一种提高四环素发酵水平的方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高四环素发酵水平的方法，其特征是：在以金色链霉菌为发酵菌种发酵生产四环素的发酵过程中，将补料培养基的碳源和氮源及其他物质分开灭菌，并根据菌种对碳源和氮源的需求分别补料。本发明通过对以金色链霉菌为发酵菌种发酵生产过程中的补料培养基中的碳源和氮源分别进行灭菌处理，通过该方法获得的物料质量好，减少因糖氮混合灭菌产生有毒物质对菌体的不利影响，增加了糖水的利用效率，提高发酵水平，且补料过程中根据菌种对碳、氮源的需求灵活控制补入量，充分满足生长期菌体生长繁殖及合成对营养的需求，同时可保证碳氮源的高度利用，减少过程补入量，提高发酵单位、同时降低物耗。
【专利说明】
-种提高四环素发酵水平的方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物与新医药技术，特别是设及一种提高四环素发酵水平的方法。
【背景技术】
[0002] 四环素是W金色链霉菌为发酵菌株，发酵生产出来的抗菌物质，对革兰氏阳性菌、 阴性菌、立克次氏体、滤过性病毒、螺旋体W及原虫类都有很好的抑制作用，是一种光谱抗 生素。
[0003] 现有技术中，W金色链霉菌做出发菌株发酵过程中，全程需要补入含大量有机碳、 氮源的混合糖水，由于氮源物质结构复杂，灭菌需要较高的溫度，混合糖水中碳源与氮源混 合在高溫灭菌时容易产生如5径~甲基慷醒类的物质，该物质对菌体的生长有一定的毒害 作用，影响菌体生命力，最终影响发酵水平。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种通过改善发酵过程中补料 培养基质量来有效提高四环素发酵水平的方法。
[0005] 为实现上述发明目的所采取的技术方案为：
[0006] -种提高四环素发酵水平的方法，其特征是:在W金色链霉菌为发酵菌种发酵生 产四环素的发酵过程中，将补料培养基的碳源与氮源及其他物质分开灭菌，并根据菌种对 碳源和氮源的需求分别补料。
[0007] 所述碳源灭菌条件为:灭菌溫度在115~118°C，灭菌时间20~25min。
[000引所述碳源组成为:淀粉250~500g^，淀粉酶:0.25g^。
[0009] 所述氮源及其他物质的灭菌条件为：灭菌溫度在122~126°C，灭菌时间20~ 25min〇
[0010] 所述氮源及其他物质组成为:玉米浆20~40g/l，酵母粉10~20g/l，漠化钢1.25~ 3.75g/l，碳酸巧3.75g~12.5g/l，M-促进剂0.0125~0.025g/l，硫酸锭Ig~2. Og/1。
[0011] 发酵过程中，当发酵液总糖低于5.0%时缓慢流加碳源，根据总糖水平控制补入 量，发酵70小时前控制总糖在5.0~4.0%，发酵71小时后至放罐控制总糖在4.0~2.0。
[0012] 发酵过程中，当碳源补入后10小时左右补入氮源及其他物质，补入量与同期碳源 的补入量相当。
[0013] 发酵过程中，控制pH,其中发酵20小时前控制PH6.1~5.8,发酵21小时后控制 抑5.8-5.6，发酵过程中用氨水调节抑。
[0014] 发酵过程中，采用流加消沫剂或油方式进行消沫。
