同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱β?内酰胺酶的方法
【专利摘要】本发明涉及临床微生物细菌检测技术领域，具体涉及同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱β?内酰胺酶的方法。该方法为：选用抗生素纸片和EDTA纸片，将已经检测耐药待检菌制成0.5麦氏单位菌悬液并均匀涂抹至M?H平皿表面，在涂布有待检菌的M?H平皿表面上，将含EDTA纸片置于M?H平皿表面中央，以EDTA纸片为中心周围分别贴上头孢他啶(CAZ)抗生素纸片、厄他培南(ETP)抗生素纸片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片、亚胺培南(IMP)抗生素纸片、头孢西丁(FOX)抗生素纸片，且EDTA纸片与各抗生素纸片、两相邻抗生素纸片留有间距，采用35℃孵育16～18h，观察并分别记录EDTA纸片、各抗生素纸片抑菌环直径。成本低廉，检出率高，易于在临床实验室推广应用。
【专利说明】
同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方法
技术领域
[0001]本发明涉及临床微生物细菌检测技术领域，具体涉及同时分类检测碳青霉烯酶、 AmpC酶和超广谱内酰胺酶的方法。【背景技术】
[0002]与细菌严重耐药相关的内酰胺酶主要为碳青霉烯酶、Amp?-内酰胺酶和超广谱内酰胺酶。细菌如铜绿假单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等在生长过程中产生的能水解各种￠-内酰胺类抗生素，如厄他培南(ETP)、美罗培南(MER)、头孢他啶(CAZ)、头孢西丁 (F0X)等的酶，部分细菌可同时产多种￠-内酰胺酶，这些产酶的细菌对以上抗生素表现耐药性，目前为止，对产酶细菌的常规检测，尚缺乏简单、有效的方法。
[0003]为解决上述问题，本
【申请人】公开发表了多底物协同-拮抗法同时检测超广谱内酰胺酶和Amp?-内酰胺酶(张国伟，明德松，吴一波.多底物协同-拮抗法同时检测超广谱P-内酰胺酶和Amp邙-内酰胺酶[J].中国感染控制杂志.2003(04))该方法将亚胺培南(HIP)抗生素纸片贴9cm培养基中心，头孢他啶(CAZ)、头孢他啶/棒酸、头孢噻肟(CTX)、头孢噻肟/棒酸、头孢吡肟(FEP)、头孢西丁(F0X)以IPM为圆心依次摆放，IPM与各纸片的距离25mm，两相邻纸片间距彡24mm，头孢噻|亏/棒酸与FEP间距20mm，35 °C孵育16?18h;使用该方法成本较高，无法同时用于检测碳青霉烯酶，且IPM纸片检出率较低，因此有待改进。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种成本低廉，检出率高的同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方法。
[0005]为实现上述目的，本发明的技术方案如下:
[0006]同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方法，其特征在于:采用以抗生素纸片为载体的头孢他啶(CAZ)、头孢西丁(F0X)、厄他培南(ETP)、亚胺培南(HIP)、 头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)和哌拉西林/他唑巴坦(TZP)及以纸片为载体的EDTA，检测步骤如下:
[0007](1)选用抗生素纸片和m)TA纸片；
[0008](2)将已经检测耐药待检菌制成0.5麦氏单位菌悬液并均匀涂抹至M-H平皿表面；
[0009](3)在涂布有待检菌的M-H平皿表面上，将含EDTA纸片置于M-H平皿表面中央；[0〇1〇]⑷以EDTA纸片为中心周围分别贴上头孢他啶(CAZ)抗生素纸片、厄他培南(ETP)抗生素纸片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片、亚胺培南(MP)抗生素纸片、头孢西丁 (F0X)抗生素纸片，且EDTA纸片与各抗生素纸片之间、两相邻抗生素纸片之间留有间距；
[0011](5)采用 35°C 孵育 I6 ?ish;
[0012](6)观察并分别记录EDTA纸片、各抗生素纸片抑菌环直径；
[0013](7)如果厄他培南(ETP)抗生素纸片和/或亚胺培南aMP)抗生素纸片与头孢他啶/ 克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片和/或哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片协同；头孢他啶(CAZ)抗生素纸片和/或厄他培南(ETP)抗生素纸片和/或亚胺培南(IMP)抗生素纸片与 EDTA纸片协同，则判断为产碳青霉烯酶；
[0014]如果头孢西丁 (F0X)抗生素纸片耐药和亚胺培南aMP)抗生素纸片敏感，则判断为产AmpC酶；
[0015]如果头孢他啶(CAZ)抗生素纸片与头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片和/ 或哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片协同则判断为产超广谱￠-内酰胺酶。
