一种基于TaMKK3?A基因的dCAPS分子标记及其检测小麦穗发芽抗性的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于TaMKK3?A基因的dCAPS分子标记及其检测小麦穗发芽抗性的方法，该方法是基于小麦4AL染色体休眠性候选基因TaMKK3?A基因的功能性SNP开发了一个dCAPS标记MKKAC，具体为，在CAPS标记基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，从而在TaMKK3?A基因的与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记处引入一个HpyCH4IV酶切位点，使得抗穗发芽的小麦材料扩增出来的谱带中多一个HpyCH4IV酶切位点，而感穗发芽的小麦材料中无该酶切位点。将标记用于小麦穗发芽抗性分子标记辅助育种，可以有效区分穗发芽抗性不同的材料，简化了SNP的检测技术，降低了检测的成本。
【专利说明】
-种基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标巧及其检测小麦穗发 芽抗性的方法
技术领域
[0001] 本发明设及的是小麦分子育种的技术领域，尤其设及的是一种基于TaMKK3-A基因 的dCAI^分子标记及其检测小麦穗发芽抗性的方法。
【背景技术】
[0002] 小麦穗发芽(Pre-harvest sprouting，PHS)是指小麦临近收获前遭遇阴雨或者高 溫高湿天气导致巧粒直接在穗部发芽的现象。小麦发生收获前穗发芽会严重降低产量及品 质的稳定性(Groos等，2002;化ang等，2010)。如果收获前遭遇持续阴雨天气时间越长，则穗 发芽危害更严重。因此，培育穗发芽抗性持续性强的小麦品种有助于降低运种风险。挖掘更 多的抗穗发芽基因，开发功能标记，进行不同抗穗发芽基因的聚合将有助于培育穗发芽抗 性持续性强的小麦品种。
[0003] 众多学者研究结果均表明，小麦21条染色体均有调控小麦穗发芽抗性的相关QTL 的报道。其中小麦4AL染色体上存在稳定的穗发芽抗性主效QTL，紧密连锁标记主要有 Xba;rcl70、Xgwm397、Xgwm269、Xgwm937、Xgwm894、Xgwm637、Xzxql 18和趾 be03(Mares等， 2005 ;Kottearachchi et al. 2006 ; Torada等，2008;化en等，2008 ;0gbonnaya等，2008 ; Imtiaz等，2008 ;Munkvold等，2009; Singh等，2010; Liu等，2011;Knox等，2012;Kulwal等， 2012;Kumar等，2015KTorada等（2016)利用图位克隆的方法已鉴定出位于该9化区域的候 选基因 TaMKK3-A，其编码蛋白产物属于MKK3蛋白激酶家族。序列分析发现，位于该基因起始 密码子下游66化P处(不包含内含子)在穗发芽抗性不同的品种间存在单核巧酸突变(SNP)， 为功能性SNP。其中抗穗发芽亲本SNP为C碱基，对应的氨基酸为天冬酷胺(Asn);感穗发芽亲 本SNP为A碱基，对应的氨基酸为赖氨酸化ys)。该处功能性SNP可用于小麦穗发芽抗性分子 辅助育种。
[0004] 然而，目前单核巧酸检测技术成本较高，所用仪器较昂贵，不适合大批量材料的检 测。基于此，本发明人对化MKK3-A基因的功能性SNP进行了 dCAPS标记的转化，简化了该SNP 的检测技术，降低了检测的成本。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于化MKK3-A基因的dCAPS 分子标记及其检测小麦穗发芽抗性的方法，W提供一种新的小麦穗发芽抗性分子标记辅助 育种方法。
[0006] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0007] -种基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记，所述dCAPS分子标记为将TaMKK3-A基因 中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记相邻的下游碱基C替换成G，所述化MKK3-A基因 中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记位于TaMKK3-A基因 CDS序列的第66化P处，所述 相邻的下游碱基C位于hMO-A基因 CDS序列的第66化P处，所述hMO-A基因 CDS序列如 SEQ ID NO.l所示，开发的dCAPS分子标记命名为MKKAC。
[000引一种利用上述基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记检测小麦穗发芽抗性的方法， 包括W下步骤：
[0009] (1)提取待测小麦基因组DNA;
