鸡pthlh基因5′调控区两个突变位点的分子标记方法及其在鸡育种中的应用
【专利摘要】本发明涉及一种鸡PTHLH基因5′调控区突变位点的分子标记方法及其在育种中的应用，鸡PTHLH 5′调控区存在2个突变位点，即?1827(A>G)和?165(C>T)位点，并用SHEsis在线软件进行了连锁不平衡分析，结果发现隐性白洛克鸡中这两个位点呈现完全连锁状态。两个位点均与开产日龄及32周产蛋数相关，AC/GT基因型的开产日期极显著早于GT/GT和AC/AC基因型，同时32周产蛋数也极显著多于另外两种基因型。本发明方法简便快捷，并且有助于选育开产早、产蛋数多的鸡品种，为标记辅助育种工作提供有利的帮助。
【专利说明】
鸡PTHLH基因5'调控区两个突变位点的分子标巧方法及其在 鸡育种中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及分子遗传学领域，具体设及了一种鸡PTOLH基因5/调控区的两个突变 位点的分子标记方法及其育种中的应用。
【背景技术】
[0002] 甲状旁腺激素样激素 （Parathyroid hormone-like hormone,PTHLH)也叫甲状旁 腺相关蛋白（Parathyroid hormone-related hormone,PTHrP)，首次发现于20世纪80年代， 被认为是引起恶性肿瘤伴发的体液高巧血症的主要原因 （Moseley et al，1987) JTOLH广 泛分布于骨骼、膜腺、乳腺、肾脏、胃、子宫等多种胎儿及成年组织中，通过旁分泌、自分泌、 细胞内分泌等形式起作用，生物学功能设及巧转运(Weir et al,1996;Miao et al,2004; Ma;rtin et al,2005)、骨形成（Qithbe;rtson et al,1999;Zhao et al,2002;Pinhei;ro et al,2010;Klopocki et al,2010)、平滑肌收缩及妊娠的维持(Thiede et al, 1990;Feguson et al,1994;Guo et al,2012;E;rbach et al,2013)、细胞生长与分化的调控（化savada et al，1996;Wojc化 et al，1998;Aya et al，1999)等多个方面。
[0003] 分子标记辅助选择育种，是在分子水平上对目标性状进行选择，可W不受环境影 响，通过遗传背景选择，减少连锁累寶，从而加速育种过程及精准度。基因表达是生命过程 中的细胞把储存在DNA序列上的遗传信息经过转录和翻译，转变成蛋白质的过程。其中，转 录受5/调控区序列的调控，其碱基突变通常会影响转录的起始，从而影响基因的表达。因 此，研究鸡PTOLH的5/调控区的SNPs，有助于找到有意义的分子标记，为鸡的标记辅助选择 育种提供有利的理论依据。
【发明内容】
[0004] 根据现有技术，具体设及了一种鸡PTOLH基因5/调控区突变位点的分子标记方法 及其在育种中的应用。发明人发现鸡PTOLH 5/调控区存在2个突变位点，即-1827(A〉G)和- 165(C〉T)位点，并用S皿sis在线软件进行了连锁不平衡分析，结果发现运两个位点在隐性 白洛克鸡中呈现完全连锁状态。因此对其进行单个位点标记分析，结果发现两个位点均与 开产日龄及32周产蛋数相关，AC/GT基因型的开产日龄极显著早于GT/GT和AC/AC基因型，同 时32周产蛋数也极显著多于另外两种基因型。可见检测运两个与产蛋性状相关联的分子标 记，不仅方法简便快速，并且有助于选育高产蛋的鸡种，为育种工作提供有利的帮助。
[0005] 本发明的具体标记方法是：
[0006] 采用标记引物P-PTHLH，包括
[0007] P-PTHLH-F，其序列如Seq ID No:l所示；
[000引 P-PTHLH-R，其序列如SeqIDNo:2所示；
