用于检测川崎病的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】提供用于检测川崎病的方法及试剂盒。具体而言，提供用于测序或测量miRNA的试剂在制备用于检测川崎病(KW)的试剂、微阵列或试剂盒中的用途，其中，所述miRNA选自miR?941、miR?182?5p和miR?183?5p的至少一种；以及用于检测川崎病的微阵列或试剂盒，该微阵列或试剂盒包含用于在检测样本内测序或测量下列miRNA：miR?941、miR?182?5p或miR?183?5p的至少一个的表达水平的试剂。
【专利说明】
用于检测川崎病的方法及试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及一种检测方法及试剂盒，特别是一种利用测量特定miRNA的表达水平 来检测川崎病的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 在先前技术章节中讨论的标的主题不应当被假定为先前技术，仅作为在先前技术 章节中提及的结果。相似地，在先前技术章节中陈述的问题W及对该问题的原因的理解不 应被假定为之前在先前技术中已习知。在先前技术章节中之标的主题可仅仅代表不同的方 法，于该些方法中及该些方法本身亦可能作为发明。
[0003] 川崎病化awasaki disease，脚)是造成血管发炎作用的小儿疾病。虽然川崎病在 所有种族和族群中都有报告，然而此疾病主要影响的还是亚太族裔的孩童。
[0004] 川崎病初期和最明显的症状是发烧至少五天。如果没有治疗，大约百分之20至25 的受影响孩童会导致冠状动脉动脉瘤，且川崎病在已开发国家中是年轻孩童后天性屯、脏疾 病的主要元凶。在开始发烧的前面10天内成功地检测川崎病，且接续高剂量静脉注射免疫 球蛋白（IVIG)可大幅地降低冠状动脉损伤的发生率。
[0005] 根据美国屯、脏协会(American Hea;rt Association,AHA)于2004年的诊断基准，目 前针对川崎病并没有决定性的实验室诊断测试，且川崎病的诊断大多数为临床诊断。运些 诊断基准包括发烧超过5日、两侧非化脈性结膜炎、粘膜变化、手脚的硬结性血管性水肿、崎 形皮疹（dysmo;rphous skin rashes)W及直径大于1.5cm的急性非化脈性颈部淋己结肿大 (曰cute nonpurulent cervic曰1 lymph曰denop曰thy)〇
[0006] 然而，AHA基准与日本循环器学会的指导方针略微不同，其使得川崎病的临床诊断 复杂化。此外，传染性疾病，像是葡萄球菌或链球菌的感染，可能会拟似川崎病。在受感染的 孩童中，临床医师难W精确地诊断川崎病且迅速地给药IVIGW防止冠状动脉疾病。
[0007] 针对川崎病之经济且精确的实验室诊断测试的需求未被满足，而本发明满足此需 求与其他需求。
【发明内容】
[0008] 在一个实施例中，本发明掲露用于在受试者上检测川崎病的方法，其包含:在受试 者的检测样本中测量miR-182-5p(SEQ ID No:2)的表达水平的步骤，其中，相对于在没有川 崎病或控制组样本中的miR-182-5p表达水平，在该受试者的检测样本中较高的miR-182-5p 表达水平指示受试者患有川崎病。
[0009] 在另一个实施例中，本发明掲露用于在受试者上检测川崎病的方法，其包含:在受 试者的检测样本中测量miR-941 (SEQ ID NO: 8)的表达水平的步骤，其中相对于在无川崎病 或控制组样本中的miR-941表达水平，受试者的较高的miR-941表达水平指示受试者患有川 崎病。
[0010] 在又另一个实施例中，本发明也掲露用于在受试者内检测川崎病的方法，其包含： 在受试者的检测样本中测量miR-183-5p(SEQIDN0:3)的表达水平的步骤，其中相较于无 川崎病或控制组样本中的miR-183-5p表达水平，受试者的检测样本中有较高的miR-183-5p 表达水平指示受试者患有川崎病。
[0011] 根据本发明的一些实施例，提供用于在受试者内检测川崎病的方法，其包含测量 受试者的检测样本内下列11111?酷3:11111?-182-59、11111?-183-59或11111?-941的至少一个的表达水 平的步骤，其中，相对于在无川崎病或控制组样本中相应miRNA的表达水平，在检测样本中 下列11111?酷:11111?-182-59、11111?-183-59或11111?-941的至少一个的较高表达水平是指示受试者 患有川崎病。
