苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法

文档序号:10680048阅读:465来源:国知局
苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法
【专利摘要】本发明提供了一种苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法,该方法具有操作简单、快速、准确、灵敏等优点。该方法包括:步骤A:提取苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽总基因组DNA,进行浓度及OD值检测,并稀释备用;步骤B:设计苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的线粒体、核糖体的分子标记的特异性引物;步骤C:使用特异性引物对苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽每个单独个体的总基因组DNA进行PCR扩增;步骤D:对PCR分子反应体系进行优化;步骤E:采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;步骤F:根据扩增产物的片段大小及目的条带显现程度确定其准确性及扩增效果的稳定性。
【专利说明】
苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物分子标记技术领域,特别涉及一种苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的线粒体和核糖体的分子标记筛选方法。
【背景技术】
[0002]线粒体基因序列中由于无间隔区和内含子,不存在重复序列和不等交换,在遗传过程中不易发生基因的重组、倒位、易位等突变,并且严格遵守母系遗传;同时,线粒体基因能够在较短时间内丢失祖先单倍型,完成谱系分化。正是由于线粒体基因组的特殊结构与进化特点,使其成为昆虫种群遗传学与系统进化研究的重要物质。在种群遗传学研究中,线粒体COI (cytochrome oxidase I,COI)、CYTB(Cytochrome b)和ND5(NADH dehydrogenasesubunit 5)基因是研究人员筛选和应用频率较高的一组分子标记,其中COI基因的使用频率为最高,特别是在种群遗传研究中。
[0003]核糖体基因中含有丰富的生物学信息,采用合适的核糖体分子标记研究昆虫的系统发育能够相对真实的反映昆虫的进化历史。核糖体DNA为中度重复的DNA序列,以串联多拷贝形式存在,主要编码核糖体RNA。目前研究中应用较多的为转录间隔区ITS序列,28SrRNA基因编码区,以及部分编码蛋白质的核基因序列。EF-1a基因作为一种编码蛋白的核基因,涉及依赖GTP氨酰tRNA和核糖体受位的结合,由于其既具有氨基酸序列的保守性,又存在进化速率比较快的内元,因此它不仅应用于研究高级阶元系统发育,而且用于分析低阶元的系统发育问题。相关学者曾一度主张将EF-1a作为分子系统学研究中的标准分子标记。
[0004]苜蓿盲蝽AdelphocorisIineolatus(Goeze)和三点苜蓿盲蝽Adelphocorisfasciaticollis(Reuter)属于半翅目(Hemiptera)盲畴科(Miridae)首猜盲畴属(Adelphocoris)。苜蓿盲蝽广泛分布于全北区和东洋区,在我国主要分布在黄河流域和西北内陆地区。三点苜蓿盲蝽是我国的特有种,重点分布在华北、西北地区。两种盲蝽均为棉花上的重要害虫,尤其是近十年来,随着转基因棉花的大量种植,化学农药的减少使用,该虫已经从次要害虫上升为主要害虫,严重危害棉花的正常生长,影响产量和质量,给农业生产造成重大经济损失。为了更有效及有针对性的对其进行防治,对其种群遗传结构、种群遗传多样性、系统发育关系进行研究是非常有必要的。线粒体与核糖体分子标记是开展这方面研究非常理想的标记,但是目前仅有很少关于苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽线粒体及核糖体分子标记可用,这种现状制约了两种盲蝽种群遗传及系统发育关系研究的开展。

【发明内容】

[0005]鉴于此,有必要针对传统技术存在的问题,提供了一种苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法,该方法具有操作简单、快速、准确、灵敏等优点。
[0006]为达到发明目的,提供一种苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法,包括:步骤A:提取苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽总基因组DNA,进行浓度及OD值检测,并稀释备用;步骤B:设计苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的线粒体、核糖体的分子标记的特异性引物,其中苜蓿盲蝽与三点苜蓿盲蝽线粒体与核糖体分子标记及其对应的9对特异引物序列和I对通用引物序列如下所示:
[0007]苜蓿盲蝽线粒体分子标记:
[0008]COI标记:如SEQ ID NO:1所示;
[0009]COI标记的特异性引物序列:
[0010]Lin-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAATC[0011 ]Lin-CO1-R:CTGAATAATTAATATTTGTGCCATGA
[0012]CYTB标记:如SEQ ID NO:2所示;
[0013]CYTB标记的特异性引物序列:
[0014]Lin-CYTB-F:ATGAATAAACCTATACGAAAAAAACAC
[0015]Lin-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA
[0016]ND5标记:如SEQ ID NO:3所示;
[0017]ND5标记的特异性引物序列:
[0018]Lin-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAA
[0019]Lin-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATTT
[0020]苜蓿盲蝽核糖体分子标记:
[0021]16S rDNA标记:如SEQ ID NO:4所示;
[0022]16S rDNA标记的特异性引物序列:
[0023]Lin-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT
[0024]Lin-16S-R:TTATTAGTAATTTTGTTGTAGTGAATATATTTTATTEF-1a标记:如SEQ ID NO:5所示;
[0025]Lin-EF-1a-F:CCTAAGAACCCTGCTGATCTG
[0026]Lin-EF-1a-R:GACCTTTCCTCTTCCTGGTATC
[0027]三点苜蓿盲蝽线粒体分子标记:
[0028]COI标记:如SEQ ID NO:6所示;
[0029]COI标记的特异性引物序列:
[0030]Fas-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAAT[0031 ]Fas-CO1-R:TTAGAATGATCTAATGATAGGTAATTCA
[0032]CYTB标记:如SEQ ID NO:7所示;
[0033]CYTB标记的特异性引物序列:
[0034]Fas-CYTB-F:ATGAATAAACCCATACGAAAAAAAC
[0035]Fas-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA
[0036]ND5标记:如SEQ ID NO:8所示;
[0037]ND5标记的特异性引物序列:
[0038]Fa s-ND 5-F: A AA T T A T T A T T A T A AT G AT A AA A AA A AT AA AAFa s-ND 5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATT
[0039]16S rDNA标记:如SEQ ID NO:9所示;
[0040]16S rDNA标记的特异性引物序列:
[0041 ]Fas-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT
[0042]Fas-16S-R:GAAAATTATATTAATTATTCTTTTTAAAAAAAATAG
[0043]rDNA-1TS标记:如SEQ ID NO: 10所示;
[0044]rDNA-1TS标记的通用引物序列:
[0045]28Z:AGACTCCTTGGTCCGTGTTTC
[0046]Pl:ATCACTCGGCTCGTGGATCG
[0047]步骤C:使用特异性引物对苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽每个单独个体的总基因组DNA进行PCR扩增;步骤D:对PCR分子反应体系进行优化;步骤E:采用2 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;步骤F:根据扩增产物的片段大小及目的条带显现程度确定其准确性及扩增效果的稳定性。
[0048]在其中一个实施例中,步骤A中采用天根公司生产的TIANamp Genomic