[0009]扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到 的序列如Seq ID No:3所示，结果检测到存在2个突变位点，即-1827(A〉G)和-165(Cパ)位 点。
[0010]在开产晚的群体中，选择AC/AC纯合基因型和GT/GT纯合基因型的公母鸡通过相互 交配得到AC/GT杂合基因型，由运样个体组成的群体具有开产早、产蛋数多的特点。
[0011 ]通过运种标记方法得到的AC/GT基因型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性 能低的地方品种中有意增加 AC/GT基因型的频率对提高产蛋量是一个有效措施，而对于开 产较晚的群体，运样的措施会使其开产提前，从而实现早期选种。 (四）
【附图说明】
[0012]图1为P-PTHLH-F/R引物PCR扩增的片段电泳图，
[OOK] 图2为鸡PTHLH 5/调控区-1827(A〉GK正向）、-165(C〉T)(反向）位点的多态性测序 图；
[0014]图3为隐性白洛克鸡中2个多态位点的连锁不平衡关系图；
[0015]图4为构建点突变PGL3-载体后序列比对结果；
[0016] 图5为Wt-PTHLH和mut-PirnH两种基因型及FSH处理后双巧光素酶报告基因启动活 性检测示意图； (五)
【具体实施方式】
[0017] 实施例1鸡PTHLH 5/调控区序列比对及多态性位点分析 [001引 1.试验材料
[0019] 48只隐性白洛克鸡（山东纪华家禽育种有限公司），随机采样，翅静脉采血，提取基 因组后，-20°C保存。
[0020] 2.试验方法
[0021] 2.1引物设计
[0022] 根据已发表红色原鸡序列(GenBank Accession NC_006088.4)设计引物P-PTHLH (其序列详见表巧日SeqIDNo:l/SeqIDNo:2)，此引物是为研究鸡PT化H5/调控区的突变 而根据数据库中登录的红色原鸡的序列特意设计的。
[0023] 2.2PCR 扩增
[0024] 随机选取48只隐性白洛克鸡基因组，用引物P-PTHLH进行PCR扩增。引物见表1，反 应体系20化，其中包括化L基因组DNA(50-100ng)，10M12XPrimeSTARGCBuffer，l.化L dNTPs(2.5mM each，TaKaRa)，上下游引物各0.5化（lOiiM)，0. liiLPrimeSTAR HSDNA 口〇17111日^3日（51]/化，了日1(日1?日），(1加2〇补足至20化。扩增程序：94°(：预变性5111111;98°(：变性 10sec，60°C退火15sec，72°C延伸2min，进行35个循环;循环结束72°C解育5min。
[0025] 将48只个体的PCR扩增产物随机混合分为6组，每组8个个体，进行琼脂糖凝胶电 泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(A巧Prep DNA Gel Extraction Kit,AXYGEN)进行回收，送济 南销尚生物技术公司测序。
[0026] 表1引物的序列、位置和退火溫度
[0027]
[002引3.结果与分析
[00巧]PCR产物电泳见附图1，目的片段2144bp。
[0030] 使用DMMAN version 7.0比对序列同源性和完成突变核巧酸的检索，用 C虹omasPro软件对测序结果分析，发现扩增的隐性白洛克鸡PTHL册/调控区-1827(A〉G)和- 165(C〉T)位点存在SNP(见附图2)。
[0031] 实施例2鸡PTHL册/调控区多态性与开产日龄和产蛋量的关联分析
[0032] 1试验材料
