与异黄酮类物质合成及光合作用相关的基因及分子标记的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与异黄酮类物质合成及光合作用相关的基因及分子标记。本发明提供了大豆基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性或用于检测大豆基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质在如下(a)或(b)中的应用：(a)鉴定或辅助鉴定大豆异黄酮类物质合成能力高低；(b)鉴定或辅助鉴定大豆光合作用强弱；所述SNP位点在大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核苷酸序列的第1958位；所述SNP位点处的核苷酸为A或G。本发明对于改善大豆品质，培育大豆新品种具有重要意义。
【专利说明】
与异黄酬类物质合成及光合作用相关的基因及分子标巧
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种与异黄酬类物质合成及光合作用相关的基因 及分子标记。
【背景技术】
[0002] 高等植物通过光合反应将C〇2和也0等无机物转化为薦糖、淀粉等有机物，同时将光 能转化为稳定的化学能储存在有机物中，为光合生物自身提供物质和能量来源。很多研究 表明，光合作用的效率直接影响了农作物的产量和品质，因此研究作物的光合作用对于提 高作物产量和改善作物品质具有非常重要的意义。
[0003] 异黄酬，是植物苯丙氨酸代谢过程中，由肉桂酷辅酶A侧链延长后环化形成W苯色 酬环为基础的酪类化合物，其3-苯基衍生物即为异黄酬，属植物次生代谢产物。大豆异黄酬 是黄酬类化合物，是大豆生长中形成的一类次级代谢产物，是一种生物活性物质。由于是从 植物中提取，与雌激素有相似结构，因此大豆异黄酬又称植物雌激素。大豆异黄酬的雌激素 作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，是天然的癌症化学预 防剂。
[0004] 因此，不断发现新的与调控植物异黄酬类物质合成及光合作用相关的基因及分子 标记意义重大，对于改善农作物(如大豆)的产量和品质都具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种与异黄酬类物质合成及光合作用相关的基因及分子标 记。
[0006] 本发明首先提供了大豆基因组中如下SNP位点的单核巧酸多态性或用于检测大豆 基因组中如下SNP位点的单核巧酸多态性的物质在如下(a)或(b)中的应用：
[0007] (a)鉴定或辅助鉴定大豆异黄酬类物质合成能力高低；
[000引（b)鉴定或辅助鉴定大豆光合作用强弱；
[0009] 所述SNP位点在大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核巧酸序列的第1958位； 所述SNP位点处的核巧酸为A或G。
[0010] 其中，所述"用于检测大豆基因组中如下SNP位点的单核巧酸多态性的物质"也属 于本发明的保护范围。
[0011] 在本发明中，所述"用于检测大豆基因组中如下SNP位点的单核巧酸多态性的物 质"，具体可为如下a)或b):
[001^ a)引物对，为如下(al)或(曰2):
[OOK] (al)由序列表中序列4所示的单链DNA和序列表中序列5所示的单链DNA组成的引 物对；
[0014] (a2)由将序列表中序列4和序列5经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或 添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(al)中所述引物对功能相同的引物 对；
[001引 b)所述引物对和限制性内切酶Pvu II或其同裂酶。
[0016] 基于W上SNP的位点的应用，本发明还提供了如下(A)或(B):
[0017] (A)鉴定或辅助鉴定待测大豆的异黄酬类物质合成能力高低的方法，包括如下步 骤:检测待测大豆的基因组中如下SNP位点处的核巧酸为A还是G还是A和G，W确定所述待测 大豆的基因型是A:A还是G:G还是A:G，根据所述待测大豆的基因型按照如下确定所述待测 大豆的异黄酬类物质合成能力高低:G:G基因型和A:G基因型的所述待测大豆的异黄酬类物 质合成能力均高于A:A基因型的所述待测大豆的异黄酬类物质合成能力；
[0018] 所述SNP位点在大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核巧酸序列的第1958位； 所述SNP位点处的核巧酸为A或G。
[0019] (B)鉴定或辅助鉴定大豆光合作用强弱的方法，包括如下步骤:检测待测大豆的基 因组中如下SNP位点处的核巧酸为A还是G还是A和G，W确定所述待测大豆的基因型是A:A还 是G:G还是A:G，根据所述待测大豆的基因型按照如下确定所述待测大豆的光合作用强弱： G:G基因型的所述待测大豆的光合作用弱于A:G基因型的所述待测大豆的光合作用弱于A:A 基因型的所述待测大豆的光合作用；
