一种醇脱氢酶的高通量筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种醇脱氢酶的高通量筛选方法。提供了一种利用脂肪族或芳基取代的酮与2,4?二硝基苯肼在碱性条件下进行显色反应，并在96孔板中建立了针对脂肪族或芳基取代的酮醇脱氢酶的高通量筛选方法。本发明使用深孔板进行微型化细胞培养，不需要对细胞进行破壁处理，突破了传统通过检测额外添加的昂贵辅酶NAD(P)H吸光度变化的筛选方式，具有成本低廉，操作简便，反应灵敏，检测准确，对设备要求低，通用性强的特点，能够快速对检测整细胞样品中醇脱氢酶的活性和反应转化率进行测定。CCTCC NO: M201138520111111
【专利说明】
-种醇脱氨酶的高通量筛选方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种酶的筛选方法，特别设及一种醇脱氨酶的高通量筛选方法，属于 生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 手性醇是公认的有机合成中非常重要且应用广泛的中间体，许多药物都W手性醇 为主要搁块单元，例如抗组胺药物苯横酸贝他斯汀，降血脂药立普妥和抗血小板凝集素氯 化格雷等。不对称还原前手性幾基化合物合成手性醇是原子经济性最高、最具应用开发潜 力的策略。
[0003] 醇脱氨酶(Alcohol dehy化ogenase，简称ADH)是生物体内重要的氧化还原酶，能 够可逆地催化幾基基团的还原和径基基团的氧化，在生物催化和生物医药领域都有广泛地 应用。醇脱氨酶可催化幾基还原，合成对应的醇，特别是立体选择性地合成手性醇类化合 物。
[0004] 许多天然醇脱氨酶在工业化生产过程中存在成本高、活性低、稳定性差等缺点，审U 约了醇脱氨酶在规模化生产中的应用。随着基因工程和蛋白质工程的不断发展，可W对醇 脱氨酶的活性、对映体选择性、稳定性等进行改造，获得性能优良的突变株，使其更适用于 工业化生产的要求。常用的高通量筛选醇脱氨酶方法是监测反应体系在340nm波长下吸光 值的变化，原理在于脱氨酶依赖于辅酶NAD(P化提供还原力，而NAD(P化在340nm处有特征吸 收峰。运一检测方法需要对细胞进行冻融、溶菌酶破壁或超声破碎处理等W使胞内的酶释 放;测定过程需要消耗价格昂贵的辅酶；由于运是一种对底物消耗的间接的测定方法，在对 于NADH依赖型的醇脱氨酶筛选过程中，通常因具有较高的本底消耗而导致筛选过程出现假 阳性。因此常见的醇脱氨酶高通量筛选方法存在费用昂贵、操作复杂、不适用于整细胞筛选 和背景干扰较大等缺点。
[0005] 脂肪族或芳基取代的酬含有的幾基能够与2,4-二硝基苯阱反应生成对应的2,4- 二硝基苯腺，在碱性环境下呈红至红栋色。利用醇脱氨酶可催化脂肪族或芳基取代酬的还 原，通过测定反应体系中残余酬的含量计算被醇脱氨酶还原的酬的量，从而获得醇脱氨酶 的催化活力（附图1)。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服现有醇脱氨酶筛选过程中存在的辅酶成本高、背景干扰 大和不适用于整细胞筛选等缺点。
[0007] 实现本发明的技术方案是：
[000引本发明提供了一种醇脱氨酶的高通量筛选方法，运是一种基于深孔板的微型化培 养及基于脂肪族或芳基取代的酬与幾基检测试剂2,4-二硝基苯阱偶联显色的筛选方法。具 体方法如下：