[0012] 根据一个实施例，提供的是用于在受试者上检测川崎病的方法，包含在受试者的 检测样本中测量下列miRNA:miR-182-5p、miR-183-5p、或miR-941的至少两个的表达水平的 步骤，其中相对于在无川崎病或控制组样本中相应的miRNAs的表达水平，在测试样本中上 述miRNAs的至少两个的较高miRNA表达水平指示受试者患有川崎病。
[0013] 本发明也掲露用于在受试者上检测川崎病的试剂盒，其包含在检测样本中用于测 序或测量下列miRNAs:miR-941、miR-182-5p或miR-183-5p的至少一个的表达水平的试剂。 在一实施例中，试剂盒进一步包含指示用于测量miRNA的试剂是用于检测川崎病的标记。
[0014] 本发明也提供用于测序或测量miRNAs试剂在制备用于检测川崎病化W)的试剂、微 阵列或试剂盒中的用途，其中，所述miRNAs选自：miR-941、miR-182-5p或miR-183-5p的至少 一个。
[0015] 在另一个例示性实施例中，提供一种用于建立川崎病特异的机器学习演算法的方 法，其包含：（a)测定下列来自无川崎病的受试者的参考样本池 W及患有川崎病的受试者的 参考样本池的miRNAs:miR-223-：3p(SEQ ID N0:l)、miR-182-5p(SEQ ID N0:2)、miR-183-5p (WQIDN0:3)、miR-378a-：3p((WQIDN0:4)、miR-30c-5p(WQIDN0:5)、miR-148a-：3p (沈Q ID NO:6)、miR-27a-：3p(SEQ ID N0:7)、miR-941(SEQ ID N0:8)、miR-140-：3p(SEQ ID N0:9)或miR-30e-：3p(SEQ ID N0:10)的至少一个的ACt值；W及(b)将从步骤(a)来自无川 崎病的受试者的该参考样本池的至少一个Act值，W及来自有川崎病的受试者的该参考样 本池的至少一个A Ct值存取(registering)进入机器学习演算法；W及(C)使用在步骤(b) 的机器学习演算法建立二元分类模型(binary classification model)。
[0016] 在又另一个例示性实施例亦提供使用本文描述的川崎病特异机器学习演算法W 诊断川崎病的方法。
[0017] 此专利中使用的术语"发邸V'该发邸V'此发邸'、W及"本发邸'是旨在广泛地指 称本专利W及W下专利的申请专利范围的全部适格标的。包含运些术语的陈述应该被理解 成非对本文描述的主题标的之限制，或是非对W下专利的申请专利范围的意义或范畴之限 审IJ。被此专利涵盖的发明的实施例是藉由W下申请专利范围所定义，而非被此
【发明内容】
所 定义。
【发明内容】
是本发明的各种态样的上位总览，并且介绍一些将在W下实施方式章节中 进一步描述的概念。此
【发明内容】
非旨在界定所主张之专利标的之主要或必要技术特征，也 非旨在独立使用W决定所主张的专利标的之范畴。专利标的应藉由参考整份说明书的合适 部分、任意或全部的图式W及每一项申请专利范围来理解。
[0018] 在与附图及下列实施方式一同阅读下，本发明将变得更显而易知。
【附图说明】
[0019] 本发明的描述性实施例将参考W下图式于下文中更详细地说明：
[0020] 图1是描述使用qPCR分析31个发热的控制组样本化X轴上标记为"C'）中W及37个 川崎病样本（在X轴上标记为"D")中的10个miRNA:miR-223-3p、miR-182-5p、miR-183-5p、 111王尺-378日-39、11111?-30。-59、11111?-148日-化、11111?-27日-39、11111?-941、11111?-14〇-化或11111?-3〇6-化 的表达水平（Act)的长条图。*林*、林*、林、^及*分别代表i)<0.0001、p<0.001、p<0.01 W及 p<0.05〇