[0020] 所述SNP位点在大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核巧酸序列的第1958位； 所述SNP位点处的核巧酸为A或G。
[0021] 其中，所述A:A基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核巧酸序列的第 1958位为A的纯合型;所述G:G基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核巧酸序 列的第1958位为G的纯合型;所述A:G基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核 巧酸序列的第1958位为A和G的杂合型。
[0022] 在所述(A)中，所述异黄酬类物质合成能力的高低具体W大豆种子或由大豆种子 所生成的豆芽中异黄酬类物质的含量的多少来衡量。所述G:G基因型和所述A:G基因型的所 述待测大豆的种子或豆芽中异黄酬类物质的含量均显著高于所述A:A基因型的所述待测大 豆的种子或豆芽中异黄酬类物质的含量。
[0023] 在所述(B)中，所述光合作用的强弱具体W叶片颜色和/或叶片中叶绿素的含量来 衡量。所述G:G基因型的所述待测大豆的叶片中叶绿素的含量显著低于所述A:G基因型的所 述待测大豆的叶片中叶绿素的含量显著低于所述A:A基因型的所述待测大豆的叶片中叶绿 素的含量。相应的，所述G:G基因型的所述待测大豆的叶片呈现黄色;所述A:G基因型的所述 待测大豆的叶片呈现浅绿色;所述A:A基因型的所述待测大豆的叶片呈现绿色。
[0024] 在所述方法中，所述"检测待测大豆的基因组中如下SNP位点处的核巧酸为A还是G 还是A和G"的方法可为测序分析法或酶切鉴定法。
[0025] 所述测序分析法具体可包括如下步骤：W所述待测大豆的基因组DNA为模板，采用 所述引物对(序列4和序列5)进行PCR扩增，得到扩增产物;对所述扩增产物进行测序，根据 测序结果按照如下确定所述待测大豆基因组中所述SNP位点处的核巧酸为A还是G还是A和 G:若所述扩增产物为如下（1)，则所述待测大豆基因组中所述SNP位点处的核巧酸为A;若所 述扩增产物为如下(2)，则所述待测大豆基因组中所述SNP位点处的核巧酸为G;若所述扩增 产物为如下(3)，则所述待测大豆基因组中所述SNP位点处的核巧酸为A和G;
[0026] (1)单一 DNA片段:如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958位为A;
[0027] (2)单一 DM片段:如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958位为G;
[002引 （3)两个DNA片段:一个DNA片段如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958 位为A;另一个DNA片段如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958位为G;
[0029] 所述酶切鉴定法具体可包括如下步骤：W所述待测大豆的基因组DNA为模板，采用 所述引物对(序列4或序列5)进行PCR扩增，得到扩增产物;对所述扩增产物采用限制性内切 酶Pvu II进行完全酶切，根据酶切结果按照如下确定所述待测大豆基因组中所述SNP位点 处的核巧酸为A还是G还是A和G:若所得酶切产物为784bp和32化P两个DNA片段，则所述待测 大豆基因组中所述SNP位点处的核巧酸为A;若所得酶切产物为1109bp单一 DNA片段，则所述 待测大豆基因组中所述SNP位点处的核巧酸为G;若所得酶切产物为784bp、32化P和1109bp S个DM片段，则所述待测大豆基因组中所述SNP位点处的核巧酸为A和G。
[0030] 所述物质或所述方法在大豆育种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0031] 本发明还提供了如下几种培育具有目标性状的大豆品种的方法。
[0032] (C)培育异黄酬类物质合成能力提高的大豆品种的方法，具体可包括选择A:G基因 型的大豆作为亲本进行育种的步骤;所述A:G基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2 所示核巧酸序列的第1958位为A和G的杂合型。
[0033] (D)培育异黄酬类物质合成能力降低的大豆品种的方法，具体可包括选择A:A基因 型的大豆作为亲本进行育种的步骤;所述A:A基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2 所示核巧酸序列的第1958位为A的纯合型。
[0034] 化)培育光合作用减弱的大豆品种的方法，具体可包括选择A:G基因型的大豆作为 亲本进行育种的步骤;所述A:G基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核巧酸序 列的第1958位为A和G的杂合型。
