用于检测食品中金黄色葡萄球菌和整合子的试剂盒和方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测食品中金黄色葡萄球菌及整合子int1的引物、探针、试剂盒及检测方法；该引物包括金黄色葡萄球菌引物和整合子引物；所述金黄色葡萄球菌引物的序列为：上游引物SAF：ATTCCGGATAACGCTTGCCA下游引物SAR：AGGGAATCTTCCGCAATGGG所述整合子引物的序列为：上游引物int1F：CATCGTCGTAGAGACGTCGG下游引物Int1R：AGAACAAGCAGGCATCACGA。本发明提供一种用于检测食品中金黄色葡萄球菌及整合子的引物和探针，试剂盒和检测方法。该试剂盒中组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确；试剂盒检测食品中金黄色葡萄球菌及整合子int1的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
【专利说明】
用于检测食品中金黄色葡萄球菌和整合子的试剂盒和方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种检测食品中金黄色葡萄球菌及整合子inti的引物;本发明还设及 一种与上述引物配合使用的探针;本发明还设及一种包括上述引物和探针的双重微滴式数 字PCR检测试剂盒，简称ddPCR检测试剂盒;本发明还设及一种采用上述试剂盒检测食品中 金黄色葡萄球菌及整合子inti的方法。
【背景技术】
[0002] 食品受到金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus,简称SA，污染的机会很多。我 国金黄色葡萄球菌因思念、=全、湾仔码头事件而引发标准争议，在2011年12月21日实施的 速冻食品新国标中，金黄色葡萄球菌从原来"不得检出"变为"限量检出"，但运一检测标准 的改变并不代表可W忽略金黄色葡萄球菌的危害性。
[0003] 在国家食品药品监督管理总局征集意见而公示的抽检项目中查询到，对包括速冻 水皎、汤圆、包子、花卷、慢头、南瓜饼、八宝饭等在内的速冻米面食品，仍然计划把金黄色葡 萄球菌列入A类检验项目，并标注为"极重要质量项目"，同时速冻米面食品产品检出"金黄 色葡萄球菌"依然属严重不合格。GB29921-2013《食品中致病菌限量》中，金黄色葡萄球菌项 目限量规定:n = 5，c = l，m=100CFU/g，M=1000CFU/g，即抽样样本5个，但是只要1个样品检 出lOOOCFU/g判为不合格。如果1个样品被检出金黄色葡萄球菌在100和lOOOCFU/g，其它四 个样检出值小于100C即/g，产品依然可判合格。因此，金黄色葡萄球菌快速定量检测就显得 尤为迫切了。
[0004] 1989年，S化okes首次提出整合子的概念，1991年，化11正式提出了基因盒一整合 子系统的概念。整合子是细菌的DNA片段，与细菌耐药性密切相关，是一种存在于细菌质粒 或染色体上的遗传元件系统，通过自身编码的整合酶来获取外源基因并使之表达。整合子 捕获、整合和表达耐药性基因盒，引起耐药基因在同种或不同种菌属间传播，从而使细菌的 耐药性得W广泛扩散。基因盒通过整合子上整合酶被整合到整合子中或从整合子里被剪切 下来，使耐药基因得W传播与扩散。
[0005] 目前，已有130多种耐药基因盒被确认整合子通过位点特异性重组捕获并表达外 源基因盒，从而赋予宿主菌对各种常用药物种类产生耐药性。同时整合子自身可位于接合 性质粒、转座子等可移动性元件上，可使整个整合子发生移动。因而整合子在新的耐药菌株 的出现及耐药基因水平播散中扮演着非常重要的角色。整合子根据整合酶蛋白的一级结构 主要分为4类，但第1类整合子最常见。本发明通过设计针对金黄色葡萄球菌和整合子的特 异引物、探针组合，可了解不同食品中金黄色葡萄球菌的分布和菌株中整合子的流行情况。
[0006] 目前，各类食品安全标准都要求对金黄色葡萄球菌的进行定量检测，但对于金黄 色葡萄球菌的定量检测主要还是通过传统方法进行培养后计数。而常规PCR方法需要PCR扩 增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且不可能实现定量检测。目前，Southern blot和实时巧光 定量PCR是常用的两种外源基因拷贝数分析技术，已广泛用于外源基因拷贝数分析。但运两 种方法也存在一定缺陷。例如，Southern blot方法分析时工作量大、周期长、操作要求高、 准确性较差，特别是对于多拷贝基因的分析，结果容易偏小。巧光定量PCR(qRT-PCR)在分析 外源基因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且 标准曲线的质量易受到DNA纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响；另外， 标准曲线必须基于标准物质建立，而标准物质的种类有限和昂贵价格不能适用于所有的研 究。
