一种凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记和应用
【专利摘要】本发明属于水产动物种质创新技术领域，具体涉及一种基于多标记组合辅助凡纳滨对虾抗WSSV选育的方法及其应用。利用高通量分型技术对凡纳滨对虾免疫信号通路的SNP位点在敏感群体和抗性群体中进行SNP标记分型，获得了6个与抗WSSV显著相关的SNP分子标记。利用多标记互作分析方法，筛选获得了一种最优的抗性标记组合，该标记组合包括nLvALF2g?89?A>G,Unigene34569g?97?T>C和TRAF6g?139?A>G，三个标记的AA?TT?AA,AA?CT?AA,AA?CT?AG,AG?CT?AA的四种基因型组合表现出与WSSV抗性明显的关联优势。本发明为对虾抗病分子选育提供了候选的标记，为对虾分子标记辅助抗性育种提供了一种新的途径，在对虾抗WSSV品种选育的研究中具有广阔的应用前景。
【专利说明】
-种凡纳滨对邮抗性相关的多组合分子标巧和应用
技术领域
[0001] 本发明属于水产动物种质创新技术领域，具体设及凡纳滨对邮抗性相关的多组合 分子标记。
【背景技术】
[0002] 凡纳滨对邮是世界养殖规模和产量最大的对邮品种，自1988年引进中国W来，凡 纳滨对邮的产量急剧增长，目前已经成为我国最重要的水产养殖品种。然而，随着养殖规模 的扩大，病害的暴发也越来越频繁，其中WSSV因致死率高、传播快使得其成为影响世界对邮 产业最严重的疾病。
[0003] 培育抗病新品种是解决对邮病害问题的一种重要手段。相较于传统选育手段，结 合分子标记辅助选育的现代育种技术在抗病选育中具有较多的优势，表现为选育准确性 高、不易受环境干扰等特点，因此挖掘抗性相关分子标记，运用分子标记辅助选育成为遗传 育种工作者研究的热点化iu Z.J.,Cordes J.F.DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics.Aquaculture,2004,238(l-4): 1-37)。随着对白 斑综合症入侵和感染过程的深入研究，研究人员发掘了多个与WSSV抗性相关的重要免疫因 子和效应因子（Xian 邑 J.,Li F. Recent advances in researches on the innate immunity of penaeid shrimp.Fish&She11fish Immunology 2013,34(6):1685-1685)，运 些基因参与对邮机体抵抗WSSV入侵的过程，对于对邮免疫稳态的维持具有重要作用，通过 分析运些基因的遗传多样性及其与WSSV抗性之间的关系，有助筛选出抗WSSV相关的分子标 记，为辅助抗WSSV品种的选育提供指导。
[0004] 在前期的研究中，研究人员发现了多个与抗WSSV性状显著先关的分子标记化iu J.,Yu Y.,Li F.,Zhang X.,Xiang J.A new anti-1ipopolysaccharide factor(ALF)gene with its SNP polymorphisms related to WSSV-resistance of Litopenaeus vannamei.Fish&Shellfish Immunology 2014,39(1):24-33;Liu J.,Yu Y.,Li F.,Zhang X.,Xiang J.A new ALF from Litopenaeus vannamei and its SNPs related to WSSV resist曰nee.Chinese Journal of Oceanology and Limnology.2014,32(6):1232-1247)， 运些标记在抗性材料和易感材料中具有显著性差异，利用运些分子标记建立了辅助抗性选 育的技术手段。但是之前的报道多为单个标记在抗性育种中的应用，多个标记组合辅助选 育尚未报道。因为对邮的抗性性状是由多个位点控制的，多个位点的组合选育效果应该优 于单一位点的选择。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种一种凡纳滨对邮抗性相关的多组合分子标记和应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] 一种凡纳滨对邮抗性相关的多组合分子标记，组合标记位点为位于SEQIDALF2序 列的 8加口（41。2邑-89-4〉6)，56910化1邑6116：34569邑序列的976口（化1邑6116：34569邑-97-1'〉〇， 沈QIDTRAF6g序列的 139bp (TRAF6g-l 39-A〉G)。
[000引所述S个标记的基因型组合分别为AA-TT-AA，AA-CT-AA，AA-CT-AG，AG-CT-AA。
[0009] 所述多组合分子标记是利用高通量分型技术对凡纳滨对邮免疫信号通路的77个 SNP位点在敏感群体和抗性群体中进行标记分型后，利用关联分析方法获得了 6个与抗WSSV 显著相关的分子标记(P<〇.05)。进一步采用多标记互作分析方法，获得了一种最优的抗性 标记组合，该标记组合包括ALF2g-89-A〉G，Unigene34569g-97-T 乂，TRAF6g-139-A〉GS 个标 记。