DNA试剂盒提取苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽总基因组DNA,具体过程包括:步骤Al:取昆虫除腹部以外的组织放入1.5ml的离心管中,再加入200ul缓冲液GA,均匀震荡;步骤A2:加入20_30ul蛋白酶K溶液混匀;步骤A3:放入560C水浴锅中水浴3-4h,每半小时震荡一次,直至组织完全溶解;步骤A4:加入200ul缓冲液GB,充分颠倒混匀,70°C水浴1min,简短离心使管壁的水珠沉入管底部;步骤A5:加入200ul无水乙醇,来回混匀震荡,简短离心以除去管盖内壁的水珠;步骤A6:将上一步所得溶液及沉淀加入组装好的吸附柱CB3中,12000rpm离心30s-lmin,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中;步骤A7:向吸附柱CB3中加入500ul已加入无水乙醇的缓冲液⑶,12000rpm离心Imin,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中;步骤A8:向吸附柱CB3中加入700ul已加入无水乙醇的漂洗液PW,12000rpm离心lmin,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中;步骤A9:再次向吸附柱CB3中加入600ul已加入无水乙醇的漂洗液PW,12000rpm离心Imin,倒掉废液;步骤AlO:将吸附柱CB3放入收集管中,12000rpm离心3min,倒掉废液;将吸附柱CB3开盖置于超净工作台中,室温放置20-30分钟,达到彻底晾干吸附材料中残余漂洗液的目的;步骤All:将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE或者加入无菌水,室温放置2-5min,12000rpm离心3min,将溶液收集到离心管中,最后将DNA产物保存在-20°C冰箱中备用;步骤A12:将离心得到的DNA溶液再次加入吸附柱CB3中,室温放置2min,12000rpm离心2min,将溶液再次收集到离心管中;步骤A13:使用2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的大小和纯度,使用Nanodrop仪器检测提取的总DNA的浓度与纯度,即D260,D280及D260/D280的比值。
[0049]在其中一个实施例中,步骤B包括:步骤B1:从GenBank数据库下载苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽对应的分子标记的序列,或者通过实验室已测得的苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的相关转录组数据筛选相应分子标记的序列;步骤B2:采用Primer 5.0软件,按照引物设计需要满足的条件进行引物的设计,所述条件包括下列项目中的一种或多种:Tm值的范围、引物序列的最适长度范围、扩增产物预期长度范围、GC含量。
[0050]在其中一个实施例中,步骤C中采用的PCR扩增体系为:总量为25ul,其中模板DNA2ul,1uM 正向引物 Iul,1uM 反向引物 Iul,1mM dNTP mix0.5ul,5x PCR Buffer 5ul,TaqDNA Polymerase 0.5ul,dd H2O 15ul 0
[0051 ] 在其中一个实施例中,步骤D包括:步骤Dl: 94 °C预变性3min;步骤D2:之后进行30-35个循环,每个循环包括:94°C变性Imin,50-59°C退火Imin,72°C延伸lmin-lmin 30s,末次循环72°C延伸5min,4°C保存。
[0052]在其中一个实施例中,步骤E中采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物及PCR产物纯化,步骤E包括:步骤El:取3μ1 PCR扩增产物,加Ιμ?左右上样缓冲液,混合均匀,加样于I XTAE缓冲液配制的2%琼脂糖凝胶孔中,点样后,150V恒压条件下电泳25min;步骤Ε2:将含有目的片段的凝胶放入凝胶成像系统中初步观察目的片段的大小,对凝胶进行照相并记录PCR产物电泳图像;步骤E3:对PCR产物纯化采用2 %琼脂糖凝胶检测,核酸染料染色,在凝胶成像仪器中将PCR产物切胶回收,用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。
[0053]本发明的技术方案至少具有如下优点:
[0054](I)本发明提供了一种苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽线粒体和核糖体共9对PCR扩增稳定特异性强的引物序列和I对适用于两种盲蝽的通用引物。
[0055](2)本发明提供了一种筛选线粒体和核糖体分子标记简单、快速的方法,利用GenBank中已有的基因序列和转录组数据可以方便、准确的筛选到大量用于种群遗传及系统发育研究的有效分子标记。
【附图说明】
[0056]图1为本发明一个实施例中的一种苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法的步骤流程图;
[0057]图2(a)_(f)为本发明实施例中的实验结果示意图。
【具体实施方式】
[0058]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例对本发明方法、装置和系统进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
[0059]如图1所示,为一个实施例中的一种苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法的步骤流程图。具体包括以下步骤A至步骤F。