[0035] (F)培育光合作用加强的大豆品种的方法，具体可包括选择A:A基因型的大豆作为 亲本进行育种的步骤;所述A:A基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核巧酸序 列的第1958位为A的纯合型。
[0036] 另外，本发明还提供了如下生物材料及其应用。
[0037] 所述生物材料(记为生物材料A)，具体可为如下中任一种：
[0038] (I)蛋白质，为将序列表中序列1所示的氨基酸序列中第275位的Gin突变为Arg后 形成的蛋白质；
[0039 ] (II)编码所述蛋白质的核酸分子；
[0040] 具体的，所述核酸分子为如下（II-1)或（11-2):(11-1)核巧酸序列如序列表中序 列2所示，且第1958位为G;(II-2)核巧酸序列如序列表中序列3所示，且第824位为G。
[0041] (III)含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物。
[0042] 所述应用具体为:所述生物材料在培育异黄酬类物质合成能力提高的植物品种中 的应用，或者所述生物材料在培育光合作用减弱的植物品种中的应用。
[0043] 再有，生物材料B在培育光合作用加强和/或异黄酬类物质合成能力降低的植物品 种中的应用也属于本发明的保护范围；
[0044] 所述生物材料B，具体为如下中任一种：
[0045] (I)蛋白质，氨基酸序列如序列表中序列1所示；
[0046] (II)编码所述蛋白质的核酸分子；
[0047]具体的，所述核酸分子为如下（II-l)或（11-2):(11-1)核巧酸序列如序列表中序 列2所示，且第1958位为A;(II-2)核巧酸序列如序列表中序列3所示，且第824位为A。
[004引在上述两种应用中，所述植物均既可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
[0049] 在本发明中，所述植物具体为双子叶植物大豆。更加具体的，在本发明的一个实施 例中，所述大豆具体为y(yellow)突变体(PI 547612)。该突变体分离产生的3种基因型植 株:野生型Y/Y植株，杂合Y/y突变体和纯合y/y突变体。
[0050] 在本发明中，所述异黄酬类物质具体可选自如下中的任一种或任几种:5，6，7，4 ' - Tetr曰hydroxy-3 '-methoxyisof1曰vone diglucoside、D曰idzeiruD曰idzein 7,4 '-di-〇- glucoside、D曰idzein glucoside 曰pioside-1、D曰idzein glucoside 曰pioside-2、 DaidziruGenistein T-O-glucoside-护-malonate/Malonylgenistin-1、Genistein 7-0- glucoside-6'' -malonate/Malonylgenistin-2、Genistein glucoside、Genistein glucoside glucoside、Genistin、Malonyldaidzin-l、Malonyldaidzin-2、0robol 7-0- glucoside、Biochanin A T-O-glucoside-护-malonate/Malonylglycitin-1、Biochanin A 7-〇-glucoside-6''-malonate/Malonylglycitin-2、Genistein apioside glucoside、 Malonyld3idzin-3、Pentehydroxyisofl3vone。
[0051] 本发明研究发现，大豆GmCHLIl基因中由于特定SNP位点A-G的突变(在大豆基因组 中对应于序列表中序列2所示核巧酸序列的第1958位的SNP位点)会导致大豆植株异黄酬类 物质的合成能力提高，同时使得光合作用减弱（叶片颜色发黄，叶片中叶绿素含量降低）。本 发明对于改善大豆品质，培育大豆新品种具有重要意义。
【附图说明】
[0052] 图1为y突变体的表型描述。其中，A为22°C、16时光照/別寸黑暗条件下生长十四天 的Y/Y、Y/y和y/y植株。B为A中巧巾单叶化1 a(叶绿素 a)、化1 b(叶绿素 b)和类胡萝h素含量， 误差值为=次重复的标准差。
[0053] 图2为各供试大豆材料基因型的检测结果。其中，泳道1为未经Pvu II酶切的野生 型Y/Y植株;泳道2为Marker;泳道3为纯合y/y突变体经Pvu II酶切;泳道4为杂合Y/y突变体 经Pvu II酶切；泳道5为野生型Y/Y植株经Pvu II酶切；泳道6为大豆品种Williams 82(PI 518671)经Pvu II酶切。
[0化4] 图3为GmOlLIl基因拟南芥中的互补试验。大约4周左右的化k、cs215/+和有代表性 的T2代转基因植株W及两周大的CS215/CS215幼苗被拍照。
[0055] 图4为转基因的表达量和转基因植株中的叶绿素含量的相关性分析。总RNA和叶绿 素提取自颜色相近的T2代转基因拟南芥的混合莲座叶。误差值为至少3次重复的标准差。