[0033] 随机选取50只济宁百日鸡(济宁大唐百日鸡保种场）、50只新杨褐鸡(上海家禽育 种有限公司）、50只议上芦花鸡（山东省济宁市议上县）、45只海兰褐鸡（山东泰安海兰褐育 种公司）和有产蛋记录的隐性白洛克鸡550只（山东纪华家禽育种有限公司）。^上均为随机 采样，翅静脉采血，提取基因组后，-20°C保存。
[0034] 2试验方法
[0035] 2.1PCR 扩增
[0036] W基因组为模版，进行PCR扩增。引物见表1，反应体系40化，其中包括化L基因组 DNA( 50-100ng)，20化2 X PrimeSTARGCBuf f er，3.化L dNTPs (2.5mM each，hKaRa)，上下游 引物各化L(1 OyM)，0.化LPrimeSTAR HSDNA po 1 ymerase(抓/化，hKaRa)，d地2〇补足至40y L。扩增程序:94°C预变性5min; 98°C变性lOsec，60°C退火15sec，72°C延伸2min，进行35个循 环;循环结束72°C解育5min。
[0037] PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(AxyPrep DM Gel Extraction Kit,AXYGEN)进行回收，送济南销尚生物技术公司测序。
[0038] 2.2单倍型构建及关联分析
[0039] 利用DNAMAN version 7.0和化romasPro对突变位点进行统计分析，R软件统计基 因型和基因型频率，S肥S is软件构建单倍型。
[0040] 数据统计采用SAS8.1统计软件包的化M程序进行基因型与性状(产蛋数、开产日 龄)的关联分析。不同基因型间的比较分析用最小二乘法，试验数据用最小二乘均值±标准 误表示化SM±SE)，显著水平设定P<0.05。
[0041] 3结果与分析
[0042] 3.1PTHLH 5/调控区2个突变位点在不同品种中基因型和等位基因频率的分布
[0043] 用S皿sis在线软件分析PTOLH 5/调控区2个突变位点在隐性白洛克鸡中的连锁不 平衡关系，结果表明：两个呈现完全连锁状态（附图3)。统计了白洛克、文昌鸡、济宁百日鸡 和议上芦花鸡品种的基因型和等位基因频率。分析结果见表2。
[0044] 由表2到表3可知，隐性白洛克550个个体中，-1827(4〉6)、-165(01')位点的优势等 位基因分别为A、C;野生纯合基因型和杂合基因型的频率均高于突变纯合基因型。不同品种
[0046] 中基因型频率及等位基因频率存在差异。[0045] 表2-1827多态位点的基因型和等位基因频率在不同品种中的分布
[0047]
[004引
[0049] 3.2PTHLH 5/调控区-1827(4〉6)、-165(01')位点多态性分析及其与生产性能的关 联分析
[00加]3.2.1隐性白洛克中口1^口15/调控区-1827(4〉6)、-165(01)位点多态性与生产性 能的关联分析
[0化。在550只隐性白洛克群体，分析PTOLH 5/调控区-1827、-165位点对开产日龄 (AFE)、32周产蛋数化32)及48周产蛋数化48)的效应，结果48周产蛋数未达到显著水平(P〉 0.05)，但是开产日龄与32周产蛋数均达到P<0.01的统计极显著水平，分别为AG型和CT型的 个体开产较早。表明两个突变位点杂合基因型均与开产早、32周产蛋高的性状有关联。 [0052]表4白洛克中不同基因型与开产日龄及产蛋数的关联分析
[0化3]
[0054] 注:表中数值为AFE(开产日龄)和E32(32周产蛋量）的最小二乘均值±标准误，不 含相同字母最小二乘均值间差异极显著(P<〇.01)。
[0055] 3.3PTHLH 5/调控区-1827和-165位点单倍型分析及其与生产性能的关联分析
[0056] 3.3. IPTHLH 调控区单倍型在不同品种中的分布