[0009]将含有醇脱氨酶基因的大肠杆菌的单菌落稀释后接种于装有液体培养基的深孔 板中，于30~40°C下，100~15化pm的摇床中培养6~12h;然后转接至新的含有培养基的深 孔板中，于30~40°C下，100~15化pm的摇床中培养1~化，加入终浓度为0.2mM IPTG(异丙 基-e-D硫代化喃半乳糖巧），于20~30°C，100~15化pm的摇床中继续培养5~lOh;将深孔板 低溫离屯、后去除上清液，加入50~2(K)化含有脂肪族或芳基取代的酬、葡萄糖及葡萄糖脱氨 酶的缓冲液重新悬浮细胞，之后在30~40°C下，100~15化pm的摇床中反应10~60min;将2， 4-二硝基苯阱溶液加入酶促反应液中显色5~30min，再加入K0H或NaO田容液显色，测定特征 吸收波长下吸光值，W未加入细胞或酶液的样本作为阴性对照，吸光值与阴性对照组相差 越大即表示脱氨酶的活力越高。
[0010] 本发明中所使用的显色试剂2,4-二硝基苯阱为一种幾基检测试剂，可W与含有幾 基的脂肪族或芳基取代的酬反应生成对应的苯腺化合物，并在碱性条件下显示红至红栋 色，该物质在500~550nm下有特征吸收峰。本方法即是通过测定酶促反应体系中残余的脂 肪族或芳基取代的酬与2,4-二硝基苯阱反应后在碱性环境下形成的红至红栋色化合物完 成高通量筛选，本发明所述方法可W快速鉴定待筛选微生物菌株或脱氨酶的活性。
[0011] 本发明方法可用于未知样品中醇脱氨酶的筛选，待测样品为微生物或酶液。醇脱 氨酶的单克隆菌落，来源于对原始基因序列进行人工突变后或随机突变获得的单克隆菌落 的突变体，或未经突变的含醇脱氨酶的菌落。
[0012] 本发明也可用于已知微生物或酶液可催化还原脂肪族或芳基取代的酬底物谱的 鉴定。
[0013] 所述培养基为:膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物5g/L，氯化钢lOg/L，自然抑，12rc灭 菌20min。
[0014] 所述的深孔板可W是6孔板、12孔板、48孔板、96孔板。深孔板=明治盖从上之下依 次由带孔不诱钢盖、除菌微滤膜片和硅胶孔垫=层组成，不诱钢盖及硅胶孔垫的孔与深孔 板的深孔对应，W保证各微孔独立地与外界交换空气。深孔板中培养基装液量为深孔板孔 容积的10~30 %。
[0015] 所述酬为脂肪族或芳基取代的酬，其中优选为下列之一 :4-氯苯基-化晚-2-基-甲 酬、二苯酬、苯基苯乙酬、4-氯二苯甲酬、2,4'-二氯二苯甲酬、3,4'-二氯二苯甲酬、4,4'-二 氯二苯甲酬、苯甲酬、4-氯苯乙酬、4-氨基苯乙酬、2-糞乙酬、2-下酬、2,3-下二酬、2,3-戊二 酬、2,3-己二酬、2,5-己二酬。
[0016]所述缓冲液为抑5.0~9.0的憐酸氨二钟-憐酸二氨钟缓冲液，其中优选为pH6.5 ~7.0的。
[0017] 所述2，4-二硝基苯阱溶液的浓度为1~5 %的硫酸或盐酸溶液，其中2，4-二硝基苯 阱的浓度为2~20mM。
[0018] 所述碱液为K0H或NaOH，所述碱液的浓度为0.5~2.5M。
[0019] 底物与产物的具体分析条件为：使用Daicel Chiralcel 0B-H(5wii，250mmX 4.6mm)液相色谱柱，流动相为正己烧:异丙醇(90:10，v/v)。流速ImL/min，柱溫30°C，紫外检 测波长254nm，进样量5~15化.