[0007] 微滴式数字PCR，即化oplet digital PCR，ddPCR是近年来兴起的一种新的绝对定 量技术，它基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用 当前分析化学热口研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至忍片 的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。运样经过PCR循环之后， 有一个核酸分子模板的反应器就会给出巧光信号，没有模板的反应器就没有巧光信号。根 据相对比例和反应器的体积，就可W推算出原始溶液的基因拷贝数。
[0008] 但基于微滴数字PCR平台的拷贝数的分析工作报道较少，针对金黄色葡萄球菌及 整合子的检测就更未见报道了。本发明基于微滴式ddPCR平台，建立了金黄色葡萄球菌及其 整合子基因拷贝数分析方法，研究结果为分析食品安全生物源性风险因子的定量检测提供 了新的方法和借鉴，也为食品安全质量控制提供了一个技术支撑手段。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测食品中金黄 色葡萄球菌及整合子inti的引物和探针；
[0010] 本发明另一个目的提供一种包含上述引物和探针的试剂盒，该试剂盒检测适用于 双重ddPCR检测食品中金黄色葡萄球菌及整合子intl，该试剂盒中组分和配比合理，使用方 便，检测快捷，准确；
[0011] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测食品中金黄色葡萄球菌及整 合子inti的方法，该方法操作简便、快速，成本低，检测结果准确。
[0012]为了达至化述目的，本发明采用W下方案：
[0013] -种用于检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的引物，其特征在于包括金 黄色葡萄球菌引物和整合子引物；
[0014] 所述金黄色葡萄球菌引物的序列为：
[0015] 上游引物 SAF: ATTCCGGATAACGCTTGCCA
[0016] 下游引物SAR: AGGGAATCTTCCGCAATGGG [0017]所述整合子引物的序列为：
[001 引上游引物 intlF: CATCGTCGTAGAGACGTCGG
[0019] 下游引物 Int 1R: AGAACAAGCAGGCATCACGA。
[0020] 与如上所述引物配合使用的探针，其特征在于包括金黄色葡萄球菌探针和整合子 探针：
[0021 ]所述金黄色葡萄球菌探针的序列为：
[0022] 探针 SAP:GCGGCGTTGCTCCGTCA
[0023] 所述整合子探针的序列为：
[0024] 探针 Int 1P: AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。
[0025] 本发明用于检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的试剂盒，其特征在于包 含权利要求1中的引物和权利要求2中的探针。
[0026] 如上所述的用于检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的试剂盒，其特征在 于该试剂盒中20.0化反应体系包括W下组分:2XddPCR Super Mix 10.化L、金黄色葡萄球 菌SA和整合子inti的正反向引物各1.化L，金黄色葡萄球菌SA和整合子inti的探针各1.化 L，DNA模板4.0化。
[0027] 本发明检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的方法，其特征在于包括W下 步骤：
[002引 A、提取样品DNA;
[00巧]B、将各反应组分加入如权利要求4所述的20.Oiil反应体系，然后加入70.0 iil矿物 油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；同时分别取试剂盒中的阳性质控和阴性质 控，制备相应的DNA模板；
[0030] C、将数字PCR混合液ddPCR Super Mix制作成油包水PCR微反应体系，并全部转移 到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板PCR反应管在封膜仪上封膜，并置于普通PCR仪 进行PCR反应；
[0031 ] D、打开微滴巧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板PCR反应管直接 插入设备，检测每个96孔反应板PCR反应管中微滴的PCR反应情况，最后根据巧松分布定律 算出待测基因的拷贝数。
[0032] 如上所述的检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的方法，其特征在于步骤 C中PCR扩增的反应程序按W下步骤进行：