[0021 ] 图2是根据第1图中10个miRNA表达水平（A Ct)的支持向量机器(suppod vector machines，SVM)分类模型的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0022] 本申请案主张于2015年4月3日申请之美国专利申请号62/142,742的效益，其全部 内容于此并入作为参考。
[0023] 如本文所使用，用语"一"指称用语的语法对象的一个W上之一个或多个（即，至少 一个)。
[0024] 术语"受试者"可指称疑似患有川崎病的脊椎动物。受试者包括溫血动物，诸如哺 乳类，像是灵长类，且较佳地是人类。非人类的灵长类也是受试者。术语受试者包括驯养动 物，诸如猫、狗等，家畜(举例来说，牛、马、猪、绵羊、山羊等似及实验动物(举例来说，小鼠、 兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等）。
[00剧如本文可交替地使用的，"微RNAV'miR"或'miRNA"指称来自miR基因的未经处理 (例如，前体)的或经处理(例如:成熟）的RNA转录本。微RNA是大约22个核巧酸长度的内生性 非编码单股RNAs，且构成新一类的基因调节子(化ua，等人。（2009年）化rr .Opin.Mol.化er. (分子治疗学新见），11:189-199)。
[00%]本文的所有数字可被"约"修饰来理解。
[0027] 诊断川崎病的方法
[0028] 本发明是部分地基于特定miRNA的鉴别，该些特定miRNA的表达水平在检测样本中 相较于无川崎病的样本中的相应miRNA的预定量是增加的。本发明的一些实施例是关于诊 断受试者是否具有川崎病，或是否有发展川崎病的风险的方法，其包含:测量来自受试者的 检测样本中至少一个miR的表达水平，且与无川崎病或控制组样本中的相应miR的表达水平 相比较，其中相对于该控制组样本，在检测样本中较高miRNA表达水平则是该受试者具有川 崎病的指标。
[0029] 在无川崎病或控制组样本中的预定的miRNA表达水平是来自无川崎病的个体的代 表性样本池，且是在无川崎病或控制组样本中的平均数、中位数或其他统计学操纵变数，或 其他整合的或集结的代表性miRNA表达水平。
[0030] 较高的miRNA表达水平是相对的术语，且可藉由将在检测样本中的miRNA表达水平 与来自已知无川崎病的受试者的参考样本池的miRNA表达水平相比较而测定。在一些实施 例中，在检测样本中的miRNA表达水平比来自已知无川崎病受试者的参考样本池的miRNA表 达水平高5%、高10%、高15%、高20%、高25%、高30%、高35%、高40%、高45%、高50%、高 55%、高 60%、高 65%、高 70%、高 75%、高 80%、高 85%、高 90%、高 95%、高 100%、高 150%、 高200%、高250%、高300%、高350%、高400%、高450%、高500%。
[0031] 在一实施例中，在受试者的检测样本中测量下列miRNA:miR-223-3p、miR-182-5p、 miR-183-5p、miR-378a-^、miR-30c-5p、miR-148a-3p、miR-27a-^、miR-941、miR-14〇-3p、 或miR-30e-化的至少一个的表达水平，W诊断川崎病。
[0032] 在另一实施例中，在受试者的检测样本中测量下列miRNAs:miR-182-5p、miR-183- 5p或miR-941的一个或多个的表达水平W诊断川崎病。
[0033] 在一个例示性实施例中，在受试者的检测样本中测量miR-182-5p的表达水平W进 行川崎病诊断。在另一个例示性实施例中，在受试者的检测样本中测量miR-183-5p的表达 水平W进行川崎病诊断。在又另一个例示性实施例中，在受试者的检测样本中测量miR-941 的表达水平W进行川崎病诊断。
[0034] 在又另一个实施例中，在受试者的检测样本中测量下列11111?^4:11111?-223-3口、11111?- 182-5p、miR-183-5p、miR-378a-3p、miR-30c-5p、miR-148a-：3p、miR-27a-3p、miR-941、miR- 140-化或miR-30e-化的两个或更多的表达水平，W诊断川崎病。
