mRNA甲基化高通量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种mRNA甲基化高通量检测方法，包括以下步骤：mRNA样品提取；将提取的RNA样品进行片段化；将得到的RNA片段利用特异性识别mRNA上m6A甲基化(m6A)的抗体进行免疫富集；将步富集后含有m6A的mRNA片段洗脱后进行沉淀纯化；将所得纯化后的RNA反转录成cDNA，并进行DNA末端修复、接头连接和PCR扩增，完成mRNA甲基化文库的构建；将完成的文库利用分析测序文库的高通量测序平台进行测序。
【专利说明】
mRNA甲基化高通量检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其设及一种mRNA甲基化高通量检测方法。
【背景技术】
[0002] M6A是指发生在碱基A第6位N原子上的甲基化修饰，于1974年在肝癌细胞的mRNA上 最早被发现，之后在其他物种上也检测到mRNA m6A的存在，m6A是一种最常见的转录后水平 修饰，大约占全部RNA修饰的S分之二。在真核生物中，m6A大约占细胞mRNA全部腺巧含量的 0.1 % -0.4 %，即哺乳动物中平均每一条mRNA含有3-5个6-甲基修饰的腺巧。1994年，科学家 从化la细胞中分离得到mRNA m6A甲基化转移酶复合体，并在后期研究中鉴定纯化出主要影 响m6A修饰水平的催化结构域METTL3,通过在化pG2细胞中超表达该基因导致细胞调亡，并 激活p53下游通路;在小鼠和人类的胚胎干细胞中敲除METTL3，mRNA m6A修饰水平显著降 低，多能性基因长期维持高表达量，使胚胎干细胞无法退出自我更新，难W进行分化，表明 RNA m6A对增殖和调节分化发育起着重要的作用；与METTL3作用相反，2012年的化学研究中 鉴定出FT0是一种去甲基化酶，通过催化mRNA上的m6A修饰的去甲基化而参与mRNA加工过 程，FT0缺失小鼠较正常小鼠体重和体脂率显著升高，同时FT0缺失可阻碍脂肪前体细胞 3T3-L1的分化，说明m6A在肥胖及能量代谢方面有重要作用;RNA m6A在越来越多的生命活动 中发挥重要作用，但是缺少一种可W直观的分析出mRNA甲基化整体分布的研究技术。早在 1980年，就有科学家利用放射性同位素3中标记的ATP及T4多聚核酸激酶共解育基因筛上点 杂交的mRNA,通过阴离子交换柱，与m6A凝胶共解育后进行TLC检测同位素标记组和非标记 组的放射性来计算基因的m6A相对含量，但该方法相当繁琐且仅能进行低通量的检测，随着 二代测序技术的高速发展，各生物基因组库逐步建立完整，，利用测序来检测基因的甲基化 分布是一种极好的方式;不同于发展成熟的M5C测序，甲基化的胞喀晚可在重硫酸盐的处理 下转变为尿喀晚，而非甲基化的胞喀晚不变，可直接通过二代测序对比重硫酸盐处理前后 的两种样品甲基化位点及丰度;但是m6A并不能影响其配对碱基的能力，且没有化学试剂来 改变或特异性标记运一修饰，所W-直无法建立二代测序等高通量平台；本发明可W实现 全转录本上甲基化区域的确定，实现多个样本甲基化程度的比较，对mRNA m6A多样性的生 物学研究开辟了新的技术。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种检测全转录本上mRNA甲基化修饰的检测方 法。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种mRNA甲基化高通量检测方法，包括W下 步骤：
[000引l)、mRNA样品提取；
[0006] 2)、将步骤1)提取的RNA样品进行片段化；
[0007] 3)、将2)得到的RNA片段利用特异性识别mRNA上m6A甲基化(m6A)的抗体(synaptic system ,202003)进行免疫富集；
[0008] 4)、将步骤3)富集后含有m6A的mRNA片段洗脱后进行沉淀纯化；
[0009] 5)、将步骤4)所得纯化后的RNA反转录成cDNA，并进行DNA末端修复、接头连接和 PCR扩增，完成mRNA甲基化文库的构建；
[0010] 6)、将步骤5)完成的文库利用分析测序文库的高通量测序平台进行测序。
[0011] 作为本发明的mRNA甲基化高通量检测方法的改进：
[0012] 所述步骤6)中，测序平台包括illumina的Hiseq、MiSeq，W及ABI的Series Genetic Analyzer和Ion Torrent PGM；
