一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物及方法
【专利摘要】本发明涉及一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物及方法。所述引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还涉及鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的方法。本发明通过设计真核藻类特异性引物，可以从环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA中特异性扩增获得不同真核藻类，从而能够鉴定活性污泥中的真核藻类种类。
【专利说明】
-种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引 物及方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物及方 法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 环氧丙烷皂化废水是一种由氯醇法生产环氧丙烷过程产生的大量污水。该废水具 有pH值高、氯化巧含量高、COD高的特点，其中含有大量难W生化降解的氯化物，如氯丙醇、 二氯异丙酸、二氯丙烷等。运种高盐、富含有机物的废水可对环境造成严重污染，采用合理 有效的方式处理运种废水不容忽视。
[0003] 生物活性污泥法是当前环氧丙烷皂化废水处理的主要方式。活性污泥是污水处理 厂曝气池内有机污染物质转化的主体，其生物活性的高低从根本上决定了一个污水处理厂 的污水处理能力，而活性污泥的生物活性又主要取决于其中的微生物菌群结构和功能，包 括细菌、古菌、病毒W及真核藻类等微生物。
[0004] 中国专利文献CN103849678A(申请号201210517032.X)公开了一种快速微藻种属 鉴定的方法。主要步骤为:将单藻落挑取至事先加入10~20化水的PCR管中，或者含藻水体 离屯、收集藻细胞1〇4~1〇6个后加入10~20化水的PCR管中，将藻细胞吹打散开后，直接将PCR 管置于PCR仪中，于99°C加热20~30min，再次吹打使DNA释放作为模板，W真核细胞通用18S rDNA或口 S引物进行PCR反应。通过对产物测序和序列分析，可获得待测藻株的种属信息。
[0005] 虽然上述鉴定方法能够鉴定待测藻株的种属信息，但由于活性污泥中微生物群落 结构复杂，上述方法无法进行准确鉴定，而且绝大多数的微生物是不能被传统方法分离培 养的，通过传统的富集、分离、培养很难对污泥微生物群落进行准确分析。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻 类多样性的引物及方法。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[000引一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物，该引物为一对， 上游引物核巧酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 上游引物：5 ' -AAAGTTAGGTGAGCG-3 ' ；沈Q ID NO. 1
[0010] 下游引物：5 ' -CAGTCAATCGGTATG-3 '。沈Q ID NO. 2
[0011] -种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的方法，包括如下步骤： [001。（ 1)取环氧丙烷皂化废水棘性污泥样品，提恥當DNA;
[0013] (2) W步骤（1)制得的总DNA为模板，利用上述鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中 真核藻类多样性的引物进行PCR扩增，制得扩增产物;扩增产物的片段大小在70化P左右；
[0014] (3)对步骤(2)制得的扩增产物进行测序，测序结果进行blastn比对定种；
[001引 （4)将步骤（3)的测序结果输入GenBank，通过BLAST程序在GenBank中进行相似性 捜索，并从比对后所得的结果中找到相似度比较高的序列进行比对分析，应用MAGA4.0软件 使用N-J法构建系统进化树，点击Bootstrap Test of Phylogeny选择化i曲bor-Joining进 行bootstrap值分析，经重复取样，得到可信度最高的一棵。
[0016]根据本发明优选的，所述步骤(1)中，提取总DNA的步骤如下：
[0017] 取环氧丙烷皂化废水活性污泥样品，4°c条件下4000r/min离屯、lOmin，弃上清，使 用±壤DNA提取试剂盒提取活性污泥中的宏基因组DNA。
[001引根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，总体系50化：
[0019]
[0020] PCR扩增程序如下：
[0021] 95°C 预变性 5min;94°C 变性 45s，54°C 退火 45s，72°C 延伸 45s，进行 35 个循环；72°C 延伸7min。
[0022] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，对扩增产物进行测序的步骤如下：
[0023] 回收步骤(2)制得的扩增产物，连接入PGM-T载体，制得连接产物，然后转化大肠杆 菌JM109感受态细胞，然后进行测序。
[0024] 化化 U 去 +立、nrM-T摇/71^化4去 +立/tIt《中1 n, .