[00巧]在一些实施例中，在受试者的检测样本中测量下列11111?酷:1]111?-27曰-3口、1]111?-148曰- 3口、11111?-30。-59、11111?-306-39、11111?-378日-39、11111?-233-化或11111?-140-化的一个或多个的表达 水平W诊断川崎病。
[0036] 在一个例示性实施例中，在受试者的检测样本中测量miR-182-5pW及miR-183-5p 的表达水平W进行川崎病诊断。在另一个例示性实施例中，在受试者的检测样本中测量 miR-182-5p及miR-941的表达水平W进行川崎病的诊断。在又另一个例示性实施例中，在受 试者的检测样本中测量miR-183-5pW及miR-941的表达水平W进行川崎病诊断。在又另一 个例示性实施例中，在受试者的检测样本中测量miR-182-5p、miR-183-5pW及miR-941的表 达水平W进行川崎病的诊断。在一些实施例中，两个或更多miRNA的表达水平的组合对于川 崎病诊断提供了较高的精确度、敏感性或特异性。
[0037] miRNA表达水平的测量指称量化存在于样本中的miRNA的量。测量特异的或任何 miRNA的表达水平可藉由使用任何所属技术领域已知或是本文描述的方法来达成，像是透 过实时PCR、北方墨点法分析、或那些所属技术领域中具有通常知识者已知的其他技术。测 量miRNA的表达水平包括测量miRNA的成熟形式或与miRNA表达相关的前体形式的表达。
[0038] 在特定的实施例中，至少一个miRNA的量是使用北方墨点法分析来侦测。举例来 说，整体细胞的RNA可在核酸萃取缓冲液的存在下，藉由均质化接着离屯、而从细胞纯化。沉 淀核酸，且DNAW去氧核醋核酸酶化nase)处理W及沉淀作用来移除。RNA分子接着根据标准 技术，在琼脂糖凝胶上藉由凝胶电泳分离，并转移至硝化纤维素过滤器。RNA接着藉由加热 被固定（immobilized)在过滤器上。特定RNA的侦测及定量是藉由使用互补于所要的RNA的 合适标记DNA或RNA探针来完成。举例来说，请参阅，分子转殖:实验室手册，J. Sambrook等 人，编着，第二版，冷泉港实验室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press) ,1989 年，第7章，其全部掲露内容并入于此作为参考。
[0039] 在一些实施例中，理想是使用微阵列。微阵列是核酸、蛋白质、小分子、细胞或其他 能使复杂生化样本能够平行分析的其他物质的微观有序阵列。微阵列可使用各种技术来制 造，其包括W精细尖锐的细针印刷在玻片上、使用预先制作好的遮罩进行光刻、使用动态微 镜装置(dynamic micromirror devices)进行光刻、喷墨印刷、或在微电极阵列上进行电化 学程序。
[0040] miRNA的微阵列分析，举例来说，可根据任何所属技术领域的通常知识来完成。在 一个实施例中，RNA是从细胞或样本中萃取，使用变性聚丙締酷胺凝胶电泳从总RNA中W尺 寸挑选出小的RNA( 18至26个核巧酸RNA)。寡核巧酸链接物是附接至小RNA的5 '及3 '端，且结 果接合产物被使用作为10个循环的放大作用的反应之RT-PCR的模板。正义股PCR引子具有 附接在其5端的蛋光基团，因而蛋光地标记该PCR产物的正义股。PCR产物被变性且接着与微 阵列杂交。PCR产物，被称为在阵列上互补于对应的miRNA捕获探针序列的标祀核酸，将透过 碱基对被杂合至捕获探针被贴附的位点。当使用微阵列雷射扫瞄器激发时，位点将发出蛋 光。接着就特定miRNA的复本数目而言，藉由使用一些正控制组及负控制组W及阵列数据标 准化方法来评估每个位点的蛋光强度，来达成特定miRNA的表达水平的评定。
[0041 ] 在一实施例中，微阵列包含用于测序或测量选自由miR-223-^、miR-182-5p、miR- 183-5p、miR-378a-^、miR-30c-5p、miR-148a-3p、miR-27a-^、miR-941、miR-14〇-3p、miR- 30e-化或其组合所组成的群组的miRNAs的miRNA-特异性探针寡核巧酸。