【具体实施方式】
[0056] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0057] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[005引 y(yellow)突变体(PI 547612)来源于美国农业部的种资资源库，该资源库的种资 资源面向公众开放，可用于科研相关，可W在http: //www. ars-grin. gov/npgs/acc/acc_ queries .html中输入PI编号查到，名称为L74-826。它表现出半显性的失绿表型:纯合的y/y 突变体植株黄化致死，杂合的Y/y突变体为叶片浅绿色，野生型Y/Y植株叶片为正常的绿色 (图1)。公众可从
【申请人】处获得，仅可用于重复本发明试验使用。
[0059] PFGC5941 载体：参考文献 Mcginnis et al. (2005). Transgene-Induced RNA Interference as a Tool for Plant Functional Genomics.Methods in Enzymology 392,1-24.公众可从
【申请人】处获得，仅可用于重复本发明试验使用。
[0060] 拟南芥突变体CS215和其相对应的化k野生型：参考文献化ang and Li. (2009) .Arabidopsis 0化12化]1 Substitute for CHLIl.Plant Physiology 150,636-645.文献 中提及本生物材料的具体描述如下:野生型化k植株为绿色，纯合的CS215突变体白化致死， 杂合的CS215突变体叶片为浅绿色。公众可从
【申请人】处获得相应的拟南芥材料，仅可用于重 复本发明试验使用。
[0061] 农杆菌菌株GV3101:参考文献Berrs et al.(1992).Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T-6b gene.Plant Cell Reports 11,192-195.公众可从
【申请人】处获得，仅可用于重复本发明试 验使用。
[0062] 实施例1、大豆GmCHLIl基因中特定SNP位点的发现
[0063] -、y突变体的表型分析
[0064] 杂合Y/y突变体，纯合y/y突变体W及其对应的野生型Y/Y植株在22°C、16时光照/8 时黑暗条件下生长十四天左右的表型见图1中A。野生型Y/Y植株叶片为绿色，杂合Y/y突变 体叶片为浅绿色，纯合的y/y突变体植株为黄色。为了进一步描述y突变体的失绿或黄化表 型，发明人检测了 S种植株叶片里的叶绿素和类胡萝h素含量（图1中B)。结果表明y/y植株 中几乎没有叶绿素的存在，而Y/y植株的叶绿素含量居于Y/Y植株和y/y植株之间。与叶绿素 的变化趋势类似，类胡萝h素在Y/y植株和y/y植株叶片中的含量也明显降低。运表明y突变 体的失绿表型是由叶绿素的含量降低引起的，而不是由于类胡萝h素的含量升高造成的。
[0065] 二、GmCHLIl基因及特定SNP位点的发现
[0066] 通过图位克隆和基因测序的方法，从大豆中鉴定到一个控制y突变体失绿性状的 基因。由于该基因是编码儀馨合酶I亚单位的同源基因，因此将其命名为GmOlLIl基因。其基 因组序列如序列2(第1958位为A)所示(包括3个外显子），编码区序列如序列3(第824位为A) 所示，编码的GmCHLIl蛋白序列如序列1所示。纯合的y/y突变体与野生型Y/Y植株相比，序列 3所示的GmOlLIl编码区序列中的824位核巧酸发生了 A至化的突变(对应序列2的第1958位）， 导致序列1所示的蛋白序列中275位的Gin突变为Arg。杂合的Y/y植株在运一核巧酸位置(对 应序列2的第1958位)则是杂合的基因型。
[0067] 实施例2、y突变体的种子和豆芽中异黄酬类物质的测定
[0068] 供试材料：由杂合Y/y突变体分离产生的3种基因型植株。其中，"杂合Y/V'即表示 大豆基因组中GmOlLIl基因（序列2)的第1958位核巧酸为A和G的杂合；"纯合y/y"即表示大 豆基因组中GmCHLIl基因（序列2)的第1958位核巧酸为纯合G;"野生型Y/r即表示大豆基因 组中GmCHLIl基因（序列2)的第1958位核巧酸为纯合A。
[0069] -、杂合Y/y突变体分离产生的种子或豆芽的基因型鉴定
[0070] 方法1 :PCR产物测序法 [007U 1、PCR 扩增
[0072] W杂合Y/y突变体分离产生的待测种子或豆芽的基因组DM为模板，用引物1和引 物2进行PCR扩增。
[0073] 引物1:5' -TGTAAATGAGGCAGTATGTGAACTT-3'（序列4);
[0074] 引物2:5'-CGGCACTTACGTTGTCTCTTC-3'（序列5)。
[0075] 将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0076] 结果显示，所得PCR产物长度为1109bp，为目的扩增条带。