[0025]
[0026] 连接条件为：16 °C连接过夜。
[0027] 进一步优选的，上述大肠杆菌JM109感受态细胞采用如下方法制备：
[0028] (I)受体菌的培养
[0029] 取活化的大肠杆菌化.coli)JM109单菌落，接种于3~5ml LB液体培养基中，37°C 下振荡培养10~14小时至对数生长后期，将该菌悬液:(50~100)的体积比接种于 lOOmlLB液体培养基中，37°C振荡培养2~3小时至0〇6〇〇 = 0.4~0.6，制得培养液；
[0030] (II)CaCl2法制备感受态细胞
[0031] ①将培养液转入离屯、管中，冰置10分钟，然后于4°C下3000g离屯、10分钟；
[0032] ②弃上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰置15~30分钟 后，4°C下3000g离屯、10分钟；
[00削③弃上清，加入4ml预冷含质量浓度为15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬 浮细胞，冰置3分钟，制得感受态细胞悬液；
[0034] 进一步优选的，上述转化大肠杆菌JM109感受态细胞的步骤如下：
[0035] ①大肠杆菌JM109感受态细胞20化L加连接产物化L混合物于离屯、管中，冰上放置 30min，期间摇动3次防止受体菌沉底；
[0036] ②42 r水浴加热90秒，拿出放入冰上2min;
[0037] ③加灭菌LB液体培养基80化L，混匀；
[0038] ④37 °C、180巧m摇床培养45min，使菌体复苏；
[0039] ⑤3000巧m离屯、2min，去上清800化，余下200化，重悬；
[0040] ⑥重悬液涂于固体培养基上，室溫静置30分钟直至液体被吸收；
[OOW ⑦37 r恒溫箱，倒置培养12~20h，制得。
[0042] 进一步优选的，上述LB液体培养基，每升组分如下：
[0043] 膜蛋白腺lOg、酵母粉5g、氯化钢lOg。
[0044] 上述固体培养基在LB液体培养基的基础上，每升加入如下组分：
[0045] 50mg/ml氨节青霉素(Amp)200ml、质量浓度20%的IPTG 350化、质量浓度2%的X- gal 2ml、琼脂20邑。
[0046] 根据本发明优选的，所述步骤（3)中，对测序结果进行blastn(http:/7 blast.ncbi .]11111.]1比.旨〇￥)比对定种的步骤如下：
[0047] 登录网站ht1:p: //www.ncbi .nlm. nih. gov，点击BLAST;然后进入tblatn，在Enter 如ery Sequence对话框中将测序后的序列复制粘贴，点击BLAST,Gen Bank自动把输入的序 列与序列资源库中所有相关序列进行比较;在比较结果中，找出同源性最高的一个确定未 知藻的种属。
[0048] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中，重复取样次数为1000次。
[0049] 有益效果
[0050] 1、本发明通过设计真核藻类特异性引物，可W从环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基 因组DNA中特异性扩增获得不同真核藻类，从而能够鉴定活性污泥中的真核藻类种类；
[0051] 2、本发明所述的鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的方法，步骤 简单，能够有效分离鉴定出活性污泥中的真核藻类，为进一步研究真核藻类在活性污泥中 的作用及整个污泥菌群的作用奠定了基础。
【附图说明】
[0052] 图1为实施例2及对比例所述PCR电泳结果照片；
[0053] 图中:A、是采用对比例1中常规PCR程序结果;B、为针对特异性引物改进后的PCR程 序结果;C、是采用对比例2所述18S rDNA通用引物PCR扩增结果；
[0054] 图2为实施例2分析环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性时建立的进化 树。
【具体实施方式】
[0055] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明所保护范围并不仅 限于此。
[0化6]生物材料来源
[0057]大肠杆菌化.coli)JM109购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。
[005引PGM-T载体购自天根生化科技(北京)有限公司。
[0化9]实施例1
[0060] l.NCBI捜核巧酸序列。登录www.ncbi.nlm.n;Lh.gov/Gen-Bank，可W从GenBank中 获取基因序列作为模板。
[0061] 本发明的目标扩增类群为真核藻类，按照Burki(2008)对光合作用真核生物、Adi (2012)对真核生物的分子系统分类法，目标扩增类群细化为绿藻(Chlorophyceae)、红藻 (Porphyridium)、裸藻化 uglena)、轮藻（Charophyta)、甲藻（Pyrrophyta)、隐藻 (Cryptophyceae)、定鞭藻（Haptophyta)、Chlorarachniophyta、金藻（Chrysophyceae)、石圭 藻(Diatom)、褐藻。]1日6〇地八日）、黄藻(Xanthophyta)等12个真核藻类口。根据试验要求来 确定需要扩增的DNA序列，并知道其编码结构基因区序列，具体方法如下：