[0化7] 用PHASE软件对鸡PTOLH基因5/调控区-1827和-165突变位点构建单倍型，只有S 种单倍型:GT、GC和AC。由表5看出，鸡PWLH基因5/调控区-1827和-165突变位点构建的单倍 型，其频率在5个品种中存在差别，隐性白洛克鸡、议上芦花鸡均WAC单倍型占优势，海兰 褐、新杨褐和济宁白日鸡WGT单倍型占优势。
[005引表5PTHLH 5/调控区单倍型在不同品种中的分布
[0059:
[00側 3.3.2白洛克中PimH 5/调控区双倍型与开产日龄(AFE)、产蛋数化32)的关联分 析
[0061 ] 统计了550个有生产记录的白洛克个体，对-1827和-165两位点基因型构建双倍型 进行联合分析，结果(表6)显示基因型与开产日龄(P = 0.0008)及32周产蛋数(P = 0.0002) 关系达到了极显著水平，AC/GT对应较小的开产日龄（176.46d)及较多的32周产蛋数(35.8 个），GT/GT和AC/AC对应较大的开产日龄(约179d)及较少的32周产蛋数(33个）。
[0062] 表6双倍巧与开产日龄及产蛋数的最小二乘均値及标准误
[0063]
[0064] 注:表中数值为AFE(开产日龄)和E32(32W产蛋量）的最小二乘均值±标准误，不含 相同字母最小二乘均值间差异极显著(P<〇.01)。
[0065] 实施例3鸡PTHLH 5/调控区多态位点对基因表达的影响
[0066] 1试验材料
[0067] 随机采样泰安市临溪村养殖场的高峰产蛋期的健康海兰褐鸡(3-5只），
[0068] 2试验方法
[0069] 2.1PTHLH 5/调控区多态位点突变型巧光素酶表达载体的构建
[0070] 1)在隐性白洛克群体中选PTHLH 5/调控区-1827和-165位点分别为野生型和突变 型的个体两只，W其DNA为模板来获得wt-PWLH和mut-PTHLH序列，扩增片段长度为2144bp， 引物序列同Seq ID N0.I和2。
[0071] 2)PCR 扩增
[0072] 扩增反应采用高保真酶Pr imeSTAR，反应体系（20ul)包括：2 X PrimeSTARGC Buffer lOuia.化L dNTPs(2.5mM eachJaKaRa)，加 Miel和Kpnl酶切位点的上下游引物各 0.5化（10山〇，化LPrimeSTA畑Spolymerase(511/化，TaKaRa)，1化基因组DNA，d地2〇补足至20 化。扩增程序:94°C预变性4min;98°C变性10sec，60°C退火15sec，72°C延伸2min，进行35个 循环;循环结束72°C，解育5min。
[0073] PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(AxyPrep DM Gel Extraction Kit,AXYGEN)进行回收，然后进行连接转化，提取质粒后，酶切验证，选择 阳性克隆菌液送济南销尚生物技术公司测序，分析突变位点是否分别是野生型和突变型。
[0074] 3)去内毒素质粒的制备
[0075] 用TIANGEN公司的化doFree Maxi Plasmid Kit去内毒素质粒大提试剂盒，按照说 明书进行操作。
[0076] 将构建好的wt-PWLH和mut-PTHLH载体质粒，重新转化感受态细胞，挑取单克隆菌 落，进行摇菌，用TIANGEN公司的去内毒素质粒大提试剂盒提取双巧光素酶表达载体质粒， 用于原代细胞的转染。
[0077] 2.2鸡卵泡膜细胞的分离培养
[0078] 1)高峰期产蛋海兰褐母鸡，手术刀划开颈脉，放血处死后用灭菌剪刀创开腹腔，剪 下整个卵巢(注意不要将卵泡弄破），然后迅速投放至盛有3%双抗的憐酸缓冲液的烧杯中， 封上锡锥纸后，带入无菌间进行分离操作。
[0079] 2)分离方法依据Gi化ert(1997)及康丽(2009)等的文献进行。