[0010] (2似步骤（1)的小麦基因组DNA为模板，设计TaMKK3-A基因组标记引物，进行PCR 扩增，获得一次扩增产物，所述一次扩增产物为包含所述TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗 性关联的功能性SNP标记及其上下游延伸序列的长序列，此处长序列为与下述的二次扩增 产物的较短序列而言，其长度大于常规PCR可扩增的最小长度。
[0011] (3) W步骤(2)的一次扩增产物为模板，设计dCAPS标记引物，并在dCAPS标记引物 中引入错配碱基，将所述化MKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记相邻的 下游碱基C替换成G，获得二次扩增产物；
[0012] (4)将步骤(3)的二次扩增产物用化yCH4IV内切酶进行酶切，获得酶切产物，所述 酶切产物包含的条带多的品种为抗穗发芽品种，对应的SNP为C碱基类型，所述酶切产物包 含的条带少的品种为感穗发芽品种，对应的SNP为A碱基类型。
[0013] 优选地，所述基于TaMKK3-A基因的dCAI^分子标记检测小麦穗发芽抗性的方法，包 括W下步骤：
[0014] (1)提取待测小麦基因组DNA;
[001引 （2似步骤（1)的小麦基因组DNA为模板，设计TaMKK3-A基因组标记引物，进行PCR 扩增，获得一次扩增产物，所述TaMKK3-A基因组标记引物如SEQIDN0.3、SEQIDN0.4所 示，扩增获得的一次扩增产物的序列如SEQ ID NO.2所示；
[0016] (3) W步骤(2)的一次扩增产物为模板，利用dCAPS标记引物进行第二次PCR扩增， 获得二次扩增产物，所述dCAPS标记引物序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
[0017] (4)将步骤(3)的二次扩增产物用化yCH4IV内切酶进行酶切，获得酶切产物，将酶 切产物进行电泳验证，其中，酶切产物包含的条带多的待测小麦品种为抗穗发芽品种，酶切 产物包含的条带少的待测小麦品种为感穗发芽品种。
[0018] 本发明相比现有技术具有W下优点：本发明提供了一种基于TaMKK3-A基因的 dCAI^分子标记及其检测小麦穗发芽抗性的方法，该方法是基于小麦4AL染色体休眠性候选 基因化MKK3-A基因的功能性SNP开发了一个dCAPS标记MKKAC，该标记用于小麦穗发芽抗性 分子标记辅助育种，可W有效区分穗发芽抗性不同的材料，简化了 SNP的检测技术，降低了 检测的成本。
【附图说明】
[0019] 图1为TaMKK3-A基因功能标记MKKAC不同等位基因类型的聚丙締酷胺凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1 [00別]1材料
[0022]本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用 的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品，所用种质资源，均可从国家种质资源库 获得。
[0023] 2 方法
[0024] 2.1MKKAC标记在260份小麦品种资源中的有效性验证
[0025] 2.1.1穗发芽表型检验
[00%] 2012-2015年期间，选取260份小麦品种，进行穗发芽表型检验，具体步骤如下：
[0027] (1)种子萌芽指数(GI)测定
[002引于小麦蜡熟期分别收获小麦主茎穗材料，室内风干2天，立即存放于-20°C冰箱W 维持种子的休眠性，待全部试验材料收获完毕，一并进行发芽试验。选取10个成熟期一致的 主茎穗，手工脱粒，每个材料取50粒进行种子发芽试验，2次重复。巧粒腹沟朝下摆放在培养 皿内，培养皿内加9血无菌水，置于人工气候培养箱(20°C，光照1地，黑暗lOh，湿度80% )，24 小时候后开始统计每个培养皿萌发种子数，于每天同一时间统计萌芽数并剔除发芽种子 (W胚部露白为萌芽鉴定标准），3天后计算种子萌芽指数(GI)。
[0029] 种子萌芽指数(GI)计算公式:GI = [(3Xnl+2Xn2+lXn3)/(3XN)]X100%
[0030] 其中nl、n2、n3是种子第访、第2天、第3天每天所萌芽的巧粒数，姆旨总粒数。
[0031] (2)整穗发芽率(GP)测定
[0032] 于小麦蜡熟后期(茎杆、叶片和麦穗全部变黄)收获每份材料10个主茎穗，室内风 干Id,立即存放于-2(TC冰箱W维持种子的休眠性，待收获全部材料后一并进行整穗发芽试 验。先把整穗在灭菌水中充分浸泡lOmin，用发芽纸卷裹，保鲜袋保湿，置人工气候培养箱中 (溫度20°C，光周期14h昼/1化夜，相对湿度80%)培养7d。于第7天取出并除去保鲜袋，但保 留发芽纸，于电热恒溫干燥箱（15(rC)快速烘干，阻止其继续发芽;再于阳光下暴晒至巧粒 易剥取;记录每个穗子穗发芽率后取两重复平均值，W胚部出现中破裂迹象为鉴定标准，手 工脱粒，统计发芽种子数和总粒数，计算整穗发芽率(germination percen化ge，GP)。
[0033] 整穗发芽率(GP)计算公式:GP=( 10穗发芽数今10穗总粒数）X 100%