[0016]进一步的，所述的抗生素纸片采用英国0X0ID公司生产的抗生素纸片。
[0017]进一步的，所述的布置于EDTA纸片周围的抗生素纸片顺序依次为头孢他啶(CAZ) 抗生素纸片、厄他培南(ETP)抗生素纸片、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片、亚胺培南(MP)抗生素纸片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片、头孢西丁 (F0X)抗生素纸片。
[0018]进一步的，所述的EDTA纸片与各抗生素纸片、相邻抗生素纸片间距为10-24mm。 [〇〇19]进一步的，所述的EDTA纸片与各抗生素纸片、两相邻抗生素纸片间距为10mm时为高度耐药，为24mm时为中低度耐药。
[0020]进一步的，所述的EDTA纸片与头孢他啶(CAZ)抗生素纸片、头孢他啶/克拉维酸 (CAZ/CLAV)抗生素纸片与厄他培南(ETP)抗生素纸片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片与头孢西丁 (F0X)抗生素纸片的间距均为15mm。[〇〇21] 进一步的，所述的M-H平皿直径为9cm。[〇〇22]进一步的，所述的碳青霉烯酶分为为丝氨酸类(SCHBLs)和金属类(MCHBLs)，厄他培南(ETP)抗生素纸片和/或亚胺培南(MP)抗生素纸片与头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV) 抗生素纸片和/或哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片协同为产丝氨酸类(SCHBLs)，头孢他啶(CAZ)抗生素纸片和/或厄他培南(ETP)抗生素纸片和/或亚胺培南(MP)抗生素纸片与 EDTA纸片协同为产金属类(MCHBLs)。[〇〇23]进一步的，所述的EDTA纸片含量为1860ug。
[0024]由上述对本发明的描述可知，与现有技术相比，本发明的同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方法，利用纸片扩散法药敏实验的特点，将多种抗生素纸片联合使用，通过检测各抗生素纸片抑菌环直径的改变来判断酶及其不同类型的存在，避免了使用单一底物可能带来的漏检，提高检测的阳性率，尤其是高水平耐药细菌，操作简单，成本低廉，检出率高，重复性好，不需要特殊实验条件的优点，易于在临床实验室推广应用。【附图说明】
[0025]图1为发明的抗生素纸片分布示意图。【具体实施方式】
[0026]参照图1所示，本发明的同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方法，具体步骤如下:[〇〇27](1)采用以纸片为载体的EDTA和以英国0X0ID公司生产的抗生素纸片为载体，每个抗生素纸片分别含头孢他啶(CAZ)、头孢西丁(FOX)、厄他培南(ETP)、亚胺培南(MP)、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)，其中EDTA的含量为1860ug;[〇〇28](2)将已经检测耐药待检菌制成0.5麦氏单位菌悬液并均匀涂抹至M-H平皿表面；[〇〇29](3)在涂布有待检菌的M-H平皿表面，将EDTA纸片置于平皿表面中央；[〇〇3〇](4)以EDTA纸片为中心，周围依次贴上头孢他啶(CAZ)抗生素纸片、厄他培南(ETP)抗生素纸片、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片、亚胺培南(HIP)抗生素纸片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片、头孢西丁(F0X)抗生素纸片，且EDTA纸片与各抗生素纸片、两相邻抗生素纸片间距为l〇_24mm，间距为10mm时为高度耐药，为24mm时为中低度耐药；
[0031](5)采用35。(:孵育I6?1池；[〇〇32](6)观察并分别记录EDTA纸片、各抗生素纸片抑菌环直径；[〇〇33](7)如果厄他培南(ETP)抗生素纸片和/或亚胺培南(HIP)抗生素纸片与头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片和/或哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片协同；头孢他啶(CAZ)抗生素纸片和/或厄他培南(ETP)抗生素纸片和/或亚胺培南(IMP)抗生素纸片与 EDTA纸片协同，则判断为产碳青霉烯酶；[〇〇34]如果头孢西丁 (F0X)抗生素纸片耐药和亚胺培南(HIP)抗生素纸片敏感，则判断为产AmpC酶；