[0020] 筛选效果的判断：（1)初筛:未加入细胞或酶液的样本的阴性对照组颜色为红至红 栋色，加入含醇脱氨酶细胞的实验组随着反应的进行，体系的颜色为栋黄至浅黄色，筛选出 比对照颜色浅的含醇脱氨酶细胞或酶液。（2)复筛:在初筛获得的含醇脱氨酶细胞中，选出 单位时间内在对应苯腺化合物最大吸收波长下吸光度变化量最大的醇脱氨酶的细胞或酶 液。
[0021 ]本发明的积极效果在于：（1)使用深孔板进行微型化培养，实现了高通量培养和筛 选；（2)突破了传统通过检测额外添加的昂贵辅酶NAD(P)H吸光度变化的筛选方式，具有成 本低廉，操作简便，反应灵敏，检测快速准确，背景干扰低和对设备要求低；（3)同时适用于 酶液和细胞体系的高通量筛选，通用性强，能够快速对检测细胞或酶液样品中醇脱氨酶的 活性进行测定，为醇脱氨酶的高通量筛选提供了便利。
【附图说明】
[0022] 图1显色法醇脱氨酶高通量筛选的原理示意图
[0023] 图2酶促反应体系各成分全波长扫描图；
[0024] 图3 4-氯苯基-化晚-2-基-甲酬的标准曲线；
[0025] 图4二苯基甲酬的标准曲线；
[00%]图5苯基苯乙酬的标准曲线；
[0027]图6 4-氯二苯基甲酬的标准曲线；
[002引图7 2,4'-二氯二苯基甲酬的标准曲线；
[00巧]图8 3,4'-二氯二苯基甲酬的标准曲线；
[0030] 图9 4,4'-二氯二苯基甲酬的标准曲线；
[0031] 图10苯乙酬的标准曲线；
[0032] 图11 4-氯苯乙酬的标准曲线；
[0033] 图12 4-氨基苯乙酬的标准曲线；
[0034] 图13 2-糞乙酬的标准曲线；
[0035] 图14 2-下酬的标准曲线；
[0036] 图15 2,3-下二酬的标准曲线；
[0037] 图16 2,3-戊二酬的标准曲线；
[003引图17 2,3-己二酬的标准曲线；
[0039] 图18 2,3-己二酬的标准曲线；
[0040] 图19显色法和液相法测得的酶促反应过程反应体系中残余4-氯苯基-化晚-2-基- 甲酬浓度的比较；
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围不仅限于此： 实施例1:W含有还原4-氯苯基-化晚-2-基-甲酬脱氨酶的微生物为例，对酶促反应体系中 各成分与2,4-二硝基苯阱生成的红至红栋色苯腺化合物进行全波长扫描
[0042] 为了准确测定酬与2,4-二硝基苯阱生成的红至红栋色苯腺化合物的含量，本发明 分别测定了反应体系中各种化合物与2,4-二硝基苯阱的特征吸收波长。具体操作方法是将 4-氯苯基-化晚-2-基-甲酬(CPMK)，葡萄糖，葡萄糖酸-丫-内醋，4-氯苯基-化晚-2-基-甲 醇(CPMA)，葡萄糖脱氨酶和NADPH等配制成浓度为0.5mM的溶液或按反应需求量添加，吸取 100化于2mL的EP管中，加入10化L 2，4-二硝基苯阱溶液(20mM，含0.3 %硫酸），在摇床中30 °C，120巧m反应30min后加入ImL KOH溶液（1. OM)和0.8mL去离子水。使用酶标仪对样品在 300~7(K)nm波长范围内进行光吸收扫描。全波长扫描图见图2,可见CPMK与显色剂2,4-二硝 基苯阱反应后在碱性条件下生成的红栋色化合物在500nm波长处有特征吸收峰，葡萄糖，葡 萄糖酸-丫-内醋，CPMA，葡萄糖脱氨酶和NADPH等不能与显色剂2,4-二硝基苯阱反应，因此 选择500nm为测量波长。实施例3:显色法测定几种脂肪族或芳基取代的酬的标准曲线方法
[0043] 配制0.5~5mM的CPMK、二苯酬、苯基苯乙酬、4-氯二苯基甲酬、2，4 ' -二氯二苯基甲 酬、3,4'-二氯二苯基甲酬、4,4'-二氯二苯基甲酬、苯乙酬、4-氯苯乙酬、4-氨基苯乙酬、2- 糞乙酬、2-下酬、2，3-下二酬、2，3-戊二酬、2，3-己二酬、2，5-己二酬溶液，依次吸取10化L的 溶液加入2血的EP管中，加入10化L 2，4-二硝基苯阱溶液(20mM，含0.3 %硫酸），在摇床中30 °C，120巧m反应30min后加入ImL K0H溶液（1.0M)和0.8mL去离子水，测定十六种酬样品在 500nm处的吸光值的高低，绘制不同浓度的酬与吸光值的线性关系（附图3~17)。可见到所 测几种脂肪族或芳基取代的酬在一定浓度范围内与500nm波长吸光值之间具有良好的线性 关系，符合朗伯-比尔定律。
