胆固醇Choi与上述制得的DS阳-PEG2000-Aln溶于氯仿，并加到烧 瓶中，其中各物料的摩尔比为DS阳-阳G2000-Aln: D0TAP: DOPE: Choi: = 0.02:2:0.5:0.5;混 合均匀后得到第一混合溶液，在4(TC的真空条件下通过旋转蒸发法去除得到第一混合溶液 中的氯仿，在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜，然后抽真空化，并将上述烧瓶放置于真空干燥 箱中真空干燥过夜，得到薄膜材料(脂质体薄层）；
[0086] (3)用pH为7.4的PBS缓冲溶液对上述干燥的薄膜材料进行水化，然后先在功率为 50W下进行40°C的水浴超声60min，使烧瓶壁上的薄膜溶解于PBS溶液中；再采用探针式超声 仪W20kHz的频率和750W的功率进行超声4min，超声间隔为2s，直至溶液呈现蓝色乳光状 态，得到第二混合溶液；
[0087] 将超声后的第二混合溶液于4°C下放置过夜，采用Avanti脂质体挤出器进行粒径 控制，将所述第二混合溶液先采用孔径为0.2WI1的聚碳酸醋膜挤压3次后，再通过孔径为0.1 Ml的聚碳酸醋膜挤压3次，获得骨祀向基因载体。
[0088] 图1为实施例一制备的骨祀向基因载体的结构示意图，图中1为阿仑麟酸钢改性的 憐脂，2为憐脂层。所述骨祀向基因载体为阿仑麟酸钢改性的脂质体，所述阿仑麟酸钢改性 的脂质体包括阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇W及阿仑麟酸钢改性的憐脂1，所述阿仑 麟酸钢改性的憐脂1包括聚乙二醇衍生化憐脂(DSPE-PEG-C00H)和通过酷胺键与聚乙二醇 衍生化憐脂连接的阿仑麟酸钢;所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构成憐脂层2,所述 聚乙二醇衍生化憐脂中的憐脂（即DSI^端）穿插于所述憐脂层中2并与所述憐脂层2形成囊 泡结构，所述阿仑麟酸钢暴露在所述憐脂层2之外。
[0089] 本实施例中，步骤(1)的反应式如下所示： r00901
[0091] 对实施例一步骤（1)中制备的DSPE-PEG2000-Aln溶于気代氯仿中，在400MHz Bruker ARX 400的核磁共振光谱仪上扫描氨谱W进行结构表征，结果见图2。从图1可W看 出，与单独的DS阳-PEG2000-C00H和阿伦憐酸钢的核磁谱图相比，DS阳-PEG2000-Aln的氨谱 出现的S2.0(C0NH-CHCH2CH2-)特征峰，运表明阿仑麟酸钢已经被修饰到DS阳-PEG2000-C00H 的主链上。
[0092] 实施例一的骨祀向基因载体的TEM表征：
[0093] 用10化的移液枪吸取1滴实施例一制备的骨祀向基因载体样品悬液，滴在含有碳 膜的铜网上，用綴子夹着铜网，滴液后静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液 体，滴上1 %的憐鹤酸负染色液，染色1~2分钟后用滤纸吸去负染色液，再用蒸馈水滴在铜 网上洗1~2次，用滤纸吸去水，待干后用透射电镜观察。图3为本发明实施例一制得的骨祀 向基因载体的透射电镜图（TEM)。从图3中可W看出，所述骨祀向基因载体的粒径为45± 2nm〇
[0094] 实施例二
[00M] -种骨祀向基因载体的制备方法，与实施例1的不同之处在于，采用巧光标记物 N抓-F(4-氣-7-硝基-2，l，3-苯并氧杂恶二挫）标记的二油酷憐脂酷胆碱D0PC(简写为NBD- PC)替换实施例1中的DOPE，其他条件同实施例一。
[0096] 本发明实施例二所制得的骨祀向基因载体中，各物料的摩尔比为05口6斗662000- Aln: D0TAP: NBD-PC: Choi = 0.02:2:0.5:0.5。所述骨祀向基因载体的粒径为 50nm。