[0035]如果头孢他啶(CAZ)抗生素纸片与头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片和/ 或哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片协同则判断为产超广谱￠-内酰胺酶；[〇〇36]该碳青霉烯酶分为为丝氨酸类(SCHBLs)和金属类(MCHBLs)，厄他培南(ETP)抗生素纸片和/或亚胺培南(MP)抗生素纸片与头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片和/ 或哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片协同为产丝氨酸类(SCHBLs)酶，头孢他啶(CAZ)抗生素纸片和/或厄他培南(ETP)抗生素纸片和/或亚胺培南(MP)抗生素纸片与EDTA纸片协同为产金属类(MCHBLs)。
[0037]具体实施例1:参照图1所示，同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方法应用于检测骨折伤口感染的血液标本中分离到不动杆菌，细菌药敏结果显示青霉素类、第三代头孢菌素高度耐药，将血液标本待检菌制成0.5麦氏单位菌悬液并均匀涂抹至 M-H平皿表面，EDTA纸片置于9cm平皿表面中央，将EDTA纸片和头孢他啶(CAZ)抗生素纸片、 头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片和厄他培南(ETP)抗生素纸片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片和头孢西丁 (F0X)抗生素纸片间距均调整为15mm，35°C培养过夜，其结果如下:EDTA纸片的抑菌环直径为16 mm、厄他培南(ETP)抗生素纸片的抑菌环直径为18 mm 和亚胺培南(MP)抗生素纸片的抑菌环直径为20mm，头孢他啶(CAZ)抗生素纸片和头孢西丁 (F0X)抗生素纸片抑菌环直径均是6_，头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片的抑菌环直径为16mm、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片的抑菌环直径为12mm，EDTA纸片与其它抗生素纸片间均无协同，头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片和哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片与头孢他啶(CAZ)抗生素纸片间均出现协同，故该血液标本分离至同时产Amp?-内酰胺酶和超广谱￠-内酰胺酶的不动杆菌，其中产Amp?-内酰胺酶表现为头孢西丁 (F0X)抗生素纸片耐药和亚胺培南(MP)抗生素纸片敏感;超广谱￠-内酰胺酶表现为头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片和哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片与头孢他啶 (CAZ)抗生素纸片间均出现协同。
[0038]具体实施例2:参照图1所示，同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方法应用于检测颅内感染的血液标本分离到不动杆菌，细菌药敏结果显示青霉素类、 第三代头孢菌素、头孢他啶(CAZ)、亚胺培南(MP)和美罗培南(MER)均高度耐药，将血液标本待检菌制成0.5麦氏单位菌悬液并均匀涂抹至M-H平皿表面，周围分别依次贴上头孢他啶 (CAZ)抗生素纸片、厄他培南(ETP)抗生素纸片、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片、亚胺培南(MP)抗生素纸片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片和头孢西丁 (F0X)抗生素纸片，将EDTA纸片与头孢他啶(CAZ)抗生素纸片的间距调整为15mm，头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片与厄他培南(ETP)抗生素纸片的间距调整为10mm，哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片和头孢西丁 (F0X)抗生素纸片间距分别调整为10mm，35°C培养过夜， 其结果如下:EDTA纸片与头孢他啶(CAZ)抗生素纸片、厄他培南(ETP)抗生素纸片间均出现协同，头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片和哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片与头孢他啶(CAZ)抗生素纸片间均出现协同，故该血液标本同时产碳青霉烯酶和超广谱P-内酰胺酶的不动杆菌。[〇〇39]优化的，上述实施例1、实施例2所采用的EDTA纸片含量均为1860ug。
[0040]以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能以此限定本发明实施的范围，即依本发明申请专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明专利涵盖的范围内。
【主权项】