[0060]步骤A:提取苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽总基因组DNA,进行浓度及OD值检测,并稀释备用。
[0061]步骤B:设计苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的线粒体、核糖体的分子标记的特异性引物。
[0062]其中苜蓿盲蝽与三点苜蓿盲蝽线粒体与核糖体分子标记及其对应的9对特异引物序列和I对通用引物序列如下所示:
[0063]苜蓿盲蝽线粒体分子标记:
[0064]COI标记:如SEQ ID NO:1所示;
[0065]COI标记的特异性引物序列:
[0066]Lin-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAATC
[0067]Lin-CO1-R:CTGAATAATTAATATTTGTGCCATGA
[0068]CYTB标记:如SEQ ID NO:2所示;
[0069]CYTB标记的特异性引物序列:
[0070]Lin-CYTB-F:ATGAATAAACCTATACGAAAAAAACAC[0071 ] Lin-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA
[0072]ND5标记:如SEQ ID NO:3所示;
[0073]ND5标记的特异性引物序列:
[0074]Lin-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAA
[0075]Lin-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATTT
[0076]苜蓿盲蝽核糖体分子标记:
[0077]16S rDNA标记:如SEQ ID NO:4所示;
[0078]16S rDNA标记的特异性引物序列:
[0079]Lin-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT
[0080]Lin-16S-R:TTATTAGTAATTTTGTTGTAGTGAATATATTTTATT[0081 ]EF-1a标记:如SEQ ID NO:5所示;
[0082]Lin-EF-1a-F:CCTAAGAACCCTGCTGATCTG
[0083]Lin-EF-1a-R:GACCTTTCCTCTTCCTGGTATC
[0084]三点苜蓿盲蝽线粒体分子标记:
[0085]COI标记:如SEQ ID NO:6所示;
[0086]COI标记的特异性引物序列:
[0087]Fas-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAAT
[0088]Fas-CO1-R:TTAGAATGATCTAATGATAGGTAATTCA
[0089]CYTB标记:如SEQ ID NO:7所示;
[0090]CYTB标记的特异性引物序列:
[0091 ]Fas-CYTB-F:ATGAATAAACCCATACGAAAAAAAC
[0092]Fas-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA
[0093]ND5标记:如SEQ ID NO:8所示;
[0094]ND5标记的特异性引物序列:
[0095]Fas-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAAA
[0096]Fas-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATT
[0097]16S rDNA标记:如SEQ ID NO:9所示;
[0098]16S rDNA标记的特异性引物序列:
[0099]Fas-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT
[0100]Fas-16S-R:GAAAATTATATTAATTATTCTTTTTAAAAAAAATAG
[0101]rDNA-1TS标记:如SEQ ID NO:10所示;
[0102]rDNA-1TS标记的通用引物序列:
[0103]28Z:AGACTCCTTGGTCCGTGTTTC
[0104]Pl:ATCACTCGGCTCGTGGATCG
[0105]步骤C:使用特异性引物对苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽每个单独个体的总基因组DNA进行PCR扩增。
[0106]步骤D:对PCR分子反应体系进行优化。
[0107]步骤E:采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0108]步骤F:根据扩增产物的片段大小及目的条带显现程度确定其准确性及扩增效果的稳定性。
[0109]为使本领域技术人员更好地理解,现列举具体实施例进行详细说明。
[0110]首先,进行苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽分子标记筛选的PCR引物组合的设计与合成。