[0010] 一种用于检测权凡纳滨对邮抗性相关的标记组合的Multiplex Snapshot分型引 物对：
[001。 ALF2g-89-A〉G位点的扩增引物对为：
[0012] ALF2F:5 '-AACCCTTTCGCTCCCACC-3 '，
[0013] ALF2R:5 '-TGGATGAGGTATCAACATTCGC-3 '；
[0014] Unigene34569g-97-T 乂位点的扩增引物对为：
[0015] Unigene34569F:5 '-ACTTGGGCAACGTCATCG-3 '，
[0016] Unigene34569R:5 '-GAGTTCCAGTCCAGGGAAATG-3 '；
[0017] TRAF6g-139-A〉G位点的扩增引物对为：
[0018] TRAF6F:5 '-TATCACATGGAAATCTGAACAGTA-3 '，
[0019] TRAF6R:5 '-GGATTACGAGCAACATCAGGA-3 '；
[0020] W及，
[0021] ALF2g-89-A〉G位点的延伸引物：
[0022] ALF2G:5 '-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGTGATGAGACCCGCGC-3 '
[0023] Unigene34569g-97-T 乂位点的延伸引物：
[0024] Unigene345695G:'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGC [00 巧]TCGCATCTCCTTATT-3 '；
[0026] TRAF6g-139-A〉G位点的延伸引物：
[0027] TRAF6G:5 '-TCTGTGATATGGTTTTTAGGTAATGATA-3 '；
[002引一种凡纳滨对邮抗性相关的多组合分子标记的应用，所述凡纳滨对邮抗性相关的 多组合分子标记在分子标记辅助育种中的应用。
[0029] -种基于多标记组合辅助凡纳滨对邮抗WSSV选育的方法，
[0030] 1)提取待分析材料的基因组的DNA;
[0031] 2) W待检测分析材料的基因组的DNA为模板，W及权利要求3所述的引物对进行多 重扩增，扩增产物再利用权利要求3所述的每个位点的延伸引物使用Multiplex Snapshot 方法对相应的SNP位点进行分型，获得分型信息；
[0032] 3)将上述获得的分型信息中选择AA-TT-AA，AA-CT-AA，AA-CT-AG，AG-CT-AA的基因 型个体进行留种和建立家系育种。
[0033] 本发明具有的优点包括:本发明提供凡纳滨对邮抗WSSV的多个组合的标记，基于 本发明提供的标记可进行辅助遗传选育，选育方法具有快速、准确、不易受环境影响的特 点；同时多个标记的组合选育效果优于单个标记的选育，能够显著提高选育的效率和准确 率。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明实施例提的S个SNP位点Multiplex SNaPshot分型结果图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合附图和实例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于W下的实施例内 容。
[0036] 实施例1:凡纳滨对邮WSSV抗性标记组合的获得
[0037] 1.WSSV易感和抗性材料的获得
[0038] WSSV易感和抗性材料来源于"科海一号"多家系的混合群体。选取500尾健康凡纳 滨对邮置于12个50L的水族箱中，实验前随机取10尾对邮检测无 WSSV感染，实验水溫为(23 ± 1) °C。经饥饿处理后，投喂WSSV感染致死的病邮(WSSV病毒含量为104-106copy/ng DNA)。 攻毒后每天检查3次(每次间隔化)并收集死邮，随机取样提取基因组DNA，最早死亡的48尾 对邮作为WSSV易感组。至攻毒后第14天，凡纳滨对邮存活情况稳定，取存活的48尾对邮作为 WSSV抗性组。
[0039] 2.基因组DNA提取
[0040] 凡纳滨对邮DNA的提取按照TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒说明进行。分别提 取上述抗性组和易感组的个体DNA，将提取获得的DNA使用Nano化op 1000检测DNA浓度和纯 度，将经检测DNA浓度巧化g/山和纯度OD260/28日为1.7~1.9的个体DNA再经1 %的琼脂糖凝胶 电泳检测，电泳检巧化NA片段完整性的个体，即为合格的DNA样品，在-20°C保存待用。
[0041 ] 3.免疫相关基因 SNP位点的筛选和获得