[0077] 2、PCR产物测序
[0078] 对所得PCR扩增产物（1109bp)进行测序。若所述扩增产物为如下（1)，则所述待测 植株的基因型为"野生型Y/Y";若所述扩增产物为如下(2)，则所述待测植株的基因型为"纯 合y/y";若所述扩增产物为如下(3)，则所述待测植株的基因型为"杂合Y/V' ；
[0079] (1)单一 DNA片段:如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958位为A;
[0080] (2)单一 DNA片段:如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958位为G;
[0081 ] (3)两个DNA片段:一个DNA片段如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958 位为A;另一个DNA片段如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958位为G。
[0082] 方法2: PCR产物限制性酶切法
[008；3] 1、PCR 扩增
[0084] W杂合Y/y突变体分离产生的待测种子或豆芽的基因组DNA为模板，用引物1和引 物2进行PCR扩增。
[00化]引物1:5' -TGTAAATGAGGCAGTATGTGAACTT-3'（序列4);
[00化]引物2:5'-CGGCACTTACGTTGTCTCTTC-3'（序列5)。
[0087] 将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0088] 结果显示，所得PCR产物长度为1109bp，为目的扩增条带。
[0089] 2、限制性内切酶Pvu II完全酶切
[0090] 由于GmCHLI 1基因（序列2)的第1958位的碱基变化(SNP = A/G)，使得：当为A(野生 型）时形成限制性内切酶Pvu II的识别序列（CAG化TG，下划线处为突变碱基a表示酶切位 置），可W被Pvu II切开;而当为G(突变型）时不能形成限制性内切酶Pvu II的识别序列，因 而不能被Pvu II切开。
[0091] 将经步骤1扩增得到的片段用限制性内切酶Pvu II完全酶切后，酶切产物再次进 行琼脂糖凝胶电泳检测（图2)。
[0092] 若所得酶切产物为784bp和32化P两个DNA片段，则所述待测大豆基因组中所述SNP 位点处的核巧酸为A;若所得酶切产物为1109bp单一 DNA片段，则所述待测大豆基因组中所 述SNP位点处的核巧酸为G;若所得酶切产物为784bp、32化P和1109bpS个DNA片段，则所述 待测大豆基因组中所述SNP位点处的核巧酸为A和G。
[0093] 将上述1109bp的DNA片段回收测序，发现其序列为序列表中序列2,第1958位核巧 酸为G。将上述784bp的DNA片段回收测序，发现其序列为序列表中序列2的第1-784位(序列2 的第1958位为A);将上述32化P的DNA片段回收测序，发现其序列为序列表中序列2的第785- 1109位，与预期结果完全一致。
[0094] 二、大豆种子样品准备
[00M]分别收集野生型Y/Y植株和杂合Y/y植株的成熟种子。进一步用液氮对来自杂合Y/ y植株的单粒种子进行研磨，研磨的粉末少部分用来提取DNAW检测Y/y植株所结种子的基 因型（杂合Y/y，纯合y/y或者是其对应的野生型Y/Y)，剩余的大部分样品经真空低溫冷冻干 燥机中干燥后保存于-80°C备用。根据检测的基因型对大豆种子进行分类，每类样品至少10 粒种子样本进行混合。
[0096] S、大豆豆芽样品准备
[0097] 分别收集野生型Y/Y植株和杂合Y/y植株的成熟种子。将收集的种子置于荣威牌豆 芽机中，按照说明书要求暗培养4天左右，此时豆芽大约长度8-lOcm。取单棵豆芽在液氮中 研磨成粉末，少部分用来提取DNAW检测豆芽的基因型（杂合Y/y，纯合y/y或者是其对应的 野生型Y/Y)，剩余的大部分在真空低溫冷冻干燥机中干燥后保存于-80°C备用。根据检测的 基因型对豆芽进行分类，每类样品至少10棵豆芽样本进行混合。
[0098] 四、异黄酬类物质检测
[0099] 大豆种子和豆芽中异黄酬类产物测定采用液相色谱-串联质谱化C-MS/MS)法。代 谢产物的具体提取和分析步骤参考化ang等人的文献，（化ang et al. ,(2012).化ip-based nanoflow high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry for profiling of soybean fl曰vonoids.Electrophoresis 33,2399-2406.)。Wdaidzin (异黄酬巧)为外标进行计算各代谢物的相对含量，单位为(Miol/g干重）。