[0042] 在一些实施例中，定量RT-PCR的使用是理想的。定量RT-PCR(qRT-PCR)是用W快速 地测量聚合酶连锁反应的产物的数量的聚合酶连锁反应的改良。qRT-PCR通常针对决定遗 传序列，像是miRNA是否存在于样本中，W及若存在于样本中则样本中的复本数有多少的目 的来使用。任何可测定核酸分子，其包含miRNA的表达的PCR方法皆落入本发明的范畴内。在 本发明所属技术领域中有一些已知的qRT-PCR方法的变化，包括，但不限于:透过琼脂糖凝 胶电泳，使用SYBR绿(双股DNA染料)W及使用蛋光报导探针。
[0043] 差别地表达在川崎病及无川崎病受试者上的miRNA的鉴别允许W数种方法使用此 资讯。举例来说，可评估特定的处理方式(例如测定疗程对有川崎病的受试者而言是否有效 地防止冠状动脉并发症）。相似地，藉由将检测样本内的miRNA表达水平与来自无川崎病样 本的已知表达基因谱比较可完成或确认诊断。此外，运些miRNA表达谱允许在川崎病内抑制 miRNA表达的候选药物的筛选，或是将差预后基因谱转换成较佳的预后基因谱。
[0044] 在一个例示性实施例中，提供用于建立川崎病特异性的机器学习演算法的方法， 其包含：（a)测定来自无川崎病的受试者的参考样本池 W及来自患有川崎病的受试者的参 考样本池的下列 miRNAs:miR-223-3p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-378a-3p、miR-30c-5p、 miR-148a-化、miR-27a-3p、miR-941、miR-140-化或miR-30e-化的至少一个的ACt值；W及 (b)将从步骤(a)来自无川崎病的受试者的该参考样本池的至少一个Act值，W及来自有川 崎病的受试者的该参考样本池的至少一个Act值存取进入机器学习演算法；W及(C)使用 在步骤(b)的机器学习演算法建立二元分类模型。
[0045] 在另一个实施例中，提供诊断川崎病的方法，其包含：（a)测定来自检测样本的下 列miRNAs:miR-223-3p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-378a-3p、miR-30c-5p、miR-148a-3p、 miR-27a-：3p、miR-941、miR-140-3p或 miR-30e-：3p 的至少两个的 Act值；W及(b)将来自步骤 (a)的A Ct值的一个或多个存取至本文描述的川崎病特异性机器学习演算法。
[0046] 机器学习网路的非限制性实例包含支持向量机器（Suppod Vector Machines, SVM)、人工类神经网路（artificial neural networks)、决策树学习 （decision tree learning)(例如：CART、ID3、C4.5、CHAID、MARS、W及条件推理树（Conditional Inference lYees))、基于实例的学习 （instance based learning)(例如：K-最近邻居法化-Nearest Neighbor))、贝氏网路（Bayesian networks)、基因演算法W及整体学习 （ensemble learning)(例如：套袋(Bagging)与推进(Boosting))。
[0047] 在一例示性实施例中，提供诊断川崎病的方法，其包含：（a)测定来自检测样本的 下列miRNAs :miR-182-5p、miR-183-5p、miR-941 的至少一个的 A Ct值；W及(b)将来自步骤 (a)的A Ct值之一个或多个存取至本文描述的川崎病特异性机器学习演算法中。在一个实 施例中，机器学习演算法是支持向量机器(SVM)。
[0048] 用于诊断川崎病的试剂盒
[0049] 本发明也提供用于诊断川崎病的试剂盒。试剂盒包含用于在检测样本内测序或测 量下列miRNAs :miR-223-3p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-378a-3p、miR-30c-5p、miR- 148日-化、11111?-27日-39、11111?-941、11111?-14〇-化或11111?-3〇6-39的一个或多个的表达水平的试 剂。
[0050] 相较于在无川崎病样本中的相应miRNA的表达水平而言，若在检测样本中的miRNA 表达水平较高，贝臟由使用试剂盒来诊断出川崎病。检测样本的非限制性实例包含体液(例 如:血清、血液、渗出液）W及组织。