[0111]根据苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽线粒体细胞色素氧化酶I(COI)、细胞色素b(Cytb)基因、线粒体NADH脱氢酶亚基5(ND5)基因、16S rDNA基因、编码蛋白质的核基因EF-1a序列,利用Primer Primer5软件分别设计用于PCR扩增上述分子标记的特异性引物。引物序列参见上文。本实施例中的引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
[0112]其次,利用线粒体和核糖体分子标记快速扩增苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽宁夏、吉林、陕西、黑龙江、山西以及河北种群。
[0113](I)采集宁夏、吉林、陕西的苜蓿盲蝽个体和黑龙江、山西以及河北的三点苜蓿盲蝽个体,提取全基因组DNA。
[0114]分别选取代表种群,即选取宁夏的青铜峡、吉林长岭、陕西商洛地区的苜蓿盲蝽个体;同时选取黑龙江肇东、山西太古、河北涿州地区的三点苜蓿盲蝽个体。两种盲蝽的野外采集使用网捕法,采用吸虫管收集成虫,然后将成虫放入无水乙醇中,最后带回实验室内,采用体式解剖镜参照鉴定书籍及相关文献资料进一步对成虫形态特征进行鉴定确认,确保种类鉴定正确无误。
[0115]提取总基因组DNA时,将成虫腹部去除,剩余组织结构作为试验材料,采用天根生化科技有限公司生产的TIANamp Genomic DNA试剂盒提取因组DNA。参照说明书操作。
[0116](2)线粒体和核糖体分子标记的PCR扩增
[0117]利用实施例1合成的引物进行四种线粒体和2种核糖体分子标记的PCR扩增,扩增反应在美国B1-RAD公司生产的Myclycler,S100PCR扩增仪上进行。PCR扩增的反应体系包括25ul,其中模板DNA 2ul,1uM正向引物Iul,1uM反向引物Iul,1mM dNTP mix 0.5ul,5xPCR Buffer 5ul,Taq DNA Polymerase 0.5ul,ddH20 15ulICR反应体系包括94°C预变性3min ;之后进行30-35个循环,每个循环包括:94 °C变性Imin,50-59 °C退火Imin(不同分子标记退火温度存在一定差异),72°C延伸lmin-lmin 30s(视PCR产物长度而定),末次循环72°C延伸5min,4°C保存。
[0118](3)PCR产物纯化
[0119]PCR产物采用2%琼脂糖凝胶检测,核H2酸染料染色,在凝胶成像仪器中将PCR产物切胶回收,用PCR产物纯化试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)进行纯化,参照说明书操作。
[0120](4)纯化PCR产物测序和序列比对
[0121]将纯化的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,采用双向测序方法,测序反应在3730XL DNA Genetic Analyser(ABI)测序仪上进行。获得测序结果后,利用ContigExpress序列分析软件进行双向测序结果的拼接及序列的校对。在GenBank中通过Blast工具进行目的序列的比对,确定扩增序列是否为所扩增种类的目的片段。
[0122]图2为本发明实施例中的实验结果示意图。具体地:
[0123]图2(a)是本发明实施例中苜蓿盲蝽利用引物Lin-⑶1-F/Lin-⑶1-R进行PCR扩增的结果;泳道1-3为宁夏青铜峡苜蓿盲蝽样本,泳道4-6为吉林长岭样本,6-9为陕西商洛样本,10-12为阴性对照,M为2000bp DNA Marker。
[0124]图2(b)是本发明实施例中苜蓿盲蝽利用引物Lin-CYTB-F/Lin-CYTB-R进行PCR扩增的结果;泳道1-3为宁夏青铜峡苜蓿盲蝽样本,泳道4-6为吉林长岭样本,6-9为陕西商洛样本,10-12为阴性对照,]?为200(^口 DNA Marker。
[0125]图2(c)是本发明实施例中苜蓿盲蝽利用引物Lin-ND5-F/Lin-ND5-R进行PCR扩增的结果;泳道1-3为宁夏青铜峡苜蓿盲蝽样本,泳道4-6为吉林长岭样本,6-9为陕西商洛样本,10-12为阴性对照,M为2000bp DNA Marker。
[0126]图2(d)是本发明实施例中苜蓿盲蝽利用引物Lin-EF-la-F/Lin-EF-la-R进行PCR扩增的结果;泳道1-3为宁夏青铜峡苜蓿盲蝽样本,泳道4-6为吉林长岭样本,6-9为陕西商洛样本,10-12为阴性对照,M为2000bp DNA Marker。
[0127]图2(e)是本发明实施例中三点苜蓿盲蝽利用引物Fas-⑶1-F/Fas-CO1-R进行PCR扩增的结果;泳道1-3为黑龙江肇东苜蓿盲蝽样本,泳道4-6为山西太古样本,6-9为河北涿州样本,10-12为阴性对照,M为2000bp DNA Marker。
[0128]图2(f)是本发明实施例中三点苜蓿盲蝽利用引物Fas-CYTB-F/Fas-CYTB-R进行PCR扩增的结果;泳道1-3为黑龙江肇东苜蓿盲蝽样本,泳道4-6为山西太古样本,6-9为河北涿州样本,10-12为阴性对照,M为2000bp DNA Marker。