[0015] 本发明通过对W金色链霉菌为发酵菌种发酵生产过程中的补料培养基中的碳源 和氮源分别进行灭菌处理，通过该方法获得的物料质量好，尤其是碳源（由碳源、氮、无机盐 等物质组成的混合糖水中的碳源)单独进行灭菌，减少因糖氮混合灭菌产生有毒物质对菌 体的不利影响，增加了糖水的利用效率，提高发酵水平，且补料过程中根据菌种对碳、氮源 的需求灵活控制补入量，充分满足生长期菌体生长繁殖及合成对营养的需求，同时可保证 碳氮源的高度利用，减少过程补入量，提高发酵单位、同时降低物耗。实验证明：用此方法灭 菌后的糖水外观颜色清亮，补入发酵罐，菌丝有初性，发酵单位长势较好；由于所补入物料 主要为糖水，糖水成份相对简单，可W稀释发酵液粘度，改善溶氧，发酵单位提高明显。
【具体实施方式】
[0016] 下面用实例予W说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本 发明的限制。本发明的范围与核屯、内容依据权利要求书加 W确定。
[0017] 实验设备：
[001引本发明中种子罐使用某公司BLBZ0~15SJ1化试验罐。
[0019] 发酵罐使用BLBZ0~50SJ型50L试验罐。
[0020] 试验罐全程可检测到溶氧、pH、溫度、揽拌转速等参数。
[0021 ]糖水及混合氮源罐使用本公司自制30L不诱钢试验罐，可通过湿热灭菌操作。
[0022] 下述实施例中，发酵过程中，控制pH,其中发酵20小时前控制抑6.1~5.8,发酵21 小时后控制抑5.8-5.6，发酵过程中用氨水调节pH。
[0023] 发酵过程中，采用流加消沫剂或油方式进行消沫。
[0024] 实施例1
[0025] 1、斜面抱子制备:将金色链霉菌在无菌条件下接种于固体培养基上，35°C恒溫培 养4~5天，接种于种子培养基中。
[0026] 2、种子培养:将步骤1生长好的斜面抱子无菌方式接种于无菌种子培养基中，接种 量为500ml茄形瓶装量的15%，32°C恒溫培养，通气比为0.6~0.8v/v/min，揽拌转速为400 ~600r/min，培养20~26小时。
[0027] 3、发酵培养:将步骤2培养好的种子无菌条件接种于无菌发酵培养基中，接种量为 10~20 %，控制培养溫度0~40hr: 33 °C，41~80hr: 32 °C，80虹~放罐3rC，过程通气比:0.8 ~1.5v/min,保证过程溶氧不低于20%，培养6~8天。
[00巧]4、糖水配制及灭菌：
[00巧]4.1糖水组成：淀粉250g/l，淀粉酶0.25g/l。
[0030] 4.2糖水灭菌:控制灭菌溫度115~118°(：，灭菌时间20~25111111。
[0031 ] 5、混合氮源配制及灭菌：
[0032] 5.1混合氮源组成：玉米浆20g/l，酵母粉lOg/1，漠化钢1.25g/l，碳酸巧3.75g/l， M-促进剂0.0125g/l，硫酸锭lg/1。
[0033] 5.2混合氮源灭菌:控制灭菌溫度122~125°C，灭菌时间20~25min。
[0034] 6、过程补料控制：
[0035] 发酵液总糖低于5.0%，生长20小时左右，补入糖水。生长30小时左右补入混合氮 源，补量与同期糖水补入量相当，控制至放罐(发酵70小时前控制总糖在5.0~4.0%，发酵 71小时后至放罐控制总糖在4.0~2.0)。过程用氨水调节pH。
[0036] 对照例1
[0037] 1、2和3过程同实施例。
[0038] 4、混合糖水(补料培养基)配制及灭菌：
[0039] 4.1混合糖水成份为:淀粉250g^，玉米浆20g/l，酵母粉：10g/l，漠化钢1.25g/l， 碳酸巧3.75g/l，M-促进剂0.0125g/l，硫酸锭lg/1，淀粉酶0.25g/l。按重量体积比配制成 20L，后湿热蒸汽灭菌。
[0040] 4.2混合糖水灭菌:控制灭菌溫度122~125°(：，灭菌20~25111111。
[004。 5、发酵过程总糖低于5.0 %开始补入，70小时前总糖控制在5.0~4.0，71小时后在 4.0~2.0，过程用氨水调节pH。