[0033] (1)94。(：预变性3111111;
[0034] (2)94°C变性10s，58°C退火Imin，共进行40个循环；
[0035] (3)98°C 酶热失活 lOmin;
[0036] (4)4°C 停止反应。
[0037] 如上所述的检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的方法，其特征在于步骤 A中所述提取样品DNA的具体步骤如下：
[0038] 取1.5mL培养物1000化pm离屯、2min;沉淀物加入50化L的TE缓冲液，反复吹打使之 重新悬浮，加入30化10% SDS和15化的蛋白酶K，混匀，于37°C溫育化；加入10化L 5mol/L 化Cl，充分混匀，再加入80ul CTAB/化Cl溶液，混匀后再65°C溫育lOmin;加入等体积的酪/ 氯仿/异戊醇混匀，离屯、4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混 合直到DNA沉淀下来;沉淀用ImL的70 %乙醇洗涂后，加入TE溶液溶解沉淀。
[0039] 如上所述的检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的方法，其特征在于步骤 B中取阳性质控、和阴性质控制备相应的DNA模板的方法与步骤A中的方法相同。
[0040] 本发明中敏感性和特异性试验：
[0041] 采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行 Blast比较时，序列均与Genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的参考菌株基因组DNA加入 前述反应体系，重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和拷 贝数值之间也呈良好的线性关系R2>0.95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定 性。
[0042] 本发明与现有技术相比，具有W下优点：
[0043] 1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于ddPCR定量检 测金黄色葡萄球菌及整合子(inti);
[0044] 2)本发明检测方法简化了检测流程，而且无需制作标准曲线，大大缩短了检测周 期，检测时间比传统培养计数方法缩短两天左右；
[0045] 3)本发明检测方法整个过程无需使用标准曲线，对基因拷贝数可执行绝对定量分 析。
[0046] 4)数字PCR检测系统通过微滴化处理，可W大大减少背景和基质的干扰，灵敏度可 W低至1个拷贝，因此，对低浓度基因浓度的细微变化进行准确及重复性佳的检测。
[0047] 5)采用本发明检测方法在同一反应体系即可实现同时金黄色葡萄球菌和整合子 进行精准检测，操作简便、快速。具有较好的产业化前景。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步描述：
[0049] 实施例1
[0050] 本发明检测食品中金黄色葡萄球菌及整合子inti的引物和探针，该引物和探针的 序列分别为：
[0化1 ]上游引物 SAF:ATTCCGGATAACGCTTGCCA [0化 2 ]下游引物SAR: AGGGAATCTTCCGCAATGGG [0化3]探针 SAP:GCGGCGTTGCTCCGTCA
[0054]上游引物 intlF: CATCGTCGTAGAGACGTCGG [0化5 ]下游引物 I n 11R: AGAACAAGCAGGCATCACGA
[0056]探针 IntlP: AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC [0化7]实施例2
[0058]本发明一种检测食品中金黄色葡萄球菌及整合子inti的试剂盒，其中20其中反应 体系包括W下组分：
[0化9] 2 XddPCR Super Mix 10.化L，金黄色葡萄球菌和inti正反向引物各1.化L、探针 各 l.OiiUDNA模板 4.0化。
[0060] 其中引物和探针的序列如下：
[0061 ]上游引物 SAF:ATTCCGGATAACGCTTGCCA
[0062] 下游引物SAR: AGGGAATCTTCCGCAATGGG
[0063] 探针 SAP:GCGGCGTTGCTCCGTCA
[0064] 上游引物 int IF: CATCGTCGTAGAGACGTCGG [00化]下游引物 I nt 1R: AGAACAAGCAGGCATCACGA
[0066] 探针 Int 1P: AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。
[0067] 实施例3
[0068] 本发明检测食品中金黄色葡萄球菌及整合子inti的方法，包括W下步骤：
[0069] A、提取样品DNA;