[0129]以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
[0130]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1.一种苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的分子标记筛选方法,其特征在于,包括: 步骤A:提取苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽总基因组DNA,进行浓度及OD值检测,并稀释备用; 步骤B:设计苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的线粒体、核糖体的分子标记的特异性引物,其中苜蓿盲蝽与三点苜蓿盲蝽线粒体与核糖体分子标记及其对应的9对特异引物序列和I对通用引物序列如下所示: 苜蓿盲蝽线粒体分子标记: COI标记:如SEQ ID NO:1所示; COI标记的特异性引物序列: Lin-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAATC Lin-CO1-R:CTGAATAATTAATATTTGTGCCATGA CYTB标记:如SEQ ID NO:2所示; CYTB标记的特异性引物序列: Lin-CYTB-F:ATGAATAAACCTATACGAAAAAAACAC Lin-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA ND5标记:如SEQ ID NO:3所示; ND5标记的特异性引物序列: Lin-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAA Lin-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATTT 苜蓿盲蝽核糖体分子标记: 16S rDNA标记:如SEQ ID NO:4所示; 16S rDNA标记的特异性引物序列: Lin-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT Lin-16S-R:TTATTAGTAATTTTGTTGTAGTGAATATATTTTATT EF-1a标记:如SEQ ID NO:5所示; Lin-EF-1a-F:CCTAAGAACCCTGCTGATCTG Lin-EF-1a-R:GACCTTTCCTCTTCCTGGTATC 三点苜蓿盲蝽线粒体分子标记: COI标记:如SEQ ID NO:6所示; COI标记的特异性引物序列: Fas-CO1-F:ATGAATAAATGATTATTTTCCACAAAT Fas-CO1-R:TTAGAATGATCTAATGATAGGTAATTCA CYTB标记:如SEQ ID NO:7所示; CYTB标记的特异性引物序列: Fas-CYTB-F:ATGAATAAACCCATACGAAAAAAAC Fas-CYTB-R:TTAAATATTTCTATCTCAGTATTTTAA ND5标记:如SEQ ID NO:8所示; ND5标记的特异性引物序列: Fas-ND5-F:AAATTATTATTATAATGATAAAAAAAATAAAA Fas-ND5-R:AGTTCATTTTTGAATAATTTAAATTGTGATT 16S rDNA标记:如SEQ ID NO:9所示; 16S rDNA标记的特异性引物序列: Fas-16S-F:GAATTTTAAAAATAAACAATAAACAAAAATT Fas-16S-R:GAAAATTATATTAATTATTCTTTTTAAAAAAAATAG rDNA-1TS标记:如SEQ ID NO:10所示; rDNA-1TS标记的通用引物序列: 28Z:AGACTCCTTGGTCCGTGTTTC Pl:ATCACTCGGCTCGTGGATCG 步骤C:使用特异性引物对苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽每个单独个体的总基因组DNA进行PCR扩增; 步骤D:对PCR分子反应体系进行优化; 步骤E:采用2 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物; 步骤F:根据扩增产物的片段大小及目的条带显现程度确定其准确性及扩增效果的稳定性。