[0042] 试验结果数据：
[0043] L0044」实验例2
[0045] 1、斜面抱子制备:将金色链霉菌在无菌条件下接种于固体培养基上，35°C恒溫培 养4~5天，接种于种子培养基中。
[0046] 2、种子培养:将步骤1生长好的斜面抱子无菌方式接种于种子培养基中，接种量为 500ml茄形瓶装量的15%，32°C恒溫培养，通气比为0.6~0.8v/v/min，揽拌转速为400~ 600r/min，培养20~26小时。
[0047] 3、发酵培养:将步骤2培养好的种子无菌条件接种于发酵培养基中，接种量为10~ 20 %，控制培养溫度0~40hr: 33 °C，41~80hr: 32 °C，80hr~放罐31°C，过程通气比：0.8~ 1.5v/min,保证过程溶氧不低于20%，培养6~8天。
[004引 4、糖水配制及灭菌：
[0049] 4.1糖水组成:淀粉400g/l，淀粉酶0.25g/l。
[0化0] 4.2糖水灭菌:控制灭菌溫度115~118。(：，灭菌时间20~251]1；[]1。
[0051] 5、混合氮源配制及灭菌：
[0052] 5.1混合氮源组成:玉米浆30g/l，酵母粉：15g/l，漠化钢1.25g/l，碳酸巧3.75g/l， M-促进剂0.0125g/l，硫酸锭 1. Og/1。
[0化3] 5.2混合氮源灭菌:控制灭菌溫度122~125。(：，灭菌时间20~251]1；[]1。
[0化4] 6、过程补料控制：
[0055]发酵液总糖低于5.0%，生长20小时左右，补入糖水。生长30小时左右补入混合氮 源，补入量与同期糖水补入量相当，控制至放罐(发酵70小时前控制总糖在5.0~4.0%，发 酵71小时后至放罐控制总糖在4.0~2.0)。过程用氨水调节pH。
[0化6] 对照例2
[0化7] 1、2和3过程同实施例2。
[005引4、混合糖水(补料培养基)配制及灭菌：
[0059] 4.1混合糖水组成为:淀粉/400g/l，玉米浆30g/l，酵母粉：15g/l、15漠化钢1.25g/ 1，碳酸巧3.75g^，M~促进剂0.0125g/l，硫酸锭lg/1，淀粉酶0.25g/l。按重量体积比配制 成20L，后湿热蒸汽灭菌。
[0060] 4.2混合糖水灭菌:控制灭菌溫度122~125°(：，灭菌20~25111111。
[006。 5、发酵过程总糖低于5.0 %开始补入，70小时前总糖控制在5.0~4.0，71小时后在 4.0~2.0，过程用氨水调节pH。
[0062] 试验结果数据：
[0063]
[0064] 实验例3
[0065] 1、斜面抱子制备:将金色链霉菌在无菌条件下接种于固体培养基上，35°C恒溫培 养4~5天，接种于种子培养基中。
[0066] 2、种子培养:将步骤1生长好的斜面抱子无菌方式接种于种子培养基中，接种量为 500ml茄形瓶装量的15%，32°C恒溫培养，通气比为0.6~0.8v/v/min，揽拌转速为400~ 600r/min，培养20~26小时。
[0067] 3、发酵培养:将步骤2培养好的种子无菌条件接种于发酵培养基中，接种量为10~ 20 %，控制培养溫度0~40hr: 32 °C，41~80hr: 31°C，80hr~放罐30 °C，过程通气比：0.8~ 1.5v/min,保证过程溶氧不低于20%，培养6~8天。
[0068] 4、糖水配制及灭菌：
[0069] 4.1糖水组成:淀粉500g/l，淀粉酶0.25g/l。
[0070] 4.2糖水灭菌:控制灭菌溫度115~118°(：，灭菌时间20~25111111。