[0013] 使用SR50bp，index length 6 bases;每个样品得到30-50million reads 用于后 续数据分析。
[0014] 备注说明：SR50:single read 50bp，代表单侧读取50bp长度；index length 6 base:在建库的时候要在1 ibrary上加一个长度是6个碱基的index，用W区分不同样品。
[0015] 作为本发明的mRNA甲基化高通量检测方法的进一步改进：
[0016] 所述步骤1)中，利用polyA方法在总的RNA中提纯mRNA(即，舍弃tRNA，rRNA，miRNA 等其他RNA类型）。
[0017] 作为本发明的mRNA甲基化高通量检测方法的改进：
[001引所述步骤2)中，将RNA利用超声断裂或者金属离子(如化ACaAFe/等)断裂成100 ~2(K)nt的片段(即，片段的大小在100-2(K)nt之间，下限不低于l(K)nt，上限不高于2(K)nt)。
[0019] 作为本发明的mRNA甲基化高通量检测方法的改进:所述步骤3)中，RNA的富集时通 过抗体进行免疫富集。
[0020] 作为本发明的mRNA甲基化高通量检测方法的改进:所述步骤4)中，将洗脱下的RNA 进行过夜沉淀提取，得含有甲基化的mRNA片段。
[0021 ] 作为本发明的mRNA甲基化高通量检测方法的改进:所述步骤5)中，利用i 1 lumina 的TruSeq Stranded mRNA Libraiy Prep Kit的建库试剂盒进行mRNA甲基化文库的构建。
[0022] 本发明通过提取组织或细胞总RNA并进行片段化，利用mRNA甲基化(m6A)的抗体， 结合免疫共沉淀（IP)技术将含有m6A的mRNA片段富集，将所得片段用接头引物和DNA聚合酶 进行PCR指数扩增，获得扩增产物;扩增产物分离纯化，构成高通量测序文库，利用二代高通 量测序技术，对含有m6A的mRNA片段进行测序。
[0023] 具体而言，本发明提供了一种mRNA甲基化高通量检测方法，包括甲基化mRNA提取 方案、建库方案和测序方案：
[0024] 甲基化mRNA提取方案是指获得含甲基化的mRNA的详细方法步骤，包括：
[00巧]1.本发明中，作为甲基化RNA检测的对象的样品RNA，可举出包括动物、植物、微生 物在内的所有生物RNA，优选为动物，更优选为哺乳动物的RNA。作为哺乳动物，可举出人、 猴、小鼠、大鼠、猪等，但不局限于此。样品RNA，可从来自于含有RNA的生物试样中提取、分离 得到。作为从试样提取或分离RNA的方法，没有特别限制，可W适当选择使用公知的方法； [002引 2.将1中试样提取的总RNA样品，经过PoWA)selection提取总的mRNA;
[0027] 3.将2中总mRNA经过超声断裂或者金属离子（如化化、Ca2+、Fe2+等）断裂成100~ 200nt的mRNA片段，利用RNA变性凝胶电泳检测RNA片段大小，确认片段化成功且未降解； [00%] 4.将3中mRNA片段取出50ng左右作为Input,其余部分定义为IP，首先利用免疫沉 淀反应，与m6A抗体在4C低溫下解育2小时；
[0029] 5.将4中的样品与吸附抗体的beads在4C低溫下解育2小时，洗去没有与beads结合 的部分；
[0030] 6.将5中与beads结合的部分利用elution buffer进行洗脱，将洗脱下的RNA进行 过夜沉淀提取，即为含有甲基化的mRNA片段；
[0031] 建库方案是指获得待检测的mRNA甲基化文库的详细方法步骤，包括：
[0032] 7.将帥的mRNA片段（IP似及4中的I叩ut首先进行第一条和第二条cDNA链的合 成，成为双链DNA;
[0033] 8.将7所得到的双链cDNA进行纯化；
[0034] 9.将8得到的纯化后的cDNA在3 '末端加上A碱基；
[OO%] 10.将9得到的cDNA接上adapter，并进行纯化；
[0036] 11.将10得到的cDNA进行PCR扩增，扩增后的产物进行纯化，W备测序。
[0037] 测序方案是指将前述建库方案获得的cDNA文库进行序列测定的详细方法步骤，包 括：
[003引12.用于分析测序文库的高通量测序平台包括，但不局限于illumina的化seq、 MiSeq等测序平台，ABI的Series Genetic Analyzer和Ion Torrent PGM测序平台；使用 SR50bp，index length 6 bases;每个样品得到30-50million reads用于后续数据分析。
[0039] 本发明相对于现有技术而言，具有如下技术优势：