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤A中采用天根公司生产的TIANampGenomic DNA试剂盒提取苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽总基因组DNA,具体过程包括: 步骤Al:取昆虫除腹部以外的组织放入1.5ml的离心管中,再加入200ul缓冲液GA,均匀震荡; 步骤A2:加入20-30ul蛋白酶K溶液混匀; 步骤A3:放入56 0C水浴锅中水浴3-4h,每半小时震荡一次,直至组织完全溶解; 步骤A4:加入200ul缓冲液GB,充分颠倒混匀,70°C水浴1min,简短离心使管壁的水珠沉入管底部; 步骤A5:加入200ul无水乙醇,来回混匀震荡,简短离心以除去管盖内壁的水珠; 步骤A6:将上一步所得溶液及沉淀加入组装好的吸附柱CB3中,12000rpm离心30s-1min,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中; 步骤A7:向吸附柱CB3中加入500ul已加入无水乙醇的缓冲液⑶,12000rpm离心lmin,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中; 步骤A8:向吸附柱CB3中加入700ul已加入无水乙醇的漂洗液PW,12000rpm离心Imin,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中; 步骤A9:再次向吸附柱CB3中加入600ul已加入无水乙醇的漂洗液PW,12000rpm离心Imin,倒掉废液; 步骤AlO:将吸附柱CB3放入收集管中,12000rpm离心3min,倒掉废液;将吸附柱CB3开盖置于超净工作台中,室温放置20-30分钟,达到彻底晾干吸附材料中残余漂洗液的目的;步骤A11:将吸附柱C B 3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加5 O -200ul洗脱缓冲液TE或者加入无菌水,室温放置2-5min,12000rpm离心3min,将溶液收集到离心管中,最后将DNA产物保存在-20°C冰箱中备用; 步骤A12:将离心得到的DNA溶液再次加入吸附柱CB3中,室温放置2min,12000rpm离心2min,将溶液再次收集到离心管中; 步骤A13:使用2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的大小和纯度,使用Nanodrop仪器检测提取的总DNA的浓度与纯度,S卩D260,D280及D260/D280的比值。3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤B包括: 步骤B1:从GenBank数据库下载苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽对应的分子标记的序列,或者通过实验室已测得的苜蓿盲蝽和三点苜蓿盲蝽的相关转录组数据筛选相应分子标记的序列; 步骤B2:采用Primer 5.0软件,按照引物设计需要满足的条件进行引物的设计,所述条件包括下列项目中的一种或多种:Tm值的范围、引物序列的最适长度范围、扩增产物预期长度范围、GC含量。4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤C中采用的PCR扩增体系为:总量为25ul,其中模板DNA 2ul,1uM正向引物Iul,1uM反向引物Iul,1mM dNTP mix 0.5ul,5xPCR Buffer 5ul,Taq DNA Polymerase 0.5ul,dd H2O 15ul。5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤D包括: 步骤01:94°(:预变性311^11; 步骤D2:之后进行30-35个循环,每个循环包括:94°C变性Imin,50-59 °C退火Imin,72 V延伸lmin-lmin 30s,末次循环72°C延伸5min,4°C保存。6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤E中采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物及PCR产物纯化,步骤E包括: 步骤EI:取3μ1 PCR扩增产物,加Ιμ?左右上样缓冲液,混合均匀,加样于I X TAE缓冲液配制的2%琼脂糖凝胶孔中,点样后,150V恒压条件下电泳25min; 步骤E2:将含有目的片段的凝胶放入凝胶成像系统中初步观察目的片段的大小,对凝胶进行照相并记录PCR产物电泳图像; 步骤E3:对PCR产物纯化采用2%琼脂糖凝胶检测,核酸染料染色,在凝胶成像仪器中将PCR产物切胶回收,用PCR产物纯化试剂盒进行纯化。
【文档编号】C12Q1/68GK106048063SQ201610662094
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月12日 公开号201610662094.8, CN 106048063 A, CN 106048063A, CN 201610662094, CN-A-106048063, CN106048063 A, CN106048063A, CN201610662094, CN201610662094.8
【发明人】王景顺, 李晓珍, 侯相全, 张花伟, 邢盛伟, 徐会, 王青秀, 尚玲飞, 栗如峰, 王英霞, 李现社
【申请人】安阳工学院
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1