[0070] 将各反应组分加入20.0 iil反应体系，然后加入70.0 iil矿物油，混匀后转移到微滴 发生器上自动产生微滴;所述20.Oiil反应体包括2 XddPCR Super Mix 10.化L，金黄色葡萄 球菌和int 1正反向引物各1.化L、探针各1.化L，DM模板4.化L。
[0071] B、将产生的微滴仔细全部转移到96孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板在封 膜仪上封膜，并置于普通PCR仪进行PCR反应。
[0072] C、打开微滴巧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板直接插入设备， 检测每PCR反应管中微滴的PCR反应情况，最后根据巧松分布定律算出待测基因的拷贝数。
[0073] 其中引物序列如下：
[0074] 上游引物 SAF: ATTCCGGATAACGCTTGCCA
[0075] 下游引物SAR: AGGGAATCTTCCGCAATGGG
[0076] 探针 SAP:GCGGCGTTGCTCCGTCA
[0077] 上游引物 intlF: CATCGTCGTAGAGACGTCGG [007引 下游引物 IntlR: AGAACAAGCAGGCATCACGA [00 巧]探针 I n 11P: AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。
[0080]所述的巧光PCR扩增按W下步骤进行：
[0081 ] (1)(1)94°C 预变性 3min;
[0082] (2)94°C 变性 1〇3,58。(：退火1111111，共进行40个循环；
[0083] (3)98°C 酶热失活 lOmin;
[0084] (4)4°C 停止反应。
[0085] 实施例4
[0086] 称取Ig前增菌样品，其中可根据样品的DNA含量，调整样品量，加入到50mL的离屯、 管中；加入5mL CTAB提取液和20化蛋白酶K溶液，充分混匀。65°C解育30min，不时振荡；吸水 性大的食品样品，加入CTAB提取液的量应根据液面是否能盖住样品并多出少许而定;65°C 过夜后，800化/min室溫离屯、lOmin，取1ml上清液入2ml离屯、管中；加入70化L氯仿后用力振 荡，13000g离屯、lOmin，转移上清液6(K)化到新的2ml离屯、管中；加入2倍体积的CTAB沉淀溶液 颠倒数次后室溫静置60min，13000 X g离屯、lOmin，弃去上清，加入35化L NaCl溶液将沉淀进 行悬浮，再加入35化L氯仿，满旋振荡进行混匀，13000g离屯、lOmin，转移上清后加入0.8倍体 积的异丙醇用来沉淀核酸，室溫放置20min，13000g离屯、lOmin，弃去上清，加入50化L 70% 乙醇溶液洗涂沉淀，溶解于50yL TE溶液中。然后取4.化L提取物加入到W下反应体系，
[0087] 2 XddPCR Super Mix 10.0化，金黄色葡萄球菌和（inti)正反向引物各1.0化、探 针各1.0化，DNA模板4.0化。
[0088] 其中引物和探针的序列如下：
[0089] 上游引物 SAF: ATTCCGGATAACGCTTGCCA
[0090] 下游引物SAR: AGGGAATCTTCCGCAATGGG [0091 ]探针 SAP :GCGGCGTTGCTCCGTCA
[0092] 上游引物 int IF: CATCGTCGTAGAGACGTCGG
[0093] 下游引物 I nt 1R: AGAACAAGCAGGCATCACGA
[0094] 探针 Int 1P: AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。
[OOM]进行PCR扩增，按W下步骤进行：
[0096] (1)94°C 预变性 3min;
[0097] (2)94°C变性10s，58°C退火Imin，共进行40个循环；
[009引（3)98°C 酶热失活 lOmin;
[0099] (4)4°C 停止反应。
[0100] 为了证明本发明检测方法的准确性，本发明作了 W下对比试验:分别采用本发明 检测方法和平板计数法(GB 4789.10-2010)测定食品中金黄色葡萄球菌数量;具体的实验 操作均按照标准进行，实验重复=次，结果取平均值。结果如表1所示，从结果可W看出，本 发明采用数字PCR方法对食品中大肠菌群数量的测定结果，与现有的GB 4789.10-2010相 比，10份样，平均误差为4.6%，运说明本发明方法具有很高的准确度。另外，本发明数字PCR 检测方法的单样本全程检测时间为4小时，远短于现有传统的平板培养计数方法，而且检测 金黄色葡萄球菌的同时，还能对其整合子进行很好的检测，能够准确快速评价食源性致病 菌和致病菌携带耐药基因的传播风险。因此具有良好的技术优势和产业化发展前景。
[0101] 表1
[0102]