[0062] 在56曰1'证对话框中选择化1(316〇1：1(16，在对话框中填入所要查找的化1(316〇1：1(16名 称，如输入化loro地yceae(绿藻），点击search即得到与化loro地yceae相关的许多序列信 息，从中选择物种相近的1个，然后将其序列与Gen Bank中相关序列进行比较。
[0063] 2.序列同源性分析与比较。
[0064] 运用DNAMAN等相关软件进行序列比较，具体步骤为打开DNAMAN，点击Sequences, 在File菜单中选择multiple sequence alignment,在查找范围对话框中将上述获得的目 的序列逐条插入，点击Done,软件就自动把输入的所有序列进行比较，确定同源性区域。找 出同源性较高的区域，在该区域内选择出引物设计的模板，通过W上的计算机操作便可W 完成序列编辑与处理W及引物设计位置的确定。
[00化]3.使用Primer Premier 5.0设计引物。
[0066] Primer Premier 5.0是用来设计最适合引物的应用软件，利用其高级引物功能进 行引物数据库捜索、巢式引物设计、引物编辑和分析等，可W设计出有高效扩增能力的理想 引物，也可W设计出用于扩增长达50kbW上的PCR产物的引物序列。该软件主要由Gene Bank序列编辑、Primer引物设计、Align序列比较、Enzyme酶切分析和Motif基序分析等几个 主要功能板块组成。
[0067] WAlgae为例设计引物，可W直接打开Primer Premier 5.0,点击File菜单化W中 DNA Sequence,然后在下面空白处输入Algae基因序列，出现新界面，点击Primer,再点击 Search,弹出对话框，点击0K按钮，出现含有各种可能引物信息的新窗口。通过点击相应引 物捜寻界面中的各对引物，便会相应显示引物的各种信息。最后在引物编辑窗口对程序自 动和手工找到的引物序列进行编辑，并根据具体基因引物设计的类型、研究目的和意义进 行选择。
[006引 4. BLAST 比对。
[0069]首先登录ht1:p://www.ncbi .nlm.nih.gov，然后点击BLAST;其次进入Nucleotide blast，在Search对话框中将上述获得的序列复制粘贴，点击BLAST，Gen Bank将自动把输入 的序列与序列资源库中所有相关序列进行比较。在比较结果中列出所有的相关序列比较的 情况，当然也包括同一物种不同长度及不同物种已在Gen Bank中登记的相关基因序列的综 合比较。
[0070] 如果是对特异引物的特异性分析，还可W登录WWW . Gramene . org-前后引物 Blastn-位置分析一如均只在基因组的相近位置有完全匹配，则可认为具有较好特异性。 然后可W根据研究目的选择使用相应的序列比较资料，也可W利用结果中提供的信息获得 自己最需要的一种基因序列，为下一步的PCR引物设计打下基础。
[0071] 5.筛选后引物的综合评价。
[0072] 筛选后引物首先可W在软件上进行分析评价，设计引物的软件一般要具备引物分 析评价功能。然后可W通过PCR扩增后的凝胶成像系统进行试验验证:一是PCR产物的量W 及PCR扩增的特异性和效率;二是是否会形成引物二聚体条带;S是WDNA为模板设计引物 时，PCR扩增产物是否与预期PCR产物大小相当。
[0073] 图2是本发明所提及的Algae的PCR产物电泳图，可W看出该PCR产物不仅产量高， 而且特异性条带非常明显，无发夹结构和引物二聚体，产物与预期PCR产物大小相同。
[0074] 6.引物设计后基因的重新检测
[0075] 引物多次筛选是为了在设计的多对引物中找出适合进行特异、高效PCR扩增的引 物。主要应注意W下2点：一是将得到的一系列引物分别在Gen Bank中进行回检，即把每条 引物在比对工具化ttp://www.ncbi .nlm.nih. gov/blast)的blas1:n;r中进行同源性检索，弃 掉与基因组其他部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。一般连续lObp W上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3/端应避免连续5~6bp的同源。二 是WmRNA为模板设计引物时，要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接 位点，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。
[0076] 7.最后确定能特异性扩增真核藻类的引物序列是：
[0077] 上游引物：5 ' -AAAGTTAGGTGAGCG-3 ' ；沈Q ID NO. 1 [007引下游引物：5 ' -CAGTCAATCGGTATG-3 '。沈Q ID NO. 2
[0079] 实施例2
[0080] 本实施例中所述的环氧丙烷皂化废水活性污泥取自滨化集团股份有限公司环氧 丙烷皂化废水处理过程中的活性污泥。