[0044] 实施例4:显色法和液相检测方法一致性的比较
[0045] 实验室保藏的菌株Kluyveromyces SP.CCTCC 12011385(保藏于中国典型培养物 保藏中屯、(CCTCC)，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号NO. :M2011385，保藏日期： 2011年11月11日）是已证实含有醇脱氨酶的菌株。W终浓度2mM CPMK为底物，2.5mM葡萄糖 为辅底物溶于pH 7.0的憐酸二氨钟-憐酸氨二钟缓冲液（lOmL，lOOmM)，加入Kluyveromyces SP.CCTCC M2011385湿细胞(0.2g/10mL)，每隔20min取样 100化，加入 100化 2,4-二硝基苯 阱溶液（20mM，含0.3 %硫酸），在摇床中30 °C，120rpm反应30min后加入ImL K0H溶液（1.0M) 和0.8mL去离子水，测定运些样品在500皿处的吸光值。根据CPMK浓度与500皿波长吸光值之 间的线性回归标准曲线，计算酶促反应体系中残余CPMK浓度，同时通过液相色谱法测定同 一样品中CPMK的浓度，具体分析条件为：使用Daicel畑iralcel 0B-H(5wii，250mmX 4.6mm)液相色谱柱，流动相为正己烧:异丙醇(90:10，v/v)。流速ImL/min，柱溫30°C，紫外检 测波长254nm，进样量10化，验证显色法与HPLC方法的一致性。由图18可见两种检测方法数 据具有较高的吻合度。
[0046] 实施例5:产CPMK还原活性醇脱氨酶的微生物的筛选
[0047] 取一 96孔深孔板，每孔容积2.5mL，每孔加入40化L培养基，培养基成分为:膜蛋白 腺lOg/L，酵母提取物5g/L，氯化钢10g/L，12rC灭菌20min，待冷却后加入终浓度为50iig/mL 硫酸卡那霉素。挑取含有醇脱氨酶的大肠杆菌单菌落接种于深孔液体培养基中，其中1#菌 株为原始菌株，于37°C下，120rpm的摇床中培养12h;然后转接至新的含有培养基的深孔板 中，于37°C下，120rpm的摇床中培养化，加入终浓度为0.2mM IPTG(异丙基-0-D硫代化喃半 乳糖巧），于30°C，120rpm的摇床中继续培养化;将深孔板低溫离屯、后去除上清液，加入10化 L含有CPMK(2. OmM)、葡萄糖(2.5mM)的缓冲液重新悬浮细胞，之后在30°C下，120巧m的摇床 中反应30min;将10化L 2，4-二硝基苯阱溶液(20mM，含0.3 %硫酸)加入酶促反应液中显色 30min，再加入1血K0田容液（1.0M)显色和8(K)化去离子水，测定500皿波长的吸光值。W未加 入细胞或酶液的样本作为阴性对照，获得与阴性对照500nm波长吸光值相差最大的实验组， 对应编号分别为2#，36#，69#，它们与阴性对照组在500nm波长吸光值分别为：
[004引表1显色法筛选醇脱氨酶产生菌结果
[0化0] 通过w上检测结果，计算出1#原始菌株每克湿细胞酶活为95.6U，2#，36#，69#菌株 每克湿细胞酶活分别为180U，160U和220U，分别是原始对照菌株酶活的1.88倍，1.67倍和 2.30 倍。
[0化1 ] 实施例6:显色法测定产醇脱氨酶微生物的底物谱