[0034] 2.1.2基因型分析
[0035] 取上述260份小麦品种资源进行基因型分析，发现共存在两种基因型MKKAC-a(a基 因型）、MKKAC-b(b基因型），其中，a基因型对应功能SNP的A碱基类型，含有此碱基类型的小 麦材料休眠性弱或不休眠，而b基因型对应文献中功能SNP的C碱基类型，与小麦强休眠性显 著关联。在260份小麦材料中，携带b基因型的材料数为177份，占68.1%，而携带a基因型的 材料数为83份，占31.9%。将测定的260份小麦品种的穗发芽表形与基因型分析结果进行关 联分析，结果如下表1所示：
[0036] 亲1 HCAPS标巧MKKAC木同甚巧巧白穗货巧亲巧值的姑羊忡A析巧差异忌基忡A析
[0037]
[003引注:a表示MKKAC-a和MKKAC-b等位变异与表型值的相关系数；
[0039] b表示对MKKAC-a和MKKAC-b等位变异对应表型值进行差异显著性分析；
[0040] *和**表示显著水平为0.05和0.01;
[0041 ] 结果表明MKKAC-b等位变异类型与2012年GI15和GP15,2013年GI30和2015年GP5表 型值呈显著（P<〇.〇5)或极显著（P<0.01)负相关，相关系数分别为0.13、0.14、0.20和 0.13。进一步对不同基因型进行差异显著性分析，结果表明，MKKAC标记两等位变异在2012 年GI15和GP15,2013年GI30和2015年GP5表型上差异达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01) 水平。
[0042] 2.2小麦穗发芽抗性鉴定
[0043] 取10种小麦品种：1.扬麦158;2.晓麦38;3.遂宁巧巧麦;4.济麦20;5.红芒春21;6, 万县白麦子;7.京411 ;8.京冬10;9.安农1114; 10.郑麦9023进行穗发芽抗性鉴定，包括W下 步骤：
[0044] 2.2. ISDS-Tris饱和酪法抽提小麦基因组DNA
[0045] (1)取1-2粒小麦种子置于2mL灭菌离屯、管，利用MP高通量组织研磨仪研磨成粉末；
[0046] (2)加入 1.2mL DNA提取缓冲液（200mM Tris-Cl，250mM NaCl，25mM 抓TA，0.5% 8〇5,2%0-16新鲜加入）；
[0047] (3) 60°C水浴45min，期间间歇振荡7-8次W充分萃取DNA;
[004引 （4)室溫下12000巧m离屯、lOmin;
[0049] (5)转移上清液至新的2血灭菌离屯、管中，加入预冷的等体积Tris饱和酪/氯仿异/ 戊醇(体积比为25:24:1)，于冰上颠倒混匀15min，期间间歇振荡W防分层。
[(K)加](6)室溫下12000巧m离屯、lOmin。
[0051] (7)转移上清液至新的2mL灭菌离屯、管中，重复步骤(5)、（6)，W充分去除蛋白。
[0052] (8)转移上清液至新的1.5mL灭菌离屯、管中，加入0.6倍异丙醇和0.1倍体积巧化L) NaAc(抑5.2)，充分混合混匀后冰上静置17min，使DNA白色沉淀充分析出。
[0053] (9)4°C10000巧m 离屯、lOmin。
[0054] (10)弃上清，加入预冷的70%乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室溫惊干， 加入lOOuL其中含化L lOmg/mL RNase酶的1XTE缓冲液(或双蒸水)过夜溶解。
[0化日](11)在化no化e Plus微量分光光度计上检测DNA浓度，并统一稀释成50ng/uL工作 液，备用。
[0056] 2.2.2PCR扩增与检测
[0057] 第一次PCR: W小麦基因组DM为模板，WTaMKK3-A基因组标记A3(F: TGAGTTGATAAACTGATTTGCGAAG; R: TCCCCACACTTTGCATCAGTCTG)为引物进行 PCR 扩增，获得一 次扩增产物，所述一次扩增产物的核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[005引第二次PCR: W-次扩增产物为模块，WdCAPS标记（F: CACATCCTCTTCCTTTCA; R: TTTGCTTCGCCCTTAAC)为引物进行PCR扩增，获得二次扩增产物；
[0059] 酶切检测:将二次扩增产物用化yCH4IV(酶切位点A/CGT)内切酶进行酶切，酶切产 物利用6 %变性聚丙締酷胺凝胶电泳检测，恒定功率55W，固定，银染，显影，拍照。
[0060] 2.2.3 结果
[0061 ]结果如图1所示，泳道1-10分别为：1.扬麦158 ; 2 .晓麦38; 3 .遂宁巧巧麦;4.济麦 20;5.红芒春21 ;6.万县白麦子;7.京411 ;8.京冬10;9.安农1114; 10.郑麦9023;其中泳道1- 6包含6条带，泳道7-10包含3条带，泳道1-6的条带多于泳道7-10,说明泳道1-6对应的小麦 品种（1.扬麦158、2.晓麦38、3.遂宁巧巧麦、4.济麦20、5.红芒春21、6.万县白麦子）的基因 型为MKKAC-b，对应的SNP为C碱基类型，为抗穗发芽品种，泳道7-10对应的小麦品种（7 .京 411、8.京冬10、9.安农m4、10.郑麦9023)的基因型为MKKAC-a，对应的SNP为A碱基类型，为 感穗发芽品种。