[0081] -种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的方法，包括如下步骤：
[0082] (1)取环氧丙烷皂化废水活性污泥样品，提取总DNA;
[0083] 活性污泥取自山东滨化集团污水处理厂的活性污泥，该污泥是处理环氧丙烷皂化 废水的活性污泥。从污水处理厂取来的新鲜污泥，4°C4000r/min离屯、lOmin，弃上清后置于4 °C冰箱中保存。根据中国专利文献CN103789300A(申请号201410067311.X)中实施例1所记 载的方法提取活性污泥中的宏基因组DNA;
[0084] (2) W步骤（1)制得的总DNA为模板，利用上述鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中 真核藻类多样性的引物进行PCR扩增，用干净的手术刀在紫外灯下割取含所要PCR产物主条 带所处琼脂块，随后的纯化过程按照TIANGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明进行，审U 得扩增产物;扩增产物的片段大小在7(K)bp左右；
[0085] PCR扩增引物序列如下：
[00化]上游引物：5 ' -AAAGTTAGGTGAGCG-3 ' ；沈Q ID NO. 1
[0087]下游引物：5 ' -CAGTCAATCGGTATG-3 '。沈Q ID NO. 2
[0088] PCR扩增体系如下，总体系50化：
[0089]
[0090] PCR扩增程序如下：
[0091] 95 °C 预变性 5min; 94 °C 变性 45s，53.5 °C 退火 45s，72 °C 延伸 45s，进行 35 个循环；72 °C 延伸 7min。
[0092] 上述大肠杆菌JM109感受态细胞采用如下方法制备：
[0093] (I)受体菌的培养
[0094] 取活化的大肠杆菌化.coli)JM109单菌落，接种于3~5ml LB液体培养基中，37°C 下振荡培养10~14小时至对数生长后期，将该菌悬液:(50~100)的体积比接种于 lOOmlLB液体培养基中，37°C振荡培养2~3小时至0〇6〇〇 = 0.4~0.6，制得培养液；
[00巧](II)化C1激制备感受态细胞
[0096] ①将培养液转入离屯、管中，冰置10分钟，然后于4°C下3000g离屯、10分钟；
[0097] ②弃上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰置15~30分钟 后，4°C下3000g离屯、10分钟；
[009引③弃上清，加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的化Cl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰 置3分钟，制得感受态细胞悬液；
[0099] 上述连接入PGM-T载体的连接体系为10化：
[0100]
[0101] 连接条件为:16 °C连接过夜。
[0102] 上述转化大肠杆菌JM109感受态细胞的步骤如下：
[0103] ①大肠杆菌JM109感受态细胞20化L加连接产物化L混合物于离屯、管中，冰上放置 30min，期间摇动3次防止受体菌沉底；
[0104] ②42 °C水浴加热90秒，拿出放入冰盒冰上2min;
[01化]③加灭菌LB液体培养基80化L，混匀；
[0106] ④37 °C、180巧m摇床培养45min，使菌复苏；
[0107] ⑤3000巧m离屯、2min，去上清800化，余下200化，重悬；
[0108] ⑥重悬液涂于固体培养基上，室溫静置30分钟直至液体被吸收；
[0109] ⑦37 °C恒溫箱，倒置培养12~20h，制得。
[0110] 上述LB液体培养基，每升组分如下：
[0111] 膜蛋白腺lOg、酵母粉5g、氯化钢lOg
[0112] 上述固体培养基在LB液体培养基的基础上，每升加入如下组分：
[0113] 50mg/ml氨节青霉素(Amp)200ml、质量浓度20%的IPTG 350化、质量浓度2%的X- gal 2ml、琼脂20邑。
[0114] (3)对步骤（2)制得的扩增产物进行测序，测序结果进行blastn(http:// blast .ncbi .nlm.nih.gov化对定种；
[0115] 登录网站ht1:p://www.ncbi .nlm.nih.gov，点击BLAST;然后进入tblatn，在Enter 如ery Sequence对话框中将测序后的序列复制粘贴，点击BLAST,Gen Bank自动把输入的序 列与序列资源库中所有相关序列进行比较;在比较结果中，找出同源性最高的一个确定未 知藻的种属。
[0116] 纯种真核藻类DNA的PCR产物及菌液PCR产物提交销尚生物技术(上海)有限公司进 行测序，测序结果进行blastn化ttp: //blast. ncbi . nlm. nih. gov)比对定种。