[0097] 同时为了突出本发明的有益效果，还将未采用阿仑麟酸改性的脂质体(简称为"无 祀向基因载体"）作为对照，即采用未经阿伦麟酸钢改性的憐脂DS阳-PEG2000替换实施例二 的DSPE-PEG2000-Aln，其中，无祀向基因载体中各物料的摩尔比为DSPE-PEG2000: D0TAP: NBD-PC :〇!〇 1 = 0.02:2:0.5:0.5。
[009引实施例S
[0099] -种骨祀向基因载体的制备方法，包括W下步骤：
[0100] (1)制备阿伦麟酸钢改性的憐脂DS阳-PEG2000-Aln:同实施例1;
[0101] (2)骨祀向基因载体的制备：
[0102] 将D0TAP、D0PE、胆固醇Choi与上述制得的DS阳-PEG2000-Aln溶于氯仿，并加入烧 瓶中，混合均匀后得到总体积为2mL的第一混合溶液，其中，各物料的摩尔比为D0TAP:DOPE: 化〇1 :DSPE-阳G2000-Aln = 0.02:2:1:1;在40°C真空条件下通过旋转蒸发法去除所述第一 混合溶液中的氯仿，在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜，然后将上述烧瓶放置于真空干燥箱 中抽真空化，并真空状态下干燥过夜，得到薄膜材料(脂质体薄层）；
[0103] (3)用pH为7.4的PBS缓冲溶液对上述干燥的薄膜材料进行水化，然后先在功率为 50W下进行水浴超声30min，使烧瓶壁上的薄膜溶解于PBS溶液中；再采用探针式超声仪W 20k化的频率和750W的功率进行超声5min，超声间隔为2s，直至溶液呈现蓝色乳光状态，得 到第二混合溶液；
[0104] 将超声后的第二混合溶液于4°C下放置过夜W充分水化，采用Avanti脂质体挤出 器，将脂质体依次通过孔径为0.2皿、0.1WI1的聚碳酸醋膜进行粒径控制，获得骨祀向基因载 体。
[0105] 实施例四
[0106] -种骨祀向基因载体的制备方法，包括W下步骤：
[0107] (1)制备阿伦麟酸钢改性的憐脂DS阳-PEG7000-Aln:同实施例1;
[010引（2)骨祀向基因载体的制备：
[0109] 将D0TAP、D0PE、胆固醇Choi与上述制得的DS阳-PEG7000-Aln溶于氯仿，W各物料 的摩尔比为DS阳-PEG7000-Aln:D0TAP: DOPE: Choi = 0.05:3:1:1;用移液枪准确吸取各方组 分物质，加入烧瓶中混合均匀后，得到总体积为1.5mL的第一混合溶液，在40°C真空条件下 通过旋转蒸发法去除氯仿，在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜，然后将上述烧瓶放置于真空 干燥箱中抽真空化，并真空状态下干燥过夜，得到薄膜材料(脂质体薄层）；
[0110] (3)用pH为7.4的PBS缓冲溶液对上述干燥的薄膜材料进行水化，然后先在功率为 50W下进行40°C的水浴超声45min，使烧瓶壁上的薄膜溶解于PBS溶液中；再采用探针式超声 仪W20kHz的频率和750W的功率进行超声4min，超声间隔为2s，直至溶液呈现蓝色乳光状 态，得到第二混合溶液；
[0111] 将超声后的第二混合溶液于4°C下放置过夜充分水化，采用Avanti脂质体挤出器， 将脂质体依次通过孔径为0.2wii、0.1M1的聚碳酸醋膜进行粒径控制，获得骨祀向基因载体。
[0112] 实施例五
[0113] -种骨祀向基因载体的制备方法，包括W下步骤：
[0114] (1)制备阿伦麟酸钢改性的憐脂DS阳-PEG1000 O-Aln:同实施例1;
[0115] (2)骨祀向基因载体的制备：