[0化2] 使用实验室保藏的醇脱氨酶的产生菌Kluyveromyces SP.CCTCC M2011385,分别 W终浓度2mM 2-下酬、苯乙酬、4-氯苯乙酬、4-氨基苯乙酬、2，3-下二酬、2，3-己二酬、2，3- 戊二酬、2,5-己二酬、2-糞乙酬、2,4'-二氯二苯基甲酬、苯基苯乙酬、4-氯二苯基甲酬、二 苯基酬、4，4 二氯二苯基甲酬、3，4 二氯二苯基甲酬、4-氯苯基-化晚-2-基-甲酬溶液为 底物，2.5mM葡萄糖为辅底物溶于抑7.0的憐酸二氨钟-憐酸氨二钟缓冲液（lOmL，lOOmM)， 加入Kluyveromyces SP.CCTCC M2011385湿细胞（0.2g/10mL)，在摇床中30°C，120巧m反应 30min后将10化L 2,4-二硝基苯阱溶液(20mM，含0.3%硫酸)加入酶促反应液中显色30min， 再加入ImL K0田容液（1.0M)显色和80化L去离子水，测定500nm波长吸光值，根据所测定十六 种脂肪族或芳基取代的酬浓度与50化m波长吸光值之间的线性回归标准曲线，计算酶促反 应体系中残余脂肪族或芳基取代的酬浓度，从而得到Kluyveromyces sp. CCTCC M2011385 湿细胞还原十六种脂肪族或芳基取代酬的底物特异性。
[0053]表2Kluyveromyces SP.CCTCC M2011385湿细胞的底物特异性
[0化4]
[0055] 通过W上分析结果显示，Kluyveromyces sp.CCTCC M2011385的醇脱氨酶对芳基 取代的酬具有较高的催化活性。
[0056] 上述结果表明，该显色法可W适用于整细胞水平的高通量筛选和酶的表征。
[0057] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可W对本发明做各种 改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种醇脱氢酶的高通量筛选方法，其特征在于按如下步骤进行： (1) 将含有醇脱氢酶产生菌接种于装有液体培养基的深孔板中，在摇床中进行液体发 酵培养； (2) 离心去除上清，获得湿细胞，加入含有脂肪族或芳基取代的酮、葡萄糖及葡萄糖脱 氢酶的缓冲液在摇床中进行酶促反应； (3) 反应结束后加入2,4_二硝基苯肼溶液，使酶促反应体系中残余脂肪族或芳基取代 的酮与2，4-二硝基苯肼充分反应，生成对应的苯腙化合物； (4) 加入KOH或NaOH溶液提供碱性环境，脂肪族或芳基取代的酮与2,4_二硝基苯肼反应 所生成的苯腙化合物显示红至红棕色，使用酶标仪或分光光度计测定特征吸收波长下样品 的吸光值，将未加入细胞或酶液的样本作为阴性对照，按照之前所述相同条件下反应，筛选 出特征吸收波长下吸光值较阴性对照低的菌株或酶液，完成初筛； (5) 将初筛所得到的菌株或酶液加入含有不同脂肪族或芳基取代的酮的缓冲液进行反 应，以未加入细胞或酶液的样本作为阴性对照，复筛出单位时间内特征吸收波长下吸光值 变化大的菌株，即为高酶活的醇脱氢酶菌株或酶液。2. 根据权利要求1所述的醇脱氢酶高通量筛选方法，其特征在于初筛时2,4_二硝基苯 肼溶液的浓度为1 %~5 %的硫酸或盐酸溶液，其中2，4-二硝基苯肼的浓度为2~20mM，并于 20~50°C和100~150r/min振荡条件下进行转化反应5~30min。3. 根据权利要求1所述的醇脱氢酶高通量筛选方法，其特征在于初筛时KOH或NaOH溶液 添加量为〇. 5~2.5M，于20~50°C和100~150r/min振荡条件下进行显色反应5~30min。4. 根据权利要求1所述的醇脱氢酶高通量筛选方法，其特征在于所用酶促反应体系缓 冲液为pH 5.0~8.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液，脂肪族或芳基取代酮底物的终浓度 为1~50mM，葡萄糖终浓度为1~50mM，葡萄糖脱氢酶为1~10kU/L于20~50°C和120r/min振 荡进行转化反应10~60min。5. 根据权利要求1所述的醇脱氢酶高通量筛选方法，其特征在于所述的脂肪族或芳基 取代酮底物通式为：式中：Ri为苯基、对氯苯基、苯甲基、萘基;R2为2-吡啶、苯基、甲基、乙基、临氯苯基间氯 苯基、对氯苯基、乙酰基、丙酰基、丁酰基。
【文档编号】C12Q1/32GK106047985SQ201610374447
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】倪晔, 许国超, 周婕妤, 韩瑞枝, 董晋军
【申请人】江南大学