[0117] (4)将步骤（3)的测序结果输入GenBank，通过BLAST程序在GenBank (WWW. ncbi . nlm. nih. gov)中进行相似性捜索，并从比对后所得的结果中找到相似度比较高 的序列进行比对分析，应用MAGA4.0软件使用N-J法构建系统进化树，点击Bootstrap Test of陆ylogeny选择化i曲bor-化ining进行bootstrap值分析，经重复取样1000次，得到可信 度最高的一棵，结果如图2所示。
[011引对比例1
[0119] 本实施例中所述的环氧丙烷皂化废水活性污泥取自滨化集团股份有限公司环氧 丙烷皂化废水处理过程中的活性污泥。
[0120] 常规PCR反应体系及程序包括如下步骤：
[0121 ] (1)取环氧丙烷皂化废水活性污泥样品，提取总DNA;
[0122] 活性污泥取自山东滨化集团污水处理厂的活性污泥，该污泥是处理环氧丙烷皂化 废水的活性污泥。从污水处理厂取来的新鲜污泥，4°C4000r/min离屯、lOmin，弃上清后置于4 °C冰箱中保存。根据中国专利文献CN103789300A(申请号201410067311.X)中实施例1所记 载的方法提取活性污泥中的宏基因组DNA;
[0123] (2) W步骤（1)制得的总DNA为模板，利用上述鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中 真核藻类多样性的引物进行PCR扩增，扩增产物的片段大小在7(K)bp左右；
[0124] PCR扩增引物序列如下：
[01 巧]上游引物：5 ' -AAAGTTAGGTGAGCG-3 ' ；沈Q ID NO. 1 [01 %]下游引物：5 ' -CAGTCAATCGGTATG-3 '。沈Q ID NO. 2
[0127] PCR扩增体系如下，总体系50iiL
[012 引
[0129] PCR扩增程序如下：
[0130] 95 °C 预变性 5min; 94°C 变性 45s，50 °C 退火 45s，72 °C 延伸 45s，进行 30 个循环；72 °C 延伸1 Om i n，琼脂糖凝胶电泳结果如图1A所示。
[0131] 对比例2
[0132] 本对比例中所述的环氧丙烷皂化废水活性污泥同样取自滨化集团股份有限公司 环氧丙烷皂化废水处理过程中的活性污泥。
[0133] 本对比例采用中国专利文献CN103849678A(申请号201210517032.X)说明书所述 真核细胞通用18s rDNA引物进行PCR扩增。
[0134] 真核生物通用18s rDNA引物，序列为：
[0135] 18S-F 5'-CCGAATTCGTCGACAACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'；
[0136] ISs-R 5'-CCCGGGATCCAAGCTTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3'.
[0137] 本例中其他操作过程同实施例2。
[013引试验例
[0139] 分别取通过对比例和实施例2的方法得到的PCR产物扣L点样于含化g/血漠化乙锭 的0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测。电泳缓冲液为1 X TAE，电压为100V，电泳时间为20min， 凝胶成像系统观察并记录相应结果，如图1所示。
[0140] 由图1A可W看出，使用特异性引物采用常规方法进行PCR扩增，效果较差，虽然有 特异性的条带被扩增出来，大小在700bp左右，条带不是很明显，有几个样品没有被扩增出 来。
[0141] 由图1B可W看出，对于特异性的引物采用调整后的PCR程序可W扩增出非常明显 的特异条带，大小在7(K)bp左右，并且无其他非特异性条带出现，扩增效率高。通过该引物可 W简单有效的扩增出活性污泥中的真核藻类，并可对其多样性进行研究。
[0142] 由图1C可W看出，采用通用18S rDNA引物可W扩增出特异性条带，大小在ISOObp 左右，扩增出的条带较弥散。后续对其进行分析发现该引物扩增出来的并不只有真核藻类， 同时还包含有部分原生动物等的基因，因此其并不能将真核藻类特异性的扩增出来。经测 序后发现经其对活性污泥扩增出的真核藻类只有金藻运一种，不能将其他藻类扩增出来， 因而达不到分析活性污泥中真核藻类多样性的目的。
【主权项】
1. 一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物，其特征在于，该引 物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。2. -种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的方法，其特征在于，包括 如下步骤： (1)取环氧丙烷皂化废水活性污泥样品，提取总DNA; ⑵以步骤（1)制得的总DNA为模板，利用权利要求1所述鉴定环氧丙烷皂化废水活性污 泥中真核藻类多样性的引物进行PCR扩增，制得扩增产物;扩增产物的片段大小在700bp左 右； (3) 对步骤(2)制得的扩增产物进行测序，测序结果进行blastn比对定种； (4) 将步骤(3)的测序结果输入GenBank，通过BLAST程序在GenBank中进行相似性搜索， 并从比对后所得的结果中找到相似度比较高的序列进行比对分析，应用MAGA4.0软件使用 N-J法构建系统进化树，点击Bootstrap Test of Phylogeny选择Neighbor-Joining进行 bootstrap值分析，经重复取样，得到可信度最高的一棵。