[0116] 将D0TMA、D0PS、胆固醇Choi与上述制得的DS阳-PEG1000 O-Aln溶于氯仿，加入烧瓶 中，其中各物料的摩尔比为DSPE-阳GlOOOO-Aln:D0TMA:D0PS: Choi = 0.01:1:0.6:0.1;混合 均匀后得到总体积为ImL的第一混合溶液，在4(TC的真空条件下通过旋转蒸发法去除得到 第一混合溶液中的氯仿，在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜，然后将上述烧瓶放置于真空干 燥箱中抽真空地，并真空状态下干燥过夜，得到薄膜材料(脂质体薄层）；
[0117] (3)用pH为7.4的PBS缓冲溶液对上述干燥的薄膜材料进行水化，然后先在功率为 50W下进行40°C的水浴超声40min，使烧瓶壁上的薄膜溶解于PBS溶液中；再采用探针式超声 仪W20kHz的频率和750W的功率进行超声5min，超声间隔为2s，直至溶液呈现蓝色乳光状 态，得到第二混合溶液；
[0118] 将超声后的第二混合溶液于4°C下放置过夜，采用Avanti脂质体挤出器进行粒径 控制，将所述第二混合溶液先采用孔径为0.2WI1的聚碳酸醋膜挤压5次后，再通过孔径为0.1 Ml的聚碳酸醋膜挤压5次，获得骨祀向基因载体。
[0119] 实施例六
[0120] -种骨祀向基因载体的制备方法，包括W下步骤：
[0121] (1)制备阿伦麟酸钢改性的憐脂DS阳-PEG20000-Aln:同实施例1;
[0122] (2)骨祀向基因载体的制备：
[0123] 将D0DAB、BMP、胆固醇化〇1与上述DS阳-PEG20000-Aln溶于氯仿，W各物料的摩尔 比为DSPE-PEG20000-Aln:D0DAB: BMP: Choi = 0.07:2:0.8:0.6;用移液枪准确吸取各组分， 加入烧瓶中，混合均匀后得到总体积为3mL的第一混合溶液，在40°C真空条件下通过旋转蒸 发法去除氯仿，在烧瓶内壁形成一层均匀的薄膜，然后将上述烧瓶放置于真空干燥箱中抽 真空化，并真空状态下干燥过夜，得到薄膜材料(脂质体薄层）；
[0124] (3)用pH为7.4的PBS缓冲溶液对上述干燥的薄膜材料进行水化，然后先在功率为 50W下进行40°C的水浴超声50min，使烧瓶壁上的薄膜溶解于PBS溶液中；再采用探针式超声 仪W20kHz的频率和750W的功率进行超声6min，超声间隔为2s，直至溶液呈现蓝色乳光状 态，得到第二混合溶液；
[0125] 将超声后的第二混合溶液于4°C下放置过夜，采用Avanti脂质体挤出器进行粒径 控制，将所述第二混合溶液先采用孔径为0.2WI1的聚碳酸醋膜挤压4次后，再通过孔径为0.1 Ml的聚碳酸醋膜挤压4次，获得骨祀向基因载体。
[0126] 实施例屯
[0127] -种基因递送系统的制备方法，包括W下步骤：
[012引将实施例一制得的骨祀向基因载体(浓度为0.7mg/mL)与质粒DNA巧体为pSDF-1 质粒DNA)分别溶解在灭菌纯水后，用0.22皿滤膜过滤除菌得到骨祀向基因载体溶液、质粒 DNA溶液，将两种溶液W等体积比进行混合，得到混合溶液，快速吹打上述混合溶液30次，并 在室溫下共同解育30min，获得基因递送系统;其中，所述骨祀向基因载体在混合液中的最 终浓度为0.35mg/mL，所述骨祀向基因载体与所述质粒DNA的氮憐比为4:1，所述基因递送系 统为质粒DNA和上述骨祀向基因载体通过静电作用形成的纳米微球。
[0129] 实施例八
[0130] -种基因递送系统的制备方法，包括W下步骤：