[0040] 1、本发明首次实现全转录本上mRNA甲基化区域的确定；
[0041 ] 2、本发明首次实现全转录本上mRNA甲基化位点、频率的确定；
[0042] 3、本发明可W实现多个样本间甲基化位点、频率等的比较。
【附图说明】
[0043] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0044] 图1是本发明m6A-seq方法的示意图。
[0045] 图2显示使用本方法片段化后片段的琼脂糖凝胶分析结果（片段大小在100- 200bp)。
[0046] 图3显示猪肌肉组织mRNA甲基化高通量测序文库的bioanalyzer--2100检测分 析结果；
[0047 ] 左图为样品的input，右图为IP;
[004引
f
[0049] 0
[0050] 图4显示利用本发明方法找到的m6A保守mo t i f。
[0化。图5是猪肌肉组织mRNA上m6A甲基化图谱细节；即，猪的第14号染色体中长达 6.5化P片段上含m6A的基因图谱(示例）。
[0化2]图6为单个基因（N0VA2)的甲基化图谱。
[0化3] 图7为qPCR验证单个基因 m6A enrichment。
【具体实施方式】
[0054] W下结合【具体实施方式】和附图，对本发明作进一步说明。本领域技术人员可W对 具体实施方案中所示的本发明做出多种变化和修改而不脱离广义描述时的本发明的精神 和范围。
[0055] 实施例1: 一种mRNA甲基化高通量检测方法，依次进行W下步骤：
[0056] 试验用RNA来自猪的肌肉组织，具体操作如下：
[0化7] 1、获取总RNA:
[005引取猪肌肉样品，利用Trizol法提取总RNA，具体方法为：
[0059] 1)将冻存于液氮中的肌肉组织样品取出，取50-100mg在液氮中研磨成粉末，置于 RNase-free的 1.5ml eppendorf管中；
[0060] 2)加入1mlTrizol剧烈摇晃至均一溶液；
[0061 ] 3)加入200ul氯仿后，剧烈摇晃至均一溶液，4C，12000g离屯、15min;
[0062] 4)取上清到另一个RNase-打ee的1.5ml邱pendcxrf管中，加入相同体积异丙醇，轻 轻混匀，室溫解育10min，4C，12000g离屯、lOmin;
[0063] 5)去掉上清，用1ml 75%乙醇洗涂沉淀，4C，7500g离屯、5min;
[0064] 6)用20-50ul RNase-free 肥0溶解。
[00化]2、获取 mRNA
[0066] 利用Genelute mRNA minipr邱 Kits(Sigma)提取mRNA,具体方法为：
[0067] 1)将to1:al RNA体积扩大到250ul，加入250ul binding solution,混匀；
[0068] 2)加入15ul beads,剧烈摇晃至均一溶液，置于70C解育3min后，置于室溫lOmin;
[0069] 3)最大速度离屯、2min，弃掉上清；
[0070] 4)用500ul wash buffer重悬beads,并转移至spin filter;
[0071 ] 5)离屯、l-2min，弃掉flow though;
[0072] 6)重复 4)、5);
[0073] 7)加入预先加热至70C的Elution Buffer 50ul，70C解育2-5min;
[0074] 8)离屯、产物即是mRNA;
[00巧]9)将所得mRNA利用真空浓缩至9u 1。
[0076] 3、片段化 mRNA
[0077] RNA片段化体系 [007引
[0079] 溫度、解育时间为:70°C、15min，加入邸TA终止反应；
[0080] *片段化缓冲液（10X)为：800化脚ase-free水，100化 1M Tris-HCl(pH = 7.0)， 10化L 1M化CI2溶液。
[0081 ] 4、片段化mRNA的检测
[0082]将片段化后的样品在2%琼脂糖凝胶电泳进行1*TAE电泳检测片段大小（图2)，片 段在100-20化P，大小合适并浓缩至lug/lOOul后进行后续试验。
[0086]
[0083] 5、免疫沉淀[0084] 1)试剂准备[00化]10%Ig邱al CA-630(Sigma-Aldrich，cat.no.I8896)
[0095] (#N6-Methyladenosine,50-monophosphate sodium salt(m6A,Sigma-Aldrich, cat.no.M2780))[0096] 2)mRNA的m6A免疫结合[0097] 将步骤4中所得的RNA片段，进行W下试验：「00981