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取总DNA的步骤如下： 取环氧丙烷皂化废水活性污泥样品，4°C条件下4000r/min离心10min，弃上清，使用土 壤DNA提取试剂盒提取活性污泥中的宏基因组DNA。4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，总体系50 uL： ddH20 35mL PC'R reaction buffer 5j.lL dNTP 4,liL 上游引物 2|iL 下游引物 2pL 模板 1 (iL Taq 岣 1 tiL PCR扩增程序如下： 95°C预变性5min;94°C变性45s，54°C退火45s，72°C延伸45s，进行35个循环；72°C延伸 7min〇5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，对扩增产物进行测序的步骤 如下： 回收步骤（2)制得的扩增产物，连接入PGM-T载体，制得连接产物，然后转化大肠杆菌 JM109感受态细胞，然后进行测序。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述连接入PGM-T载体的连接体系为10yL: PGM-T 载体 1 u L PCR产物 1 u L T4 DNA Ligasc 1 n L 10. DN A Ligation Buffer i P L dd H20 补足至 10 u L ; 连接条件为：16 °C连接过夜。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌JM109感受态细胞采用如下方 法制备： (I) 受体菌的培养 取活化的大肠杆菌(E. coli) JM109单菌落，接种于3~5ml LB液体培养基中，37°C下振 荡培养10~14小时至对数生长后期，将该菌悬液以1: (50~100)的体积比接种于100ml LB 液体培养基中，37°C振荡培养2~3小时至0D6Q() = 0.4~0.6，制得培养液； (II) CaCl2法制备感受态细胞 ① 将培养液转入离心管中，冰置10分钟，然后于4°C下3000g离心10分钟； ② 弃上清，用预冷的〇. 〇5mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰置15~30分钟后，4°C 下3000g离心10分钟； ③ 弃上清，加入4ml预冷含质量浓度为15 %甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细 胞，冰置3分钟，制得感受态细胞悬液； 进一步优选的，上述转化大肠杆菌JM109感受态细胞的步骤如下： ① 大肠杆菌JM109感受态细胞200yL加连接产物lyL混合物于离心管中，冰上放置 30min，期间摇动3次防止受体菌沉底； ② 42 °C水浴加热90秒，拿出放入冰上2min; ③ 加灭菌LB液体培养基800yL，混匀； ④ 37 °C、180rpm摇床培养45min，使菌体复苏； ⑤ 3000rpm离心2min，去上清800此，余下200yL，重悬； ⑥ 重悬液涂于固体培养基上，室温静置30分钟直至液体被吸收； ⑦ 37 °C恒温箱，倒置培养12~20h，制得。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LB液体培养基，每升组分如下： 胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g; 所述固体培养基在LB液体培养基的基础上，每升加入如下组分： 50mg/ml氨苄青霉素（Amp)200ml、质量浓度20%的IPTG 350此、质量浓度2%的X-gal 2ml、琼脂 20g。9. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，对测序结果进行blastn比对 定种的步骤如下： 登录网站http://www .ncbi.nlm.nih.gov，点击BLAST;然后进入 tblatn，在Enter Query Sequence对话框中将测序后的序列复制粘贴，点击BLAST，Gen Bank自动把输入的序 列与序列资源库中所有相关序列进行比较;在比较结果中，找出同源性最高的一个确定未 知藻的种属； 优选的，所述步骤(4)中，重复取样次数为1000次。
【文档编号】C12N15/11GK106048058SQ201610647307
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月9日 公开号201610647307.X, CN 106048058 A, CN 106048058A, CN 201610647307, CN-A-106048058, CN106048058 A, CN106048058A, CN201610647307, CN201610647307.X
【发明人】李强, 何荣, 樊祥宇, 李玉梅, 古鹏飞, 纪雁, 沈峻宇
【申请人】济南大学