一种利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷ck的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷CK的方法，该方法以紫芝为发酵菌，进行发酵培养，发酵至少3天后，添加天然皂苷至发酵液中，持续发酵，得到稀有人参皂苷CK。本发明以紫芝作为发酵菌株、以天然皂苷为底物进行发酵获得的稀有人参皂苷CK，不仅转化率高、而且安全无毒，与其他微生物相比，药食兼用真菌在生物转化合成过程中的安全性更高、生物活性物质产量更大，易于产品的推广。
【专利说明】
-种利用天然皂昔生物转化合成稀有人参皂昔CK的方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物工程和微生物发酵技术领域，尤其设及一种利用天然皂巧生物转 化合成稀有人参皂巧CK的方法。
【背景技术】
[0002] 利用药食兼用真菌生物合成、转化生成的食品功能性分子不仅具有化学合成或其 他微生物生物合成的功能性分子的各类功效，而且还拥有下列优点：（1)相较于化学合成， 使用原料安全无毒，且反应过程副产物安全无毒，产品安全性高；（2)能够较大量的合成化 学方法难W合成的产物；（3)使用菌种安全、可使用，且菌种本身就拥有一定的保健功效； (4)原料在自然界广泛存在且价廉;（5)发酵生产是典型的"绿色"工艺等。
[0003] 稀有人参皂巧compound K(Ginsenoside compound K)(下称CK)是哺乳类动物在 服用人参或者天然人参皂巧后通过肠道的降解作用之后，在血液中检测到的有效物质；其 在天然人参属植物中并不存在，并拥有下列生理活性：（1)对肺癌白血病、肺腺癌、胃癌、肝 癌、前列腺癌、结肠癌、鼻咽癌和脑瘤等多种癌症起到促进癌细胞调亡、抑制癌细胞转移和 抑制肿瘤生长等作用；（2)具有恢复受损的学习和记忆、神经保护作用，并且在神经传递调 节中发挥重要作用；（3)有抗炎症作用，能够抑制炎症因子的释放和调节炎症相关代谢通 路；（4)有抗过敏作用；（5)有保肝作用，能够提高肝细胞损伤模型中肝细胞的存活率。（6)具 有抗关节炎作用；（7)有抗糖尿病、抗血管形成W及一定的抗衰老作用。
[0004] 目前，报道过的，可W转化产生人参皂巧的多种微生物的转化率不尽相同，最高可 达99 %，其产业化前景备受关注。
[0005] 紫芝(Ganoderma sinense)又称黑芝、玄芝、木芝、中国灵芝，是中国特有的珍稀食 药用真菌品种之一。富含多糖、灵芝酸等=祗类物质成分，具有抗衰老、提高机体免疫功能、 保肝护肝、抑制肿瘤等功效。由于其本身含有多糖W及=祗类化合物，其能够产生较多种类 的糖巧酶，故可转化天然皂巧为稀有人参皂巧CK。
[0006] 公开号为CN104140931A的发明专利申请文献公开了一种甘人参皂巧CK的转化合 成方法，包括:将固体培养活化的阿达青霉(PeniciIlium adametzii)3.3203接入液体±豆 培养基中，培养36~7化后加入原人参二醇，于24~32°C条件下发酵培养48~12化，得到发 酵液;从发酵液中分离纯化得到人参皂巧。
[0007] 然而，使用青霉等不可食用或对人体有一定危害的微生物来转化产生人参皂巧 CK，造成产品安全性不能得到完全保障，且分离纯化成本较高，影响产品作为保健功能性成 分在市场中的竞争力。
【发明内容】
[000引本发明提供了一种利用天然皂巧进行生物转化合成稀有人参皂巧CK的方法，该方 法不仅能够转化得到生物活性较高的人参皂巧，而且利用食药同源真菌紫芝进行转化，保 证了产物的安全性，发酵产物中的多种生物活性物质增强发酵产物的保健功能、提高了人 参皂巧的市场价值。
[0009] -种利用天然皂巧生物转化合成稀有人参皂巧CK的方法，W紫芝为发酵菌，进行 发酵培养，发酵至少3天后，添加天然皂巧至发酵液中，持续发酵，得到稀有人参皂巧CK。
[0010] 具体地，所述紫芝为紫芝(Ganoderma sinensis)CGMCC 5.69。
[0011] 具体地，所述天然皂巧为绞股蓝总皂巧、=屯总皂巧、人参总皂巧中的至少一种； =者都含有多种相同皂巧单体，其主要成分较为相似。更优选，所述天然皂巧为绞股蓝总皂 巧。
[0012] 作为优选，W质量百分数计，所述发酵培养的培养基包括W下组分:葡萄糖1.5~ 2.5%，蛋白腺1.5~2%，憐酸二氨钟0.03~0.3%，硫酸儀0.1~0.2%，维生素 B1 0~ 0.005%袖3.0~5.5。