[0051] 在一实施例中，试剂盒进一步包含用于川崎病诊断的指示。在另一实施例中，试剂 是RT-PCR。在另一实施例中，试剂是特异于测序或测量SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、沈Q ID N0:7、沈Q ID N0:8、沈Q ID N0:9 或SEQ ID NO: 10的miRNA的探针寡核巧酸。试剂可为在所属技术领域中已知用于测量特异 性或任何miRNA的表达水平的试剂。
[0052] 本发明的实施例藉由下列实例来描述，其不W任何方式被解释为强加对其范畴的 限制性。相反地，应当清楚地认知到本申请可具有各种其他实施例、其修饰、W及其等效物， 在阅读本文的描述之后，对于本发明所属技术领域具有通常知识者而言可意味着该些实施 例、修饰及等效物而不背离本发明的精神。在下列实例描述的研究期间，除非另有说明，否 则将遵照常规程序。W下仅为了说明性的目的而描述一些程序。
[0053] 在实例中所使用的材料及方法的描述
[0054] 于台湾的高雄长庚纪念医院，从被诊断出患有川崎病及无患有川崎病(发烧控制 组或"FC")的病患收集全血液样本。透过内科医师诊断的临床川崎病被认为是本研究的黄 金准则。FC是发烧超过5日然并非患有川崎病的病患。
[0055] 31个川崎病W及37个FC受试者被招收进训练组，且19个川崎病及33个FC受试者被 招收进盲测组。川崎病患的30%具有阳性冠状动脉病灶。废弃或移除收集的血液样本中的 红血球。使用mirVana miRNA分离试剂盒（莱富生命科技(；Life technology)，CA，USA)萃取 剩余的白血球(WBC)部分的RNA，并进一步藉由NGS或是实时PCR( qPCR)分析来处理。
[0056] 结果
[0化7] 藉由NGS的miRNA表达谱
[0化引12个FC的WBC样本W及12个川崎病的WBC样本随机地选自训练组，且萃取的RNA被 汇总W形成四个RNA基因库（两个川崎病汇总的RNA基因库W及两个FC汇总的RNA基因库）。 汇总的基因库W Tni S eq愈Sma 11 RNA (宜曼达(111 um i na))样本制备流程来制备，接着W次 世代测序(NGS)平台来测序，其每个基因库需要超过5百万的序列读数。在FASTQ格式的初始 序列读数WmiRSeq(CT Pan等人，《用于测序品质评估及miRNA剖析的便于使用独立工具试 剂盒》（A User-Friendly Standalone Toolkit for Sequencing Quality Evaluation and miRNA Profiling),生物医学研究国际期刊（Biomed Res Int) ,2014 年；2014:462135) 来分析，W评估整体测序品质并测定miRNA表达基因谱，其显示NGS数据是高品质且一致。被 侦测且修整的3'转接子的读数的大部分是22-nt长，其暗示分析的序列读数的大多数(超过 80%)是属于miRNA基因。
[0059] 执行丛聚分析W测试FC和川崎病样本是否能基于miRNA表达基因谱来区分。热图 图像显示超过20个hsa-miRNAs在FC及川崎病样本中差别地表达(在川崎病样本中表达较 高），且挑选其中10个进一步作qPCR验证。
[0060] qPCR 验证
[0061 ] 使用TaqMan巧MicroRNA转录试剂盒(莱富生命科技)来制备cDNA。在Veriti 96孔 热循环仪(莱富生命科技)上根据制造商的说明执行反转录反应。将反转录产物稀释10倍且 稀释产物的扣1被用于qPCR反应。使用7500实时PCR系统（莱富生命科技）W及TaqMan 化iversal PCR预混液II不含UNG(莱富生命科技)来执行定量RT-PCR。实时PCR循环条件为： 95°C10分钟，接着进行95°C15秒40个循环，W及60°C1分钟。MicroRNA表达丰度藉由使用小 核仁RNA U6作为内生控制组的A Ct值来测定。
[0062] qPCR验证显示10个miRNA表达水平与NGS的表达水平一致。如第1图所示，八个 miRNA的A Ct在川崎病样本与非川崎病样本之间是差别地表达(P值）：
[0063] 1.hsa-miR-182-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-941W及hsa-miR-27a-3p(p< 0.0001);