[0062] 理论上，MKKAC-a基因型的二次扩增产物片段中含有2个化yCH4IV酶切位点， MKKAC-b基因型的二次扩增产物片段中在功能性SNP位点处多一个化yCH4IV酶切位点，因 此，MKKAC-a基因型的二次扩增产物理论上酶切后含有3条主带，而MKKAC-b基因型的二次扩 增产物酶切后含有4条主带，但是，由于酶切前包含了两次PCR过程，而且酶切后的序列均较 短，因此不可避免地会出现杂带，且有些带型电泳结果较淡，但由于MKKAC-b基因型比 MKKAC-a基因型多一个化yCH4IV酶切位点是确定的，因此在结果验证上，MKKAC-b基因型的 酶切条带必然比MKKAC-a基因型的酶切产物的条带多，由此可W将两种基因型的品种区分 开来。
[0063] W上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是W本发明技术方案为前 提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
【主权项】
1. 一种基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记，其特征在于，所述dCAPS分子标记为将 TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记相邻的下游碱基C替换成G，所述 TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记位于TaMKK3-A基因⑶S序列的第 660bp处，所述相邻的下游碱基C位于TaMKK3-A基因⑶S序列的第661bp处，所述TaMKK3-A基 因 CDS序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -种利用如权利要求1所述的基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记检测小麦穗发芽 抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取待测小麦基因组DNA; (2) 以步骤（1)的小麦基因组DNA为模板，设计TaMKK3-A基因组标记引物，进行PCR扩增， 获得一次扩增产物，所述一次扩增产物为包含所述TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联 的功能性SNP标记及其上下游延伸序列的长序列； (3) 以步骤(2)的一次扩增产物为模板，设计dCAPS标记引物，并在dCAPS标记引物中引 入错配碱基，将所述TaMKK3-A基因中与小麦穗发芽抗性关联的功能性SNP标记相邻的下游 碱基C替换成G，获得二次扩增产物； (4) 将步骤(3)的二次扩增产物用HpyCH4 IV内切酶进行酶切，获得酶切产物，所述酶切 产物包含的条带多的品种为抗穗发芽品种，所述酶切产物包含的条带少的品种为感穗发芽 品种。3. 根据权利要求2所述的一种基于TaMKK3-A基因的dCAPS分子标记检测小麦穗发芽抗 性的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取待测小麦基因组DNA; (2) 以步骤（1)的小麦基因组DNA为模板，设计TaMKK3-A基因组标记引物，进行PCR扩增， 获得一次扩增产物，所述TaMKK3-A基因组标记引物如SEQIDN0.3、SEQIDN0.4所示，扩增 获得的一次扩增产物的序列如SEQ ID NO.2所示； (3) 以步骤(2)的一次扩增产物为模板，利用dCAPS标记引物进行第二次PCR扩增，获得 二次扩增产物，所述dCAPS标记引物序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示； (4) 将步骤(3)的二次扩增产物用HpyCH4 IV内切酶进行酶切，获得酶切产物，将酶切产 物进行电泳验证，其中，酶切产物包含的条带多的待测小麦品种为抗穗发芽品种，酶切产物 包含的条带少的待测小麦品种为感穗发芽品种。
【文档编号】C12N15/11GK106048055SQ201610640921
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月5日 公开号201610640921.3, CN 106048055 A, CN 106048055A, CN 201610640921, CN-A-106048055, CN106048055 A, CN106048055A, CN201610640921, CN201610640921.3
【发明人】朱玉磊, 王升星, 张海萍, 常成, 吴曾云, 姜昊, 曹佳佳, 刘凯, 秦朦, 卢杰, 司红起, 马传喜
【申请人】安徽农业大学