[0087]
[008引
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] AM2696))
[0093]
[0094]
[0099] 在4 °C解育化。
[0100] 3)封闭beads(Dynabcads迟.Protein A，Life technologies, 10002D)
[0101] 取40iil beads置于磁力架上，弃去上清，用1ml的1*IP buffer洗S次，重悬于1*IP 封闭buffer中，于4°C解育化。1*IP封闭buffer配制如下：
[0102]
[0103] 解育化后，用1ml的1*IP buffer洗S次，用10化1 1*IP buffer重悬；
[0104] 4)beads与mRNA-抗体免疫沉淀：
[01化]将上述2)和3)得到的样品混合，4。(：解育化。
[0106] 5)洗脱 I
[0107] 将4)所得样品置于磁力架上，弃上清，用50化1 1*IP buffer洗S次，重悬于洗脱 buf f er，置于4 °C解育化。洗脱buf f er配制如下：
[010 引 0109 0110 0111 0112 0113 0114 0115 0116 0117 *
[0109] 6)洗脱 II
将5)所得样品置于磁力架上，收集上清，然后在beads中再加入50ul洗脱buffer， 置于4°C解育30min。
[0111] 7)将5)、6)合并到一起，得到20〇111洗脱液。
[0112] 8)乙醇沉淀：将200ul RNA洗脱液巧Oul 化oAc+500ul乙醇（100%)+4ul glycogen (5mg/ml)，-80 °C，过夜沉淀。
[0113] 9)第二天，将8)取出，在4C，14000巧m离屯、30min，弃上清，加入lml75%乙醇在4C， 1400化pm离屯、30min，弃上清，风干后，加入9ul RNase-打ee水，并测定浓度。 6、建库
[0115] 使用111皿ina的TruSeq Stranded mRNA Libraiy Pr邱 Kit的建库试剂盒， 1)第一链合成： 取步骤5的9)所得6-7ul RNA，加入10-llul FPF mix得到17ur混合物;经94°C加热 10s后立即置于冰上。
[0118] 按如下混合后放入PCR仪，按25°C lOmin，42°C 15min，70°C 15min，4°C保持进行试 验。
[0119]
[0120」 （Superscript II reverse transcriptase invitrogen 18064-014)
[0121] 2)第二链合成：
[0122] 将1)中的产物按如下体系混合后放入PCR仪，按16°C化，4°C保持运行： 「01231
[0124] 3)利用AMPure XP磁珠纯化cDNA
[01巧]向2)中50ul cDNA中加入90ul AMPure XP beads,室溫放置15min后转移至磁力架 上分离5min，吸弃13加1上清，加入200ul 80%的乙醇洗磁珠2次后，室溫放置5min，等待惊 干;加入20ul elution buffer室溫下静置解育2min，转移至磁力架上放置5min，将17.5ul 上清液转移至新管中；
[0126] 4)合成的cDNA 3'端加 A碱基
[0127] 在3)中 17.5ul cDNA溶液中加入 12.5ul A-tailing mix;将30ul混合物在37°C反 应30min后，70°C反应5min，保持在4°C。
[012引5)连接接头
[01巧]配制如下体系后在30°C反应lOmin，加入加1 stop ligation buffer终止反应。
6)第一次纯化样
[0130]
[0131] 0132 0133 0134 0135
[0132] 6)品 在5)中加入42ul AMPurea XP beads,室溫放置15min，转移至磁力架放置5min，吸 弃79.5ul上清，加入200ul 80 %乙醇将磁珠洗两次后，室溫惊干5min ;加入52.5ul resuspension buffer,室溫放置2min后转移至磁力架5min，取50ul上清转移至新管中； 7)第二次纯化样品
[0136] 向6)中加入50ul AMPurea XP beads,室溫放置15min，转移至磁力架放置5min，吸 弃95ul上清，加入200ul 80 %乙醇将磁珠洗两次后，室溫惊干5min ;加入2 2.5ul resuspension buffer,室溫放置2min后转移至磁力架5min，取20ul上清转移至新管中；