[0042] 从已有的凡纳滨对邮转录组SNP数据中（Yu Y.，Wei J.，Zhang X.，Liu J，，Liu C.,Li F.,Xiang J..SNP Discovery in the Transcriptome of White Pacific Shrimp Litopenaeus vannamei by Next Generation Sequencing,PLOS ONE,2014,9(1):e87218) 选择的标准如下:优先选择非同义突变;选择SNP位点基因组序列上下游l(K)bp内无其他SNP 位点;选择已报道参与WSSV侵染过程基因中的SNP。
[0043] 4. SNP位点高通量分型
[0044] 使用ABI Multiplex S化Pshot分型的方法对上述SNP位点在敏感组和抗性组中进 行SNP分型，对于无法使用ABI Multiplex S化Pshot分型的通过设计引物扩增后测序分型， 最终获得两个组中每个SNP的分型信息。
[0045] 5.抗WSSV相关SNP位点和最优抗性标记组合的获得
[0046] 通过SPSS 16.0中的非参数检验方法(卡方检验，X2)对易感组和抗性组中各SNP基 因频率、基因型频率及单倍型分布进行差异检验，显著性阔值设定为P = 〇.05,进一步使用 Generalized Multiple Dimensionality Reduction(GMDR)方法对6个位点之间的互作及 其与抗WSSV性状进行了分析，结果显示其中S个SNP标记ALF2g-89-A〉G，Unigene34569g- 97-T 乂和TRAF6g-139-A〉G的标记组合与抗WSSV性状显著相关，S个标 CT-AA，AA-CT-AG，AG-CT-AA四种基因型组合为抗性标记组合。
[0047] SEQIDl:Unigene34569
[004引 GAAAAACCACGGCAGCCCCTTGGACTTCCACCGCCACGCCGGCGACTTGGGCAACGTCATCGCCGACTACAACGGCG TGGCTCGCATCTCCTTATT[C/T]G ACAGGCACATTTCCCTGGACTGGAACTCTCCGGTATACATCGGCGGGCTCG CCTTCGTCATCCACGCCGGCGAGGA
[0049] (a)序列特征
[(K)加]*长度：174碱基对
[00引]*类型：核酸
[0化2] *链型：双链
[0053] *拓扑结构:线性
[0054] (b)分子类型：DNA
[00W] (C)假设:否
[0056] (d)反义：否
[0057] (e)最初来源:凡纳滨对邮
[0化引 沈QID2:TRAF6-g:
[0化9] TGTCTTCGAACAAATATCACATGGAAATCTGAACAGTATTTTTTGACTCTATTTATTCATGGAATGCAAAGTGAGAA TGATGACTTTCTTGACTGGCCCTTTAGTGGACGCATAACACTTTCTGTACTAGACTGTGAT[G/A] TATCATTACCTAAAA ACCATATCACAGAGACCATGGTGACAAAACCAGGTCTGCAGGCATTCAAGCGTCCTGATGT TGCTCGTAATCCAAAAGGATTTGGATTCACAGAATTTGTACCCCTTGCAAAAATACTTCAACCC
[0060] (a)序列特征
[0061 ] *长度:179碱基对
[0062] *类型:核酸
[0063] *链型：双链
[0064] *拓扑结构:线性
[00化](b)分子类型：DNA [0066] (C)假设:否
[0067] (d)反义:否
[0068] (e)最初来源:凡纳滨对邮
[0069] 沈QID3:ALF2-邑
[0070] AACCCTTTCGCTCCCACCCACAGCCGAGACCCGTAGCAGATCGGGCGTGGTAGGCAGAACGACGCAGGACTTCGTCA GGAAAGCTTTC[A/G]GCGCGGGT CTCATCACCGAATCAGAGGCCCAAGTTTGGCTTAATAGTTAAGGCGAAGAAG AACGACACGCAGATATAATTTAAAAGAGCGCCATGGAAGGGATCTCATTAATGGTATATCCAAATTCTTCCGCGAAT GTTGATACCTCATCCA
[OOW (a)序列特征
[0072] *长度:242碱基对
[007；3] *类型：核酸
[0074] *链型：双链
[00巧]*拓扑结构:线性
[0076] (b)分子类型:DM [0077] (c)假设：否
[007引（d)反义：否
[0079] (e)最初来源:凡纳滨对邮
[0080] 实施例2:凡纳滨对邮WSSV抗性标记组合的应用
[0081] 基于上述关联分析的结果，本研究建立了使用获得的分子标记组合辅助抗病选育 的方法，具体操作如下：
[0082] 1.按照TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒说明提取育种材料的个体DNA，将提取 获得的DNA使用化no化op 1000检测DNA浓度和纯度，将经检测DNA浓度〉50ngAU和纯度 OD260/280为1.7~1.9的个体DNA再经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，选取电泳结果DNA片段完整 的个体，待用。