[0100] 结果表明：基因型为"杂合Y/y" W及"纯合y/y"的大豆种子中的异黄酬类物质的总 含量(总摩尔质量)相对于基因型为"野生型Y/Y"的大豆种子中的异黄酬类物质的总含量来 说均明显升高。另外，基因型为"杂合Y/V'W及"纯合y/y"的豆芽中的异黄酬类物质的总含 量(总摩尔质量)相对于基因型为"野生型Y/Y"的大豆豆芽中的异黄酬类物质的总含量来说 也均明显升高。比较豆芽与种子中的异黄酬水平，发现它们的异黄酬总含量相差并不是很 大，豆芽相对于种子仅稍有升高。运暗示豆芽中的异黄酬含量主要来源于成熟的种子，自身 很少或并不合成异黄酬。各基因型大豆种子和豆芽中各类异黄酬物质的详细变化情况见表 巧口表2。
[0101] 表1大豆y突变体种子的异黄酬类物质含量分析
[0102]
[0103] 注:次级代谢产物Wdaidzin作为外标物进行计算各代谢物的相对质量，单位为(ii mol/g干重）。加粗的物质代表该物质在Y/y基因型种子或者y/y基因型种子中含量相比于Y/ Y基因型种子中的含量显著上调(P<0.05)。
[0104] 表2大豆y突变体豆芽中异黄酬类物质含量分析
[01051
Ail 注:次级代谢产物Wdaidzin作为外标物进行计算各代谢物的相对质量，单位为(ii mol/g干重）。加粗的物质代表该物质在Y/y基因型豆芽或者y/y基因型豆芽中含量相比于Y/ Y基因型豆芽中的含量显著上调(P<0.05)。
[0108] 实施例3、大豆GmCHLIl基因中特定SNP位点在不同大豆品种基因型及表型鉴定中 的应用
[0109] 供试大豆品种：由杂合Y/y突变体分离产生的3种基因型植株W及Williams 82 (PI518671)和yll(PI 547614,名称为L74-838)。所有大豆材料均来源于美国农业部的种资 资源库，该资源库的种资资源面向公众开放，可用于科研相关，可W在http://ww.ars- grin.gov/吨 gs/acc/acc_que;ries .html 中输入 PI 编号查到。
[0110] -、各供试大豆材料的基因型鉴定
[0川]方法1 :PCR产物测序法
[0112] 参照实施例2进行。 方法2: PCR产物限制性酶切法 参照实施例2进行。
[0115] 二、各供试大豆材料的叶片颜色观察 S、结果 结果显示：由杂合Y/y突变体分离产生的基因型为"野生型Y/r (即大豆基因组中 序列2所示GmOlLIl基因的第1958位核巧酸为纯合A)的植株的叶片呈现绿色；由杂合Y/y突 变体分离产生的基因型为"杂合Y/V'（即大豆基因组中序列2所示GmOlLIl基因的第1958位 核巧酸为A和G的杂合）的植株的叶片呈现浅绿色；由杂合Y/y突变体分离产生的基因型为 "纯合y/V'（即大豆基因组中序列2所示GmOlLIl基因的第1958位核巧酸为纯合G)的植株的 叶片呈现黄色。大豆品种Williams 82(PI 518671)经上述步骤一检测为基因组中序列2所 示GmOlLIl基因的第1958位核巧酸为纯合A，其叶片呈绿色；大豆品种yll(PI 547614)经上 述步骤一检测为基因组中序列2所示GmCHLIl基因的第1958位核巧酸为A和G的杂合，其叶片 呈浅绿色。部分供试大豆材料的基因型的检测结果如图2所示。
[011引实施例4、正常未突变的GmCHLIl蛋白功能的验证
[0119] -、重组质粒的构建
[0120] 1、提取野生型Y/Y植株的总RNA，并将其反转录为cDNA。
[0121] 2、W步骤1反转录的cDNA为模板，用引物3和引物4组成的引物对进行PCR扩增，得 至化CR扩增产物。
[0122] 引物3:5 ' -ctcgagCAAAAGAAACAAACTGCTACAT-3 '（该序列为5 ' utr上的序列）。
[0123] 引物4:5' -actagtTCAGCTGAATACCTCATAAAAT-3'。
[0124] 3、用限制性内切酶趾0 I和Spe I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0125] 4、用限制性内切酶趾0 I和Spe I双酶切PFGC5941载体，回收约9927bp的载体骨 架。
[0126] 5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒甲。根据测序结果， 对重组质粒甲进行结构描述如下:在pFG巧941载体的趾0 I和Spe I酶切位点之间插入了含 有序列表的序列3 (第824位为A)所示DNA片段的双链DNA分子。
[0127] 二、转基因植物甲的获得
[0128] 1、将重组质粒甲导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
[01巧]2、将步骤1得到的重组农杆菌采用花浸泡法（Clough and Bent. (1998).Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal 16,735-743.)转化侵染杂合的cs215拟南芥 突变体，获得35S: :GmCHLIl转基因 Ti代种子。T2代表示Ti代自交产生的种子及由它所长成的 植株。用15yg/L的Bas ta筛选Ti代植株并进行T2代的分离比统计。
[0130] S、转基因植物的表型分析
[0131] 1、表型观察