[0071 ] 5、混合氮源配制及灭菌：
[0072] 5.1混合氮源组成：玉米浆40g/l，酵母粉：15g/l，漠化钢1.25g/l，碳酸巧4.0g/l， M-促进剂0.0125g/l，硫酸锭lg/1。
[0073] 5.2混合氮源灭菌:控制灭菌溫度123~126°C，灭菌时间20~25min。
[0074] 6、过程补料控制：
[0075] 发酵液总糖低于5.0%，生长20小时左右，补入糖水，生长30小时左右补入混合氮 源，补入量与同期糖水补入量相当，控制至放罐(发酵70小时前控制总糖在5.0~4.0%，发 酵71小时后至放罐控制总糖在4.0~2.0)。过程用氨水调节pH。
[0076] 对照例3
[0077] 1、2和3过程同实施例3。
[0078] 4、混合糖水(补料培养基)的配制及灭菌：
[00巧]4.1混合糖水组成为：淀粉500g^，玉米浆40g/l，酵母粉：15g/l，漠化钢1.25g/l， 碳酸巧4. Og/1，M~促进剂0.0125g/l，硫酸锭，lg/1，淀粉酶0.25g/l。按重量体积比配制成 20L，后湿热蒸汽灭菌。
[0080] 4.2混合糖水灭菌:控制灭菌溫度123~126。(：，灭菌20~25111111。
[OOW] 5、发酵过程总糖低于5.0 %开始补入，70小时前总糖控制在5.0~4.0，70小时后在 4.0~2.0，过程用氨水调节pH。
[0082]试验结果数据：
【主权项】
1. 一种提高四环素发酵水平的方法，其特征是:在以金色链霉菌为发酵菌种发酵生产 四环素的发酵过程中，将补料培养基的碳源与氮源及其他物质分开灭菌，并根据菌种对碳 源和氮源的需求分别补料。2. 按照权利要求1所述的提高四环素发酵水平的方法，其特征在于所述碳源灭菌条件 为:灭菌温度在115~118°〇，灭菌时间20~25111；[11。3. 按照权利要求1或2所述的提高四环素发酵水平的方法，其特征在于所述碳源组成 为：淀粉250~500g/l，淀粉酶:0 · 25g/l。4. 按照权利要求1所述的提高四环素发酵水平的方法，其特征在于所述氮源及其他物 质的灭菌条件为:灭菌温度在122~126°C，灭菌时间20~25min。5. 按照权利要求1或4所述的提高四环素发酵水平的方法，其特征在于所述氮源及其他 物质组成为：玉米浆20~40g/l，酵母粉10~20g/l，溴化钠1 · 25~3 · 75g/l，碳酸钙3 · 75g~ 12 · 5g/l，M-促进剂0 · 0125~0 · 025g/l，硫酸铵lg~2 · Og/Ι。6. 按照权利要求3所述的提高四环素发酵水平的方法，其特征是:发酵过程中，当发酵 液总糖低于5.0%时缓慢流加碳源，根据总糖水平控制补入量，发酵70小时前控制总糖在5.0 ~4.0%，发酵71小时后至放罐控制总糖在4.0~2.0。7. 按照权利要求1或3所述的提高四环素发酵水平的方法，其特征是:发酵过程中，当碳 源补入后10小时左右补入氮源及其他物质，补入量与同期碳源的补入量相当。8. 按照权利要求1所述的提高四环素发酵水平的方法，其特征是:发酵过程中，控制pH， 其中发酵20小时前控制pH6.1~5.8，发酵21小时后控制pH5.8-5.6，发酵过程中用氨水调节 pH。9. 按照权利要求1所述的提高四环素发酵水平的方法，其特征是:发酵过程中，采用流 加消沫剂或油方式进行消沫。
【文档编号】C12P29/00GK106047976SQ201610692920
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月19日
【发明人】章惠霞, 孙瑞君, 张志
【申请人】宁夏启元药业有限公司