[0131] 将实施例S制得的骨祀向基因载体(浓度为2.0mg/mL)与质粒DNA(具体为peSDF-1 质粒DNA)分别溶解在灭菌纯水后，用0.22皿滤膜过滤除菌得到骨祀向基因载体溶液、质粒 DNA溶液，将两种溶液W等体积比进行混合，得到混合溶液，快速吹打上述混合溶液30次，并 在室溫下共同解育30min，获得基因递送系统;其中，所述骨祀向基因载体在混合液中的最 终浓度为l.Omg/mL，所述骨祀向基因载体与所述质粒DNA的氮憐比为12:1，所述基因递送系 统为质粒DNA和上述骨祀向基因载体通过静电作用形成的纳米微球。
[0132] 效果实施例：
[0133] 1、骨祀向基因载体的祀向效率测定
[0134] 将本发明实施例二制得的巧光骨祀向基因载体与巧光无祀向基因载体使用巧光 分光光度计在激发波长=533nm下，分别检测D0TAP终浓度相同（均为0.7mg/mL)的祀向脂质 体、无祀向脂质体的巧光强度al;
[0135] 取20mg的径基憐灰石(HAP)分散至2血的PBS配成lOmg/血的分散液;将10化上述巧 光祀向脂质体、巧光无祀向脂质体分别与HAP在缓慢震荡下共培养化，在5000rpm下高速离 屯、后，分别检测其上清液的巧光强度曰2,其中：HAP的结合率=(al-a2)/alX100%。祀向效 率的测试结果如图4所示。其中，图4中A为巧光无祀向脂质体的祀向效率图（即结合HAP前 后，上清液的巧光强度变化），图4中B为巧光骨祀向基因载体的祀向效率图。
[0136] 从图4可W明显看出，在巧光骨祀向基因载体与HAP共培养之后，两者高效结合，在 离屯、之后，巧光骨祀向基因载体与HAP的复合物基本位于下层沉淀中，使得上清液的巧光强 度大大降低。由图4可W看出，连接有DSPE-PEG2000-Aln的脂质体与HAP的结合能力显著高 于无祀向脂质体，经计算，其结合率从13.7%提高到61.4%。由于实施例制得的骨祀向基因 载体的外面修饰有阿仑麟酸，而阿仑麟酸钢分子中的双憐酸基能与径基憐灰石高效结合， 也进一步提高了所述骨祀向基因载体对HAP的亲和性，W上结果表明本发明制得的骨祀向 基因载体具有良好的祀向性，也进一步佐证了阿仑麟酸改性的憐脂成功嵌入到脂质体上， 并暴露在外面。
[0137] 2、骨祀向基因载体的细胞相容性研究：
[013引收集C0S-1细胞，WlXlO^孔的细胞浓度分于96孔板，体积lOOuL，边缘孔用无菌 PBS填充。置37 °C、5 % C02溫箱培养使细胞贴壁。
[0139] 将实施例一制得的骨祀向基因载体(起始浓度为0.7mg/mL)用DMEM基础培养基进 行稀释，终浓度分别为2，6，10，50yg/mL，体积为100化。W商业脂质体Lipofectamine 2000 为阳性对照，正常培养的COS-1细胞为空白对照。并设置3个仅含培养液的复孔W扣除背景 吸收。
[0140] 弃去原有培养液，分别加入含各浓度载体药物的培养液，做好标记，放入培养箱培 养48h。然后每孔加入10化的cck-8溶液，继续培养4h。终止培养，使用酶标仪在450皿处测量 各孔的吸光值0D。
[0141] 细胞活性（％) = [00(加药)-0D(背景）]/[00(0 加药)-0D(背景）]X 100%;
[0142] 0D(加药）：含cell、cck-8和骨祀向基因载体(或Lipofectamine 2000)的孔的吸光 值；
[0143] 0D(背景）：仅含DMEM、cck-8的孔的吸光值；
[0144] 0D(空白）：仅含cell、cck-8的孔的吸光值。
[0145] 实验结果显示，实施例一制得的骨祀向基因载体对C0S-1细胞显示出良好的细胞 相容性。当载体的作用浓度高达50yg/mL时，细胞存活率达到91.45%，远远高于阳性对照 Lipofectamine 2000脂质体相同浓度作用下的细胞存活率4.43%。
[0146] 3、骨祀向基因载体的细胞转染效率研究
[0147] (l)GFP质粒转染细胞：