[0013] 作为优选，W每升发酵培养基计，所述天然皂巧的添加量为0.3~5. Og;更优选，所 述天然皂巧的添加量为0.5~2. Og。
[0014] 经试验发现，天然皂巧在发酵过程中的添加时间会对产物的转化率有很大影响。 作为优选，发酵培养4~7天后，添加天然皂巧至发酵液中。更优选，发酵培养6天后。
[0015] 作为优选，所述发酵培养的溫度为10°C~28°C，总发酵天数为8~14天;更优选，溫 度为25°C，总发酵天数为12天。
[0016] 所述紫芝依次经活化、种子培养后，获得种子液，再将种子液接种至发酵培养基 中，进行发酵培养;其中，种子培养基包括W下组分:葡萄糖1.5~2.5%，蛋白腺1.5~2%， 憐酸二氨钟0.03~0.3%，硫酸儀0.1~0.2%，维生素 B1 0~0.005%。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果：
[0018] 本发明W紫芝作为发酵菌株、W天然皂巧为底物进行发酵获得的稀有人参皂巧 CK，不仅转化率高、而且安全无毒，与其他微生物相比，药食兼用真菌在生物转化合成过程 中的安全性更高、生物活性物质产量更大，易于产品的推广。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明利用天然皂巧生物转化合成稀有人参皂巧CK的方法流程图。
[0020] 图2为HPLC检测中标准品的HPLC图谱。
[0021] 图3为实施例1中获得的产物样品的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。W下实施例中所使用的菌种为紫芝 (6曰110(161'111曰8；[]16]1313)〔61撕5.69，购买于中国普通微生物保藏管理中屯、，本发明不设及 菌种的保藏。
[0023] 实施例1
[0024] (1)菌种活化:将配置好的活化培养基进行高溫高压灭菌，冷却并倒好平板，将冷 冻保存的紫芝(Ganoderma sinensis)CGMCC 5.69菌株接种至灭菌后的活化培养基平板上， 在25 °C培养箱中，培养7d，至平板布满菌丝为止，平板备用。
[0025] 其中，活化培养基的成分为:马铃馨浸粉lOg/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，水。
[0026] (2)种子培养:取500mL的锥形瓶，每瓶装入lOOmL的种子培养基，高溫高压灭菌冷 却，挖取1.5cmX 1.5cm的活化后的菌块，接种到装有lOOmL种子培养基的锥形瓶中，在25°C、 旋转式摇床转速为ISOrmp的条件下，培养5d。
[0027] 其中，种子培养基由W下组分构成:葡萄糖20g/L，蛋白腺18g/L，憐酸二氨钟3g/L， 硫酸儀1.5g/L，维生素 B1 0.05g/L，水。
[0028] (3)发酵培养:在化气升罐中加入4.5升发酵培养基，高溫高压灭菌，取上述种子 液，按照500mL种子液/4.化发酵培养基接种到发酵培养基内，在25°C、通气量为4的条件下 发酵培养6d，加入天然皂巧后，转化发酵6d。
[0029] 其中，发酵培养基由W下组分构成:葡萄糖20g/L，蛋白腺18g/L，憐酸二氨钟3g/L， 硫酸儀1.5g/L，维生素 B1 0.05g/L，水，pH值未做调节。
[0030] 其中，天然皂巧采用绞股蓝总皂巧，添加前，先将绞股蓝总皂巧溶解于500ml乙醇， 无菌滤膜过滤除菌，W蠕动累添加入气升罐，添加量为Img/ml发酵培养基，如表1所示。
[0031 ] (4)萃取分离:发酵培养后，取与发酵液等体积的水饱和正下醇，对发酵液进行萃 取2~3次，合并有机相，减压旋蒸，得到稀有人参皂巧CK粗产品;再W适量色谱纯甲醇溶解， 使用HPLC测定CK浓度，实施例1的产量为1.478mg/L，如表1所示。
[0032]表1实施例1发酵培养基中天然皂巧添加情况、CK产量及转化率
[0034] 注:转化率(mg/g)=CK产量(mg)/绞股蓝皂巧添加量(g)
[0035] 实施例2~8
[0036] (1)菌种活化:将配置好的活化培养基高溫高压灭菌冷却，并倒好平板，将冷冻保 存的紫芝(6曰11〇(16^11曰8111611313)〔610：5.69菌株接种至灭菌后的活化培养基平板上，在25 °C培养箱中，培养7d，至平板布满菌丝为止，平板备用。