[0083] 2. S个标记的SNP分型：
[0084] 将按照上述方式获得个体采用上述实施例获得S个抗性标记组合进行SNP分型， 具体：
[0085] 分别表 1 中的扩增引物（nLvALF2F 和 nLvALF2R，Unigene34569F 和 Unigene34569R， TRAF6F和TRAF6R，）对待分析个体的DNA进行多重扩增，之后使用測aPshot Multiplex Kit (ABI)试剂盒和每个位点的延伸引物(nLvALF2G，Unigene34569G，TRAF6G，）在ABI3730XL仪 器上对S个SNP位点进行同时分型，使用GeneMa卵er 4.0(Applie地iosystems Co. ,Ltd., USA)获得分型结果(图1)。
[00化]表1 [0087]
[008引3 .根据每个个体中；个位点的分型结果，选择保留ALF2g-89-A〉G， Unigene34569g-97-T 乂，TRAF6g-139-A〉GS 个位点的 SNP 分型组合为 AA-TT-AA，AA-CT-AA， AA-CT-AG，AG-CT-AA的个体进行留种和建立家系。
[0089]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因此 在不偏离本发明精神的基础上所做的一些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记，其特征在于，组合标记位点分别位于 SEQIDALF2 序列的 89bp(ALF2g-89-A>G)，SEQIDUnigene34569g 序列的 97bp(Unigene34569g-97-T>C)和SEQIDTRAF6g序列的 139bp (TRAF6g-l 39-A>G)。2. 按权利要求1所述的凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记，其特征在于:所述三个 标记的基因型组合分别为 AA-TT-AA，AA-CT-AA，AA-CT-AG，AG-CT-AA。3. -种用于检测权利要求1所述的对凡纳滨对虾抗性相关的标记组合进行分型的 Multiplex SnaPshot引物组合，其特征在于： ALF2g-89-A>G位点的扩增引物对为： ALF2F:5 '-AACCCTTTCGCTCCCACC-3 '， ALF2R:5 '-TGGATGAGGTATCAACATTCGC-3 '； Unigene34569g-97-T>C位点的扩增引物对为： Unigene34569F:5 '-ACTTGGGCAACGTCATCG-3 '， Unigene34569R:5 '-GAGTTCCAGTCCAGGGAAATG-3 '； TRAF6g-139-A>G位点的扩增引物对为： TRAF6F:5 '-TATCACATGGAAATCTGAACAGTA-3 '， TRAF6R:5 '-GGATTACGAGCAACATCAGGA-3 '； 以及， ALF2g-89-A>G位点的延伸引物： ALF2G:5 '-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGTGATGAGACCCGCGC-3 ' Unigene34569g-97-T>C位点的延伸引物： Unigene345695G:'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGCTCGCATCTCCTTATT-3 '； TRAF6g-139-A>G位点的延伸引物： TRAF6G:5 '-TCTGTGATATGGTTTTTAGGTAATGATA-3 '。4. 一种权利要求1所述的凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记的应用，其特征在于： 所述凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记在分子标记辅助育种中的应用。5. -种基于多标记组合辅助凡纳滨对虾抗WSSV选育的方法，其特征在于： 1) 提取待分析材料的基因组的DNA; 2) 以待检测分析材料的基因组的DNA为模板，以及权利要求3所述的引物对进行多重扩 增，扩增产物再利用权利要求3所述的每个位点的延伸引物使用Multiplex SnaPshot方法 对相应的SNP位点进行分型，获得分型信息； 3) 将上述获得的分型信息中选择AA-TT-AA，AA-CT-AA，AA-CT-AG，AG-CT-AA的基因型个 体进行留种和建立家系育种。
【文档编号】C12Q1/68GK106048016SQ201610401952
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】李富花, 于洋, 刘敬文, 张晓军, 相建海
【申请人】中国科学院海洋研究所