[0148] 将C0S-1细胞（1X105/孔)接种在24孔培养板中，加入0.5mL含有10%胎牛血清的 DMEM培养基，置于C〇2解箱中37 °C下培养过夜。
[0149] 将实施例一制得的骨祀向基因载体(简写为Aln-lipo)用0.22WI1过滤除菌后，用灭 菌纯水稀释后与GFP质粒DNA溶液混合(脂质体与DNA混合的氮憐摩尔比为4:1)，培育30分钟 后得到纳米微球，即基因递送系统。同时W商业脂质体Lipofectamine? 2000作为阳性对 照，也W氮憐摩尔比为4:1与GFP质粒DNA复合，并单纯加质粒DNA为阴性对照。
[0150] 用PBS轻轻洗涂细胞，每孔中加入无血清无抗生素的DMEM培养基0.5mL，W及50化 的W上不同处理药物(Aln-lipo复合的DNA、Lipo2000复合的DNA、单纯的质粒DNA)，每孔的 DNA含量为化g。轻轻摇晃混匀，置于C〇2解箱中37°C解育化。移去转染液，用10%胎牛血清的 DMEM培养基替换转染液，继续培养42h"4她后利用倒置巧光显微镜观察GFP绿色巧光蛋白的 表达，结果见图5。
[0151] 图5的结果表明，本发明制得的骨祀向纳米转基因载体对GFP质粒DNA的转染效率 高于Lipofectamine? 2000。
[0152] (2)pGk3control 转染细胞：
[0153] 将C0S-1细胞（IX 105/孔)接种于24孔培养板，过夜培养至细胞融合度为70%~ 80%时，用PBS洗涂后加入45化L不含抗生素的培养基。将实施例一制得的骨祀向纳米转基 因载体和商业上常用的脂质体Lipofectamine? 2000用0.22皿滤膜进行过滤除菌后，并用 灭菌纯水稀释后，按不同的氮憐比分别与pGk3control质粒DNA溶液混合(其中，实施例1制 得的骨祀向基因载体和pGk3control质粒DNA的氮憐比分别为2:1、4:1、6:1、8:1、10:1、12: 1，Lipofectamine? 2000与pGkScontrol质粒DNA的氮憐比为2:1)，培育30分钟后得到复合 物。将含不同复合物总体积为50化的溶液加入到C0S-1细胞中，每孔的DNA含量为化g。并W 脂质体Lipofectamine 2000为阳性对照，水和单纯加质粒DNA(cDNA)为阴性对照。培养24h 后，吸去转染液后，加入完整培养基继续培养4她后测量pGL3-con化〇1表达的巧光素酶。吸 去培养基用PBS洗涂后，加入15化L的细胞裂解液裂解30分钟后，转移至1.5mL的离屯、管中， 1200化pm高速离屯、5分钟。取50化上清液与50化巧光素酶检测试剂(Promega)反测定相对光 单位。另取20化上清液进行BCA蛋白含量测试。W每毫克蛋白的相对光度值(RLU/mg，巧光素 酶的表达量)作为转染效率的评价指标，结果见图6。
[0154]从图6中可W看出，本发明制备的骨祀向基因载体的纳米复合物对pGk3con化〇1 质粒DNA的转染效率高于Lipofectamine? 2000作为载体时的纳米复合物的转染效率，而且 优选采用骨祀向基因载体与质粒DNA的氮憐比为4:1。
【主权项】
1. 一种骨靶向基因载体，其特征在于，所述骨靶向基因载体为阿仑膦酸钠改性的脂质 体，所述阿仑膦酸钠改性的脂质体包括阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇以及阿仑膦酸钠 改性的磷脂，所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇构成磷脂层，所述阿仑膦酸钠改性的 磷脂穿插于所述磷脂层中并与所述磷脂层形成囊泡结构，所述阿仑膦酸钠暴露在所述磷脂 层之外。2. 