[0064] 2.hsa-miR-148a-：3p(p<0.001);
[00化]3.hsa-miR-30c-5pW及hsa-miR-30e-3p(p<0.01);W及
[0066] 4.hsa-miR-378a-：3p(p<0.05)。
[0067] 虽然hsa-miR-233-3p和hsa-miR-140-3p的表达水平在川崎病样本与发烧控制组 样本之间没有显著的差异，但仍观察出差别表达的趋势(与控制组样本相比，川崎病样本的 ACt较低）（参见第l图）。
[006引 KD特异性SVM校准模型的执行
[0069] 使用支持向量机器(SVM)的libsvm模组来发展川崎病特异性SVM校准模型，W基于 miRNA表达来区别FC及川崎病样本。使用来自37个FC及31个川崎病样本的10个miRNAs的A Ct(阔值循环)值，来发展川崎病特异的SVM校准模型，且采用5倍交叉验证策略W剔除过度 配适 W 及乏适。10 个 miRNAs(miR-223-：3p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR-378a-：3p、miR-30c- 5p、miR-148a-化、miR-27a-3p、miR-941、miR-140-化W及miR-30e-化）的ACt值是使用SVM 校准模型加权且运算W计算出总分数。总分数在0至1之间。若总分数大于或等于0.5,其被 分类为阳性病例（川崎病），然而总分数若小于0.5则被分类为阴性病例(FC)。如第姻所示， 用于诊断川崎病的最终SVM排列模型具有83.3%的敏感度及92.5%的特异性，致使87.9% 的整体精确度。此外，auROC值高达0.9。
[0070] 在独立的定群上执行独立的盲测，该定群包含33个FC及19个川崎病受试者。基于 上述的程序从收集的血液样本中萃取RNA，且WqRT-PCR分析miRNA的表达基因谱。在川崎病 特异性SVM模型校准后，19个川崎病样本的中的16个被诊断为川崎病;33个FC样本中的27个 被诊断为无川崎病，结果有六个伪阳性。因此，基于所测量的10个miRNA的Act值，相较于由 医生诊断的川崎病（黄金准则），盲测展现了 84.20%的敏感性及81.8%的特异性，致使 82.7%的整体精确度。
[0071] 表2
[0072]
[0073] 从上述衍生的川崎病特异性SVM校准模型，基于miR-182-5p、miR-183-5p及miR- 941的A Ct，被用于计算运些miRNAs单独或组合的敏感性、特异性和精确度。结果显示于表 3。
[0074] 表3，]13日-11111?-182-59、113日-11111?-183-59及113日-11111?-941于川崎病诊断的敏感性、特 异性及精确度
[0075]
[0076] 结果显示针对miR-182-5p诊断川崎病的精确度是69.16%，针对11111?-941诊断川崎 病的精确度是70.81%。相比之下，针对11111?-182-59及11111?-941组合诊断川崎病的精确度增 加至 75.22%。
[0077] 针对miR-183-5p诊断川崎病的敏感度是75.71%，针对11111?-182-5?诊断川崎病的 敏感度是58.57%。相比之下，针对11111?-182-59^及11111?-183-59的组合诊断川崎病的敏感度 增加至90.48 %。
[0078] 针对miR-182-5P诊断川崎病的特异性是78.21%，针对11111?-183-59诊断川崎病的 特异性是83.93%，针对miR-941诊断川崎病的特异性是73.93%。相比之下，川崎病检测中 针对11111?-182-59、11111?-183-59^及11111?-941组合的特异性增加至87.14%。
【主权项】