[0132] 拟南芥转基因结果表明，GmOlLIl能像拟南芥AtCHLIl-样完全或部分互补拟南芥 CS215突变体的失绿表型。转基因植株叶片的颜色呈现出浅黄色到绿色不同分布(图3)。
[0133] 2、转基因的表达量与转基因植株叶片颜色的相关性
[0134] 分别对Enk、cs215突变体W及叶片颜色不同（绿、浅绿和浅黄色）的35S: :GmCHLIl 转基因拟南芥的T2代植株进行如下鉴定：
[0135] (1)取萌发五周后的植株的叶片，同时提取叶绿素和总RNA。
[0136] (2)将步骤(1)提取的总RNA，反转录为cDNA。
[0137] (3)检测步骤(1)提取的叶绿素含量。
[013引 （4) W步骤(2)提取的cDNA为模板，用引物5和引物6组成的引物对检测GmCHLI 1基 因的表达量，用引物7和引物8组成的引物鉴定内参基因（TIP"基因的表达量）。
[0139] 引物5:5' -TCTTCCAAGCCTTCCATTCACAC-3' ；
[0140] 引物6:5 ' -TGGCAACATTGGTAACCGAGAG-3 '。
[0141 ]引物7:5 ' -TGAGGCACCAACTGTTCTTCGT-3 ' ；
[0142] 引物8:5 ' -GTCGCTCCAGACTGCTAAGTCAAC-3 '。
[0143] 结果表明，Gm細LI1转基因的表达量与转基因植株中的叶绿素含量呈正相关（图 4)。
【主权项】
1. 大豆基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性或用于检测大豆基因组中如下SNP位 点的单核苷酸多态性的物质在如下(a)或(b)中的应用： (a) 鉴定或辅助鉴定大豆异黄酮类物质合成能力高低； (b) 鉴定或辅助鉴定大豆光合作用强弱； 所述SNP位点在大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核苷酸序列的第1958位;所述 SNP位点处的核苷酸为A或G。2. 用于检测大豆基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质，为如下a)或b): a) 引物对，为如下(al)或(a2): (al)由序列表中序列4所示的单链DNA和序列表中序列5所示的单链DNA组成的引物对； (a2)由将序列表中序列4和序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加 后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(al)中所述引物对功能相同的引物对； b) 所述引物对和限制性内切酶Pvu II或其同裂酶。3. 方法，为如下(A)或(B): (A) 鉴定或辅助鉴定待测大豆的异黄酮类物质合成能力高低的方法，包括如下步骤:检 测待测大豆的基因组中如下SNP位点处的核苷酸为A还是G还是A和G，以确定所述待测大豆 的基因型是A:A还是G:G还是A:G，根据所述待测大豆的基因型按照如下确定所述待测大豆 的异黄酮类物质合成能力高低:G:G基因型和A:G基因型的所述待测大豆的异黄酮类物质合 成能力均高于A:A基因型的所述待测大豆的异黄酮类物质合成能力； 所述SNP位点在大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核苷酸序列的第1958位;所述 SNP位点处的核苷酸为A或G; (B) 鉴定或辅助鉴定大豆光合作用强弱的方法，包括如下步骤:检测待测大豆的基因组 中如下SNP位点处的核苷酸为A还是G还是A和G，以确定所述待测大豆的基因型是A:A还是G: G还是A:G，根据所述待测大豆的基因型按照如下确定所述待测大豆的光合作用强弱:G:G基 因型的所述待测大豆的光合作用弱于A:G基因型的所述待测大豆的光合作用弱于A:A基因 型的所述待测大豆的光合作用； 所述SNP位点在大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核苷酸序列的第1958位;所述 SNP位点处的核苷酸为A或G; 所述A:A基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核苷酸序列的第1958位为A 的纯合型； 所述G:G基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核苷酸序列的第1958位为G 的纯合型； 所述A:G基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核苷酸序列的第1958位为A 和G的杂合型。