1.同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方法，其特征在于:采用以 抗生素纸片为载体的头孢他啶(CAZ)、头孢西丁 (FOX)、厄他培南(ETP)、亚胺培南(MP)、头 孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)和哌拉西林/他唑巴坦(TZP)及以纸片为载体的EDTA，检测步 骤如下:(1)选用抗生素纸片和EDTA纸片；(2)将已经检测耐药待检菌制成0.5麦氏单位菌悬液并均匀涂抹至M-H平皿表面；(3)在涂布有待检菌的M-H平皿表面上，将含EDTA纸片置于M-H平皿表面中央；(4)以EDTA纸片为中心周围分别贴上头孢他啶(CAZ)抗生素纸片、厄他培南(ETP)抗生 素纸片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸 片、亚胺培南(MP)抗生素纸片、头孢西丁(FOX)抗生素纸片，且EDTA纸片与各抗生素纸片、 两相邻抗生素纸片留有间距；(5)采用35°C孵育16?18h;(6)观察并分别记录EDTA纸片、各抗生素纸片抑菌环直径；(7)如果厄他培南(ETP)抗生素纸片和/或亚胺培南(HIP)抗生素纸片与头孢他啶/克拉 维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片和/或哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片协同；头孢他啶 (CAZ)抗生素纸片和/或厄他培南(ETP)抗生素纸片和/或亚胺培南(MP)抗生素纸片与EDTA 纸片协同，则判断为产碳青霉烯酶；如果头孢西丁(FOX)抗生素纸片耐药和亚胺培南(IMP)抗生素纸片敏感，则判断为产 Amp C酶；如果头孢他啶(CAZ)抗生素纸片与头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片和/或哌 拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片协同则判断为产超广谱￠-内酰胺酶。2.根据权利要求1所述的同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方 法，其特征在于:所述的抗生素纸片采用英国0X0ID公司生产的抗生素纸片。3.根据权利要求1所述的同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方 法，其特征在于:所述的布置于H)TA纸片周围的抗生素纸片顺序依次为头孢他啶(CAZ)抗生 素纸片、厄他培南(ETP)抗生素纸片、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片、亚胺培南 (MP)抗生素纸片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片、头孢西丁 (FOX)抗生素纸片。4.根据权利要求1或3所述的同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的 方法，其特征在于:所述的H)TA纸片与各抗生素纸片、相邻抗生素纸片间距为10-24mm。5.根据权利要求4所述的同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方 法，其特征在于:所述的H)TA纸片与各抗生素纸片、两相邻抗生素纸片间距为10mm时为高度 耐药，为24mm时为中低度耐药。6.根据权利要求4所述的同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方 法，其特征在于:所述的EDTA纸片与头孢他啶(CAZ)抗生素纸片、头孢他啶/克拉维酸(CAZ/ CLAV)抗生素纸片与厄他培南(ETP)抗生素纸片、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片与头 孢西丁 (FOX)抗生素纸片的间距均为15mm。7.根据权利要求1所述的同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方 法，其特征在于:所述的M-H平皿直径为9cm。8.根据权利要求1所述的分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方法，其特征在于:所述的碳青霉烯酶分为为丝氨酸类(SCHBLs)和金属类(MCHBLs)，厄他培南(ETP) 抗生素纸片和/或亚胺培南(MP)抗生素纸片与头孢他啶/克拉维酸(CAZ/CLAV)抗生素纸片 和/或哌拉西林/他唑巴坦(TZP)抗生素纸片协同为产丝氨酸类(SCHBLs)，头孢他啶(CAZ)抗 生素纸片和/或厄他培南(ETP)抗生素纸片和/或亚胺培南(MP)抗生素纸片与EDTA纸片协 同为产金属类(MCHBLs)。9.根据权利要求1所述的同时分类检测碳青霉烯酶、AmpC酶和超广谱￠-内酰胺酶的方 法，其特征在于:所述的H)TA纸片含量为1860ug。
【文档编号】C12Q1/34GK106047986SQ201610387946
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】明德松
【申请人】明德松