[0080] 在超净台上，将各级卵泡分为等级前卵泡(<12mm)和等级卵泡(〉12mm)，用眼科剪 刀从卵泡蒂处剪开取下，放至盛有3%双抗的憐酸缓冲溶液的灭菌的平皿中，左手用眼科綴 子夹住卵泡蒂处，右手用眼科綴子顺着卵泡将膜细胞层剥离下来，放入憐酸缓冲溶液中，并 冲洗两=次，W尽量洗去膜层上残留的血管，从而分离到纯度较高的膜细胞。
[0081] 3)分离完成后，在灭菌的小烧杯中用眼科剪刀将膜细胞层充分剪碎，之后加入适 量已预热的0.1 % II型胶原酶，放入38°C、5%C〇2培养箱中消化25min，每5min晃动一次烧杯 W充分消化组织，消化后加入含有血清的M199培养基W终止消化。
[0082] 4)在超净台上用200目铜网将消化完毕的细胞混合液，过滤至lOOmL灭菌的烧杯 中，然后分装到15mL离屯、管中，4000rpm离屯、8min，收集细胞沉淀，弃去滤液;每管再加适量 M199培养基轻轻吹打，重悬细胞沉淀，离屯、弃滤液，共=次。
[0083] 5)离屯、洗涂完后，吹匀细胞，取少量细胞悬液放入等体积的0.1 %台吩蓝，用血球 计数板进行计数，计算细胞存活率应在90% W上;按所需的细胞量接种在12孔培养板，每孔 细胞数1~2 X 106为宜，38.5 °C静置培养，C〇2浓度为5 %。
[0084] 6)接种的细胞在12小时后进行部分换液，24小时后可进行全部换液。当细胞培养 至80 % W上汇合率时，方可进行转染实验。
[0085] 2.3质粒0臟转染实验
[0086] 1)转染前两小时换液，更换新鲜的完全培养基。
[0087] 2)制备化nofection/DNA混合液（12孔板)a.每孔化曲NA质粒+100uL无血清高糖 DMEM与1.5mL离屯、管中，轻轻混匀;b.按照每孔化LNanofection加入量，轻轻蜗旋(移液枪轻 轻吹打5~10s);C.室溫解育15min，使形成Nanofection/DNA复合体。
[0088] 3)每孔加入lOOuLNanofection/DNA复合体，轻晃培养板使其均匀分布。
[0089] 4)38.5°C5%(X)2培养箱内静置培养，24小时后换液，实验组用lOng/ml F細处理 2地，转染48小时后检测转染效率。
[0090] 5)阴性对照pGL3-Basic载体W相同的条件作为对照组共转染培养的细胞。相同的 转染共做2次，膜细胞来自于不同的鸡个体，即做了两个独立的转染实验。
[0091] 2.4双巧光素酶活性测定
[0092] 用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System双巧光素酶报告基 因检测试剂盒，来检测报告基因的表达水平，严格按照说明书进行如下操作：
[0093] 1)细胞的裂解：用PBS缓冲液洗涂细胞2~3次，加入10化1 1 X化B细胞裂解液，充 分混匀，于37°C摇床15minW保证PLB裂解液充分将细胞裂解；
[0094] 2)充分裂解后，10,000~15,000 Xg离屯、3~5min，取上清用于测定；
[00M] 3)融解蛋火虫巧光素酶和Renilla巧光素酶检测试剂，并达到室溫。按照每个样品 需10化1的量加入LARII试剂，反复吸打2~3次混匀。开启巧光测定仪，开始读数，记录下蛋 火虫巧光素酶的活性值Ml。
[0096] 4)然后加入lOOjil的Stop&Glo Reagent，将样品管重新放入luminometer中，开始 读数。记录下Reni 1 la巧光素酶值M2。
[0097] 5)在内参为Renilla巧光素酶的情况下，用测定得到的蛋火虫巧光素酶化U值除W 巧憶得到的Renilla巧光素酶RLU值。根据所得的M1/M2值即为报告基因的相对表达水平。 [009引 2.5统计分析