[0037] 其中，活化培养基的成分为:马铃馨浸粉lOg/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
[0038] (2)发酵培养：取250mL的锥形瓶，每瓶装入50mL的发酵培养基，高溫高压灭菌冷 却，挖取IcmXlcm的活化后的菌块接种到装有50mL种子培养基的锥形瓶中，在25°C、旋转式 摇床转速为18〇1'1119的条件下，培养4(1、5(1、6(1、7(1，后加入天然皂巧至0.5111旨/1111、1.〇111旨/1111、 1.5mg/ml、2. Omg/ml，再转化发酵至总时长为12d。
[0039] 其中，发酵培养基由W下组分构成:葡萄糖20g/L，蛋白腺18g/L，憐酸二氨钟3g/L， 硫酸儀1.5g/L，维生素 B1 0.05g/L，水，pH值未做调节。
[0040] 其中，实施例2~8中的天然皂巧采用绞股蓝总皂巧，添加前，将绞股蓝总皂巧溶解 于5ml50 %乙醇水溶液，无菌滤膜过滤后添加入培养基，添加量为0.5mg/ml、Img/ml、1.5mg/ ml、2mg/ml发酵培养基，如表2所示。
[0041 ] (3)萃取分离测定:发酵培养后，取与发酵液等体积的水饱和正下醇，对发酵液进 行萃取2~3次，合并有机相，减压旋蒸，得到稀有人参皂巧CK粗产品；再W适量色谱纯甲醇 溶解，使用HPLC测定CK浓度，实施例2~8的产量，如表2所示。
[0042]表2实施例2~8发酵培养基中天然皂巧添加情况、CK产量及转化率
[0043]
注:转化率(mg/g)=CK产量(mg)/绞股蓝皂巧添加量(g)
[0044] 由表2的实施例2~8发酵结果可W看出，绞股蓝总皂巧添加量为1.5mg/mL发酵培 养基、在发酵溫度为25°C、摇床转速为18化pm的条件下，发酵6天后加入皂巧的平均转化率 最高，最平均转化率为6.448mg/l;当绞股蓝总皂巧添加量为2mg/mL发酵培养基，发酵6天后 加入皂巧的稀有人参皂巧CK产量最高，平均产量为11.415mg/L。
【主权项】
1. 一种利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷CK的方法，其特征在于，以紫芝为发 酵菌，进行发酵培养，发酵至少3天后，添加天然皂苷至发酵液中，持续发酵，得到稀有人参 皂苷CK。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的紫芝为紫芝(Ganoderma sinensis) CGMCC 5.69〇3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天然皂苷为绞股蓝总皂苷、三七总皂苷、 人参总皂苷中的至少一种。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述天然皂苷为绞股蓝总皂苷。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，以质量百分数计，所述发酵培养的培养基，包 括以下组分:葡萄糖1.5~2.5%，蛋白胨1.5~2%，磷酸二氢钾0.03~0.3%，硫酸镁0.1~ 0.2%，维生素 Β1 0~0·005%，ρΗ 3.0~5.5。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，以每升发酵培养基计，所述天然皂苷的添加 量为0.1~5. Og。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养4~7天后，添加天然皂苷至发酵液 中。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为10°C~28°C，总发酵 天数为8~14天。9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述紫芝依次经活化、种子培养后，获得种子 液，再将种子液接种至发酵培养基中，进行发酵培养;其中，种子培养基包括以下组分:葡萄 糖1.5~2.5%，蛋白胨1.5~2%，磷酸二氢钾0.03~0.3%，硫酸镁0.1~0.2%，维生素 B10 ~0.005%〇
【文档编号】C12P33/20GK106047978SQ201610394273
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】陈启和, 吴嘉南, 牛永武, 胡竞进
【申请人】浙江大学