如权利要求1所述的骨靶向基因载体，其特征在于，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂包括 聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的阿仑膦酸钠。3. 如权利要求1所述的骨靶向基因载体，其特征在于，所述骨靶向基因载体的粒径为 40-200nm〇4. 如权利要求1所述的骨靶向基因载体，其特征在于，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂与所 述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇的摩尔比为(0.01-0.07) :(1-3) :(0.5-1): (0.1-1)。5. 如权利要求1所述的骨靶向基因载体，其特征在于，所述阳离子类脂包括(2,3_二油 酰基-丙基)_三甲基氯化铵、（2,3_二油氧基丙基)三甲基氯化铵和双十八烷基二甲基溴化 胺中的一种或多种;所述中性辅助类脂包括二油酰磷脂酰乙醇胺和二油酰磷脂酰胆碱中的 一种或两种。6. 如权利要求2所述的骨靶向基因载体，其特征在于，所述聚乙二醇衍生化磷脂是由聚 乙二醇通过共价键和磷脂类物质相连得到，所述聚乙二醇分子的分子量为200~20000道尔 顿。7. -种骨靶向基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将聚乙二醇衍生化磷脂溶于第一溶剂，并加入催化剂、脱水剂活化，再加入溶解在 第一溶剂中的阿伦膦酸钠，在室温下进行酰胺化反应8_12h，得到反应液，将所述反应液经 分离纯化后进行冷冻干燥，得到阿仑膦酸钠改性的磷脂，其中，所述聚乙二醇衍生化磷脂的 羧基与阿仑膦酸钠的氨基的摩尔比为(1-10): 1; (2) 取上述阿仑膦酸钠改性的磷脂，与阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇加入到反应 器中，加入有机溶剂，混合均匀后得到第一混合溶液，通过旋转蒸发法去除所述第一混合溶 液中的溶剂，干燥得到膜状材料； (3) 加入磷酸盐缓冲溶液溶解所述膜材料，并进行超声处理，得到第二混合溶液，将所 述第二混合溶液采用微孔过滤膜来回挤压过滤多次，得到骨靶向基因载体，其中，所述骨靶 向基因载体为阿仑膦酸钠改性的脂质体，所述阿仑膦酸钠改性的脂质体包括阳离子类脂、 中性辅助类脂、胆固醇以及阿仑膦酸钠改性的磷脂，所述阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固 醇构成磷脂层，所述阿仑膦酸钠改性的磷脂穿插于所述磷脂层中并与所述磷脂层形成囊泡 结构，所述阿仑膦酸钠暴露在所述磷脂层之外。8. -种基因递送系统，其特征在于，所述基因递送系统为基因物质和权利要求1所述的 骨靶向基因载体通过静电作用形成的纳米微球，其中，所述骨靶向基因载体与所述基因物 质的氮磷摩尔比为(2-12): 1。9. 一种基因递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 将基因物质和如权利要求1所述的骨靶向基因载体溶解于灭菌水后，得到混合液，然后 室温静置，所述混合液中的骨靶向基因载体和所述基因物质通过静电作用形成纳米微球， 得到所述基因递送系统，其中，所述骨靶向基因载体与所述基因物质的氮磷比为(2-12) :1。10.如权利要求1-6任一项所述的骨靶向基因载体或如权利要求8所述的基因递送系统 在制备基因治疗药物中的应用。
【文档编号】A61K48/00GK106047935SQ201610339273
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】赵晓丽, 郑楚萍
【申请人】中国科学院深圳先进技术研究院