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述"检测待测大豆的基因组中如下SNP位 点处的核苷酸为A还是G还是A和G"的方法为测序分析法或酶切鉴定法； 所述测序分析法包括如下步骤：以所述待测大豆的基因组DNA为模板，采用权利要求2 中所述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物;对所述扩增产物进行测序，根据测序结果按照 如下确定所述待测大豆基因组中所述SNP位点处的核苷酸为A还是G还是A和G:若所述扩增 产物为如下（1)，则所述待测大豆基因组中所述SNP位点处的核苷酸为A;若所述扩增产物为 如下（2)，则所述待测大豆基因组中所述SNP位点处的核苷酸为G;若所述扩增产物为如下 (3)，则所述待测大豆基因组中所述SNP位点处的核苷酸为A和G; (1) 单一 DNA片段:如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958位为A; (2) 单一 DNA片段:如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958位为G; (3) 两个DNA片段:一个DNA片段如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958位为 A;另一个DNA片段如序列表中序列2的第1176-2284位所示，且第1958位为G; 所述酶切鉴定法包括如下步骤：以所述待测大豆的基因组DNA为模板，采用权利要求2 中所述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物;对所述扩增产物采用限制性内切酶Pvu II进行 完全酶切，根据酶切结果按照如下确定所述待测大豆基因组中所述SNP位点处的核苷酸为A 还是G还是A和G:若所得酶切产物为784bp和325bp两个DNA片段，则所述待测大豆基因组中 所述SNP位点处的核苷酸为A;若所得酶切产物为1109bp单一 DNA片段，则所述待测大豆基因 组中所述SNP位点处的核苷酸为G;若所得酶切产物为784bp、325bp和1109bp三个DNA片段， 则所述待测大豆基因组中所述SNP位点处的核苷酸为A和G。5. 权利要求2所述物质或权利要求3或4所述方法在大豆育种中的应用。6. 方法，为如下任一： (C) 培育异黄酮类物质合成能力提高的大豆品种的方法，包括选择A:G基因型的大豆作 为亲本进行育种的步骤;所述A:G基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核苷酸 序列的第1958位为A和G的杂合型； (D) 培育异黄酮类物质合成能力降低的大豆品种的方法，包括选择A:A基因型的大豆作 为亲本进行育种的步骤;所述A:A基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核苷酸 序列的第1958位为A的纯合型； (E) 培育光合作用减弱的大豆品种的方法，包括选择A:G基因型的大豆作为亲本进行育 种的步骤;所述A:G基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核苷酸序列的第1958 位为A和G的杂合型； (F) 培育光合作用加强的大豆品种的方法，包括选择A:A基因型的大豆作为亲本进行育 种的步骤;所述A:A基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列2所示核苷酸序列的第1958 位为A的纯合型。7. 生物材料A，为如下中任一种： (I) 蛋白质，为将序列表中序列1所示的氨基酸序列中第275位的Gin突变为Arg后形成 的蛋白质； (II) 编码所述蛋白质的核酸分子； 具体的，所述核酸分子为如下（II-1)或（11-2):(11-1)核苷酸序列如序列表中序列2所 示，且第1958位为G;(II-2)核苷酸序列如序列表中序列3所示，且第824位为G。 (III) 含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物。8. 权利要求7所述生物材料A在培育异黄酮类物质合成能力提高和/或光合作用减弱的 植物品种中的应用。9. 生物材料B在培育光合作用加强和/或异黄酮类物质合成能力降低的植物品种中的 应用； 所述生物材料B，为如下中任一种： (I) 蛋白质，氨基酸序列如序列表中序列1所示； (II) 编码所述蛋白质的核酸分子； 具体的，所述核酸分子为如下（II-1)或（11-2):(11-1)核苷酸序列如序列表中序列2所 示，且第1958位为A;(II-2)核苷酸序列如序列表中序列3所示，且第824位为A。 (III) 含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物。10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植 物； 所述双子叶植物具体为大豆。
【文档编号】A01H1/04GK106048045SQ201610550731
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月13日
【发明人】田志喜, 李清, 王正, 房超, 杨瑞, 张敏, 马燕明
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所