一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，属于药敏检测技术领域，包括培养液、稀释液、矿物油和检测板，所述培养液中含有胰蛋白胨、NaCl、Na2HPO4、氯硝胺、硫酸铵、标准小牛血清、硫酸亚铁、氯化钾、卵黄液、蔗糖、葡萄糖、万古霉素、氯霉素、溴甲粉紫；所述检测板上设置有真菌鉴别孔和抗生素药敏检测孔。本发明的试剂盒在所用的培养液中添加了蔗糖、葡萄糖高效生长因子等有效成分，从而可以保证真菌快速生长，使真菌在24h内完成培养，能在24小时出结果，大大缩短了临床检测的周期，有利于患者早期的诊断和治疗。
【专利说明】
一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及药敏检测技术领域，特别涉及一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂合
ΙΤΓΤ.0
【背景技术】
[0002]真菌(fungus)原归属植物界，现代分类系统则将其单立为一界。真菌与细菌不同，具有真正的核膜，能产生孢子，没有叶绿素，产生分枝的菌丝，细胞壁有甲壳质或纤维素。临床上将致病性真菌分为浅部真菌和深部真菌两类，前者侵犯皮肤、毛发、指甲，对治疗有顽固性，但对身体影响较小。后者可侵犯全身内脏，严重者可引起死亡。深部真菌是侵犯皮下组织和内脏，引起全身性感染的真菌，这类真菌主要是念珠菌属和新型隐球菌属。念珠菌属广泛存在于自然界中，大约150个种，是一种条件致病菌，临床上最常见的致病念珠菌感染包括:白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌和其他念珠菌。正常机体中念珠菌的少量存在不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式(芽生菌丝相)侵入细胞引起疾病。可引起:皮肤念珠菌病;黏膜念珠菌病；内脏及中枢神经念珠菌病，可由黏膜皮肤等处病菌播散引起，如肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑炎等，偶尔也可发生败血症。新型隐球菌对于人类而言为条件致病菌，本菌多由呼吸道转入，在肺部引起轻度炎症，或隐性传染，也可由受损皮肤及肠道传入，当机体免疫功能下降时可向全身播散，主要侵犯中枢神经系统，发生脑膜炎、脑炎、脑肉芽肿等，也可入侵骨骼、肌肉、淋巴结、皮肤黏膜，引起慢性炎症和脓肿。如隐球菌脑膜炎在使用二性霉素B之前，病死率高达90%以上。
[0003]目前进行真菌检测的方法主要是培养方法，而鉴定和药敏均需要先进行分离培养，然后再进行鉴定和药敏，而直接用临床标本进行鉴定和药敏的试剂盒却几乎没有。临床真菌的诊断通常是:先用平板培养1-3天进行纯化培养，然后通过变色平板或全自动仪器进行鉴定，然后再通过MH平板纸片法分析其抗生素敏感情况，其前后诊断时间一般在4天以上，对操作人员要求高，并且麻烦，费时费力，成本高，不适合临床的快速诊断治疗，容易贻误病情。
[0004]另外，真菌最容易发生变异的微生物，变异后的菌往往给鉴定带来很大的困难，这也造成当今真菌鉴定混乱的原因之一。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，解决现有的真菌药敏检测培养时间长、鉴定针对性不强的问题。
[0006]为解决上述技术问题，本发明的技术方案为:
[0007]—种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，包括培养液、稀释液、矿物油和检测板，所述培养液中含有胰蛋白胨0.3?2.0%、似(:10.6?0.8%、似2邢040.05?0.4%、氯硝胺0.03?0.08%、硫酸铵0.1?0.2%、标准小牛血清10.0?30.0%、硫酸亚铁0.001?0.005%、氯化钾0.0I?0.05%、卵黄液5.0?15.0%、鹿糖0.5?1.5%、葡萄糖0.1?0.5%、
0.001 %万古霉素、氯霉素0.01?0.08 %、溴甲粉紫0.05-0.2%；所述检测板上设置有真菌鉴别孔和抗生素药敏检测孔。
[0008]其中，优选地，所述稀释液为浓度为0.5?1.0%的NaCl水溶液。
[0009]其中，优选地，所述真菌鉴别孔包含有白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新型隐球菌中的一种以上的真菌鉴别孔。
[0010]其中，优选地，所述抗生素药敏检测组包括多组药敏检测单元，每组药敏检测单元包括两个药敏微孔。
[0011]其中，优选地，同一组药敏检测单元的两个药敏微孔内盛装有不同浓度的同一药物。
[0012]其中，优选地，所述药敏微孔盛装的药物为酮康唑、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶特比奈酚和伏力康唑。
[0013]其中，优选地，所述矿物油为液体石蜡油。
[0014]本发明是把培养与生化反应相结合，真菌具有分解葡萄产酸的能力，使培养液的PH降低，根据酸碱指示剂指示的颜色变化判断结果。抗生素药敏检测孔内若检测的真菌对包被的抗生素敏感，其酶活性受到抑制，不会引起颜色变化。
[0015]本发明的有益效果:
[0016]1.本发明的试剂盒、敏感、快速，在所用的培养液中添加了蔗糖、葡萄糖高效生长因子等有效成分，从而可以保证真菌快速生长，使真菌在24h内完成培养，能在24小时出结果，大大缩短了临床检测的周期，有利于患者早期的诊断和治疗。
[0017]2.本发明的试剂盒特异性强，适合目前的真菌菌种，且不适合其它支原体和其它细菌的生长，通过本发明中培养液，同时加入不影响支原体生长的万古霉素和氯霉素，将其它杂菌抑制或杀灭。
[0018]3.本发明试剂盒可同时对多种抗生素进行药敏试验，涵盖面广，临床适应性强。
[0019]4.本发明试剂盒培养与药敏同步进行，方便快捷，更有有效治疗临床检测与治疗。
【具体实施方式】
[0020]下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0021]实施例1
[0022]本实施例提供一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，包括培养液、稀释液、液体石蜡油和检测板，所述培养液中含有胰蛋白胨0.3 % ,NaCl 0.8% ^Na2HPO4 0.05%,氯硝胺0.08%、硫酸铵0.1 %、标准小牛血清30.0 %、硫酸亚铁0.001%、氯化钾0.05%,卵黄液5.0%、蔗糖1.5%、葡萄糖0.1%、万古霉素0.001%、氯霉素0.08%、溴甲粉紫0.05%;所述检测板上设置有真菌鉴别孔和抗生素药敏检测孔。
[0023]其中，所述稀释液为浓度为0.8%的NaCl水溶液。
[0024]其中，所述真菌鉴别孔包含有白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新型隐球菌中的一种以上的真菌鉴别孔。
[0025]其中，所述抗生素药敏检测组包括七组药敏检测单元，每组药敏检测单元包括两个药敏微孔。同一组药敏检测单元的两个药敏微孔内盛装有不同浓度的同一药物。
[0026]其中，所述药敏微孔盛装的药物为酮康唑、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、特比奈酚和伏力康唑。
[0027]实施例2
[0028]本实施例提供一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，包括培养液、稀释液、液体石蜡油和检测板，所述培养液中含有胰蛋白胨1.0%、NaCl 0.7%, Na2HPO4 0.2%、氯硝胺0.05%、硫酸铵0.15%、标准小牛血清20%、硫酸亚铁0.003%、氯化钾0.03 %、卵黄液10.0%、蔗糖1.0%、葡萄糖0.3%、万古0.001%霉素、氯霉素0.05%、溴甲粉紫0.1%;所述检测板上设置有真菌鉴别孔和抗生素药敏检测孔。
[0029]其中，所述稀释液为浓度为0.5%的NaCl水溶液。
[0030]其中，所述真菌鉴别孔包含有白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新型隐球菌中的一种以上的真菌鉴别孔。
[0031]其中，所述抗生素药敏检测组包括六组药敏检测单元，每组药敏检测单元包括两个药敏微孔。同一组药敏检测单元的两个药敏微孔内盛装有不同浓度的同一药物。
[0032]其中，所述药敏微孔盛装的药物为酮康唑、咪康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶、特比奈酚和伏力康唑。
[0033]实施例3
[0034]本实施例提供一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，包括培养液、稀释液、液体石蜡油和检测板，所述培养液中含有胰蛋白胨2.0%、NaCl 0.6%, Na2HPO4 0.4%、氯硝胺0.03%、硫酸铵0.2%、标准小牛血清10.0%、硫酸亚铁0.005%、氯化钾0.01 %、卵黄液15.0%、蔗糖0.5%、葡萄糖0.5%、0.001%万古霉素、氯霉素0.01%、溴甲粉紫0.02%;所述检测板上设置有真菌鉴别孔和抗生素药敏检测孔。
[0035]其中，所述稀释液为浓度为1.0%的NaCl水溶液。
[0036]其中，所述真菌鉴别孔包含有白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新型隐球菌中的一种以上的真菌鉴别孔。
[0037]其中，所述抗生素药敏检测组包括五组药敏检测单元，每组药敏检测单元包括两个药敏微孔。同一组药敏检测单元的两个药敏微孔内盛装有不同浓度的同一药物。
[0038]其中，所述药敏微孔盛装的药物为伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶特比奈酚和伏力康唑。
[0039]实施例4
[0040]本实施例提供一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，包括培养液、稀释液、液体石蜡油和检测板，所述培养液中含有胰蛋白胨1.2%、NaCl 0.7%, Na2HPO4 0.3%、氯硝胺0.06%、硫酸铵0.14%、标准小牛血清25.0 %、硫酸亚铁0.002%、氯化钾0.04%、卵黄液12%、蔗糖1.2%、葡萄糖0.2%、0.001%万古霉素、氯霉素0.06%、溴甲粉紫0.15%;所述检测板上设置有真菌鉴别孔和抗生素药敏检测孔。
[0041 ] 其中，所述稀释液为浓度为0.7%的NaCl水溶液。