[0103] W上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征W及本发明的优点。本行业的技 术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明 本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，运些 变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及 其等效物界定。
【主权项】
1. 一种用于检测食品中金黄色葡萄球菌及整合子的引物，其特征在于包括金黄色葡萄 球菌引物和整合子引物； 所述金黄色葡萄球菌引物的序列为： 上游引物 SAF: ATTCCGGATAACGCTTGCCA 下游引物 SAR: AGGGAATCTTCCGCAATGGG 所述整合子引物的序列为： 上游引物 int IF: CATCGTCGTAGAGACGTCGG 下游引物 Int 1R: AGAACAAGCAGGCATCACGA。2. 与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于包括金黄色葡萄球菌探针和整 合子探针： 所述金黄色葡萄球菌探针的序列为： 探针 SAP: GCGGCGTTGCTCCGTCA 所述整合子探针的序列为： 探针 Int IP: AGGGTGTGCGGTGTGGCGGGC。3. 用于检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的试剂盒，其特征在于包含权利要 求1中的引物和权利要求2中的探针。4. 根据权利3所述的用于检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的试剂盒，其特 征在于该试剂盒中20.0yL反应体系包括以下组分:2XddPCR Super Mix lO.OyL、金黄色葡 萄球菌SA和整合子inti的正反向引物各l.OyL，金黄色葡萄球菌SA和整合子inti的探针各1.(^1^，0嫩模板4.(^匕5. 检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的方法，其特征在于包括以下步骤： A、 提取样品DNA; B、 将各反应组分加入如权利要求4所述的20. ΟμL反应体系，然后加入70. ΟμL矿物油，混 匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；同时分别取试剂盒中的阳性质控和阴性质控，制 备相应的DNA模板； C、 将数字PCR混合液ddPCR Super Mix制作成油包水PCR微反应体系，并全部转移到96 孔反应板PCR反应管中；再将96孔反应板PCR反应管在封膜仪上封膜，并置于普通PCR仪进行 PCR反应； D、 打开微滴荧光检测器应用软件，将PCR反应结束后的96孔反应板PCR反应管直接插入 设备，检测每个96孔反应板PCR反应管中微滴的PCR反应情况，最后根据珀松分布定律算出 待测基因的拷贝数。6. 根据权利要求5所述的检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的方法，其特征 在于步骤C中PCR扩增的反应程序按以下步骤进行： (1) 94 °C预变性 3min; (2) 94°C变性10s，58°C退火lmin，共进行40个循环； (3) 98°C 酶热失活 lOmin; (4) 4°C停止反应。7. 根据权利要求5所述的检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的方法，其特征 在于步骤A中所述提取样品DNA的具体步骤如下： 取1.5mL培养物lOOOOrpm离心2min;沉淀物加入500yL的TE缓冲液，反复吹打使之重新 悬浮，加入30yL 10%SDS和15yL的蛋白酶K，混匀，于37°C温育lh;加入100yL 5mol/L NaCl， 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65°C温育lOmin;加入等体积的酚/氯仿/ 异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入一只新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到 DNA沉淀下来;沉淀用lmL的70 %乙醇洗涤后，加入TE溶液溶解沉淀。8.根据权利要求7所述的检测食品中金黄色葡萄球菌SA及整合子inti的方法，其特征 在于步骤B中取阳性质控、和阴性质控制备相应的DNA模板的方法与步骤A中的方法相同。
【文档编号】C12N15/11GK106048052SQ201610613165
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】蔡先全, 吴冰, 王静, 邱德义, 萧崎倩, 邱霞, 张杰豪
【申请人】中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心