[0137] 8)PCR 扩增
[013引反应体系按如下配制后放入PCR仪，按98°C30s;98°C，10s，60°C，30s，72°C，30s, 13-15cycles;72°C，5min;Hold at 4°C设定PCR程序
[0139]
[0140] 9)纯化PCR产物
[0141] 向8)的50ul PCR产物中加入50ul AMPurea XP beads,室溫放置15min，转移至磁 力架放置5min，吸弃95ul上清，加入200ul 80 %乙醇将磁珠洗两次后，室溫惊干5min;加入 32.5ul resuspension buffer，室溫放置2min后转移至磁力架5min，取20ul上清转移至新 管中，用如bit测定浓度。
[0142] 7、上机测序
[0143] DBioanalyzer 检测分析。
[0144] 2)利用illumina公司Hiseq 4000平台进行高通量测序，使用SR50bpW及index length 6bases，具体测序流程与试剂均采用Illumina公司标准流程与试剂盒，测序结果产 生40M reads,能比对(ma卵ing)到猪基因组（SGSC Ssc;rofal0.2/susScr3)达到91.6%。
[0145] 8、结果分析
[0146] DBioanalyzer 检测分析见图 3;
[0147] 2)m6A 保守的 Motif 见图 4;
[014引3)猪染色体含m6A的基因表达量图谱见图5;
[0149] 4)单个基因（N0VA2)的甲基化图片示例见图6;
[0150] 5)用QPCR方法验证，证明测序结果是真实可信的，见图7。
[0151] 最后，还需要注意的是，W上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于W上实施例，还可W有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. mRNA甲基化高通量检测方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 、mRNA样品提取； 2) 、将步骤1)提取的RNA样品进行片段化； 3) 、将2)得到的RNA片段利用特异性识别mRNA上m6A甲基化(m6A)的抗体进行免疫富集； 4 )、将步骤3)富集后含有m6A的mRNA片段洗脱后进行沉淀纯化； 5) 、将步骤4)所得纯化后的RNA反转录成cDNA，并进行DNA末端修复、接头连接和PCR扩 增，完成mRNA甲基化文库的构建； 6) 、将步骤5)完成的文库利用分析测序文库的高通量测序平台进行测序。2. 根据权利要求1所述的mRNA甲基化高通量检测方法，其特征在于： 所述步骤6)中，测序平台包括illumina的Hiseq、MiSeq，以及ABI的Series Genetic Analyzer和Ion Torrent PGM； 使用SR50bp，index length 6bases;每个样品得到30_50mi 11 ion reads，用于后续数 据分析。3. 根据权利要求1或2所述的mRNA甲基化高通量检测方法，其特征在于： 所述步骤1)中，利用P〇 1 yA方法在总的RNA中提纯mRNA。4. 根据权利要求1或2所述的mRNA甲基化高通量检测方法，其特征在于： 所述步骤2)中，将RNA利用超声断裂或者金属离子断裂成100~200nt的片段。5. 根据权利要求1或2所述的mRNA甲基化高通量检测方法，其特征在于:所述步骤3)中， RNA的富集时通过抗体进行免疫富集。6. 根据权利要求1或2所述的mRNA甲基化高通量检测方法，其特征在于： 所述步骤4)中，将洗脱下的RNA进行过夜沉淀提取，得含有甲基化的mRNA片段。7. 根据权利要求1或2所述的mRNA甲基化高通量检测方法，其特征在于： 所述步骤5)中，利用illumina的TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit的建库试 剂盒进行mRNA甲基化文库的构建。
【文档编号】C40B50/06GK106047997SQ201610362981
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】王新霞, 汪以真, 江芹
【申请人】浙江大学