[0042]其中，所述真菌鉴别孔包含有白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新型隐球菌中的一种以上的真菌鉴别孔。
[0043]其中，所述抗生素药敏检测组包括七组药敏检测单元，每组药敏检测单元包括两个药敏微孔。同一组药敏检测单元的两个药敏微孔内盛装有不同浓度的同一药物。
[0044]其中，所述药敏微孔盛装的药物为酮康唑、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶特比奈酚和伏力康唑。
[0045]上述实施例的真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒制备方法如下:
[0046](I)培养液的制备:按配比称取胰蛋白胨、NaCl、Na2HP04、氯硝胺、硫酸铵、标准小牛血清、硫酸亚铁、氯化钾、卵黄液、蔗糖、葡萄糖、万古霉素、氯霉素、溴甲粉紫，振荡使溶解，调节pH值7.4 ± 0.2，0.22μηι微孔滤膜过滤，即得。
[0047](2)鉴别药敏板的制备:白色念珠菌鉴定孔中包被有5_40g/l的葡萄糖和100mg/l的放线菌酮;热带念珠菌鉴定孔中包被有5-40g/l松三糖和lmg/1的氟康唑;克柔念珠菌鉴定孔中包被有5_40g/l乳糖，20mg/l的氟康唑;光滑念珠菌鉴定孔中包被有5-50g/l海藻糖，lmg/1的伏立康唑;季也蒙念珠菌鉴定孔中包被有5-40g/l的棉子糖;新型隐球菌鉴定孔中包被有5_40g/l的葡萄糖和0.013mg/l的卡泊芬净。每孔的包被量为lOOul。
[0048](3)药敏微孔液:以国有临床实验室标准化委员会(NCCLS)公布的判定药物敏感MIC值为低浓度标准(L)、耐受MIC值为高浓度标准(H)，以甲醇为稀释剂，分别配制7种药物的14种浓度;50μI/孔加至特定微孔中，干燥、封装，即得。
[0049]使用该试剂盒检测真菌的检测方法，包括以下步骤:
[0050]将样本拭子放入培养管的培养液中充分洗脱挤干；
[0051]再将培养液以100微升每孔(ul/孔)的量加入至药敏鉴别板的微孔中
[0052]将矿物油以I滴每孔的量添加至各个微孔中；
[0053]将试剂盒放置在35°C?37°C的环境下培养24小时，根据微孔颜色变化判定结果。
[0054]对上述试剂盒进行了质量评价，其中，重复性试验总符合率在96%以上，稳定性试验表该试剂在_20°C下保存6个月稳定性良好。
[0055]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，其特征在于:包括培养液、稀释液、矿物油和检测板，所述培养液中含有胰蛋白胨0.3?2.0 %、NaC10.6?0.8 % ,Na2HPO4 0.05?0.4%、氯硝胺0.03?0.08%、硫酸铵0.1?0.2%、标准小牛血清10.0?30.0%、硫酸亚铁0.001?0.005%、氯化钾0.01?0.05%、卵黄液5.0?15.0%、蔗糖0.5?1.5%、葡萄糖0.1?0.5 %、万古霉素0.001%,氯霉素0.0I?0.08 %、溴甲粉紫0.05-0.2% ；所述检测板上设置有真菌鉴别孔和抗生素药敏检测孔。2.根据权利要求1所述的一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，其特征在于:所述稀释液为浓度为0.5?1.0%的NaCl水溶液。3.根据权利要求1所述的一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，其特征在于:所述真菌鉴别孔包含有白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新型隐球菌中的一种以上的真菌鉴别孔。4.根据权利要求1所述的一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，其特征在于:所述抗生素药敏检测组包括多组药敏检测单元，每组药敏检测单元包括两个药敏微孔。5.根据权利要求4所述的一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，其特征在于:同一组药敏检测单元的两个药敏微孔内盛装有不同浓度的同一药物。6.根据权利要标5所述的一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，其特征在于:所述药敏微孔盛装的药物为酮康唑、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶特比奈酚和伏力康唑。7.根据权利要求1所述的一种真菌快速培养、鉴定与药敏的试剂盒，其特征在于:所述矿物油为液体石蜡油。
【文档编号】C12Q1/04GK106047981SQ201610671944
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月15日 公开号201610671944.0, CN 106047981 A, CN 106047981A, CN 201610671944, CN-A-106047981, CN106047981 A, CN106047981A, CN201610671944, CN201610671944.0
【发明人】李 杰
【申请人】郑州点石生物技术有限公司