[0099] 数据统计采用t检验，进行两两比较，数据用平均数±标准误表示，P<0.05为差异 显著，P<0.01为差异极显著。
[0100] 3结果与分析
[0101] 3.1多态位点突变测序
[0102] 点突变过程的PCR扩增使用高保真酶，有力的保证了不同等位基因间除突变位点 外其他序列的一致性，突变结果如图4。
[0103] 3.2野生型和突变型报告基因的启动活性
[0104] 双巧光素酶报告基因检测结果如图5和表7所示，F甜能显著提高wt-PTHLH(AC/AC) 野生型和mut-PTHLH(GT/GT)突变型的启动效率(P<0.05)，mut-PTHLH(GT/GT)突变型的启动 效率极显著高于wt-PTHLH(AC/AC)野生型（P<0.0001)，且mut-PTHLH(GT/GT)突变型对F甜的 应答也极显著高于wt-PTHLH(AC/AC)野生型(P<0.0001)。
[0105] 表7PTHL册' 调控区不同基因型对PTHLH基因启动活性的影响
[0106]
[0107]综合W上结果：
[010引通过W上5个鸡品种比较，表明PTHLH基因在-1827和-165位点存在碱基突变，且在 不同品种中存在不同的连锁不平衡关系，其中，隐性白洛克鸡中该两个位点是完全连锁。在 白洛克鸡中该两个位点基因型与繁殖性状相关，AC/GT基因型个体开产日龄极显著早于GT/ GT和AC/AC基因型个体(P<0.001)，且32周产蛋数也极显著多于另外两种基因型(P<0.001)。 双巧光素酶检测结果表明FSH能显著增加 GT/GT突变型和AC/AC野生型的启动效率（P< 0.05)，GT/GT型的启动效率极显著高于AC/AC型(P<0.0001)，对F甜的应答也极显著高于AC/ AC型（P<0.0001)。
[0109] 由此，通过运种标记方法得到的AC/GT型种鸡能兼顾开产日龄和产蛋数，在产蛋性 能低的地方品种中有意增加 AC/GT的频率对提高产蛋量是一个有效措施，而对于开产较晚 的群体，运样的措施会使其开产适当提前，从而实现早期选种。具体示例如下：
[0110] 白洛克鸡原属兼用型，于1937年美国着手向肉用型改良，后经不断改良，鸡的体型 外貌与生产性能均有很大改变，现主要作肉鸡配套杂交母系使用。开产日龄(60% W上产蛋 率）164~208天，其年产蛋数在150~160枚。表6白洛克群体的数据分析结果显示:GT/GT与 AC/AC型个体的平均开产日龄约179天，32周龄平均产蛋数均为33枚;AC/GT型个体的开产日 龄平均为176天，32周龄产蛋数平均为35.8枚。所W，应选育AC/GT型鸡。
[0111] 通过W上育种得到的AC/GT型能兼顾开产日龄和产蛋数，可W进一步提高整个群 体的产蛋性能。
【主权项】
1. 鸡PTHLH基因5'调控区两个突变位点的分子标记方法，具体标记方法是： 采用标记引物P-PTHLH，包括 P-PTHLH-F，其序列如Seq ID No:l所示； ?-卩1'1!1-1?，其序列如569 10吣:2所示； 扩增鸡育种材料的基因组DNA，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳并回收，经测序得到的序 列如Seq ID如:3所示，结果检测到存在2个突变位点，8卩-1827以>6)、-165(01')位点。2. 如权利1要求所述的标记方法，其特征在鸡育种中的应用方法是：在开产晚的群体 中，选择AC/AC纯合基因型和GT/GT纯合基因型的公母鸡通过相互交配得到AC/GT杂合基因 型，即可以得到开产早、产蛋高的群体。
【文档编号】C12Q1/68GK106048043SQ201610544176
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】姜运良, 郭晓莉, 张彤彤, 栾雅童, 李培钊, 辛倩, 康丽
【申请人】山东农业大学