1. 用于测序或测量miRNA的试剂在制备用于检测川崎病(KW)的试剂、微阵列或试剂盒 中的用途，其中，所述miRNA选自miR-941、miR-182-5p和miR-183-5p的至少一种。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA为miR-182-5p及miR-183-5p。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA为miR-183-5p及miR-941。4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA为miR-182-5p及miR-941。5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA为miR-182-5p及miR-183-5p及 miR-941。6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用于测序或测量miRNA的试剂还包括用 于测序或测量 miR-27a-3p、miR-148a-3p、miR-30c-5p、miR-30e-3p、miR-378a-3p、miR-233-3p和hsa-miR-140_3p中的至少一种miRNA的试剂。7. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA表达水平藉由实时PCR来测定。8. -种用于检测川崎病的微阵列或试剂盒，其特征在于，包含： 用于在一检测样本内测序或测量下列miRNA:miR-941、miR-182-5p或miR-183-5p的至 少一个的表达水平的试剂。9. 如权利要求8所述的微阵列或试剂盒，其特征在于，所述检测样本是血清。10. 如权利要求8所述的微阵列或试剂盒，其特征在于，所述试剂是实时PCR。11. 如权利要求8所述的微阵列或试剂盒，其特征在于，所述试剂是特异于miR-941、 miR-182-5p或miR-183-5p的探针寡核苷酸。12. 如权利要求8所述的微阵列或试剂盒，其特征在于，进一步包含用于测量下列 miRNA:miR-27a-3p、miR-148a-3p、miR-30c-5p、miR-30e-3p、miR-378a-3p、miR-233-3p或 hsa-miR-140_3p的至少一个的试剂。13. 如权利要求12所述的微阵列或试剂盒，其特征在于，所述试剂用于实时PCR。14. 如权利要求12所述的微阵列或试剂盒，其特征在于，所述试剂是特异于^1?-27&-3卩、11111?-148&-3卩、11111?-30(3-5卩、11111?-3〇6-3卩、11111?-378&-3卩、11111?-233-3卩或118&-11111?-14〇-3卩的 探针寡核苷酸。15. 如权利要求8所述的微阵列或试剂盒，其特征在于，进一步包含标记指示用于测量 所述miRNA的所述试剂是用于检测川崎病。16. -种用于建立川崎病特异性机器学习演算法的方法，其特征在于，包含： (a) 测定来自无川崎病的受试者的参考样本池以及患有川崎病的受试者的参考样本池 的下列miRNA:miR-223-3p(SEQ ID NO:l)、miR-182-5p(SEQ ID NO:2)、miR-183-5p(SEQ ID NO:3)、miR-378a-3p((SEQ ID N0:4)、miR-30c-5p(SEQ ID NO:5)、miR-148a-3p(SEQ ID NO:6)、miR-27a-3p(SEQ ID NO:7)、miR-941(SEQ ID N0:8)、miR-140-3p(SEQ ID NO:9)或 miR-30e-3p(SEQIDN0:10)的至少一个的ΔCt值； (b) 将从步骤(a)来自无川崎病的所述受试者的所述参考样本池的ACt值的至少一个， 以及来自有川崎病的所述受试者的所述参考样本池的ACt值的至少一个存取进入一机器 学习演算法；以及 (c) 使用来自步骤(b)的所述机器学习演算法建立二元分类模型。
【文档编号】C12Q1/68GK106047991SQ201610194943
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年3月31日 公开号201610194943.1, CN 106047991 A, CN 106047991A, CN 201610194943, CN-A-106047991, CN106047991 A, CN106047991A, CN201610194943, CN201610194943.1
【发明人】郭和昌, 李松洲, 詹文庆
【申请人】长庚医疗财团法人高雄长庚纪念医院