中华鲟环境dna检测pcr扩增引物及其检测方法和应用
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及中华鲟环境DNA检测PCR扩增引物及其检测方法和应用。所述PCR扩增引物ASCB1F序列为：5’?ACAATGCCACCCTTAC?3’，ASCB1R序列为：5’?TGTCTGCGTCTGAGTTT?3’。中华鲟物种的DNA分子标记位点位于中华鲟线粒体CYTB基因，DNA片段长度为138bp，DNA序列如SEQ ID NO.1所示，利用所述PCR扩增引物进行环境DNA扩增，扩增产物与所述DNA分子标记位点位序列进行比对，非引物区100％匹配即为中华鲟物种。本发明利用环境DNA检测实现了对中华鲟物种的鉴定，无需采集鱼体样本，可避免对鱼体的损伤。
【专利说明】
中华轉环境DNA检测PCR扩増引物及其检测方法和应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体设及了中华铸环境DNA检巧UPCR扩增引物及其检测 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 中华铸（Ac ipenser S inens i S )，隶属铸形目（Acipenser if ormes )，铸科 (Acipenseridae)，铸属(Acipenser)，是一种典型的溯河徊游性鱼类，历史上主要分布于我 国的长江干流和长江口的浅海区域，长江上游江段产卵解化的中华铸幼铸降河徊游到长江 口，育肥后进入海洋生长，每年9~11月繁殖期，成熟的中华铸个体溯河而上，到长江上游金 沙江下游江段产卵。自1981年葛洲巧水利枢截流成后，长江中华铸被阻隔在巧下，并在巧下 形成了新的产卵场，自然繁殖规模远小于葛洲巧水利枢纽修建之前，其资源量逐年下降。 2003年=峡大巧蓄水后改变了河道水文学特征，对中华铸繁殖行为造成了进一步影响。 1988年，中华铸被列入我国首次公布的重点保护野生动物名录，并被定为国家一级保护动 物，2010年，中华铸被世界自然保护联盟(IUCN)列为国际极危物种。我国从1983年起全面禁 止对中华铸的商业捕拱，并严格限制科研用鱼，1984年开始实施中华铸人工增殖放流，2009 年起停止了对中华铸亲鱼的科研捕拱，尽管采取了大量保护措施，仍难W挽回中华铸天然 群体持续衰退的趋势。2013年至2015年，连续=年未在长江干流监测到中华铸自然繁殖行 为，如果不及时加强保护，野生中华铸将很可能面临灭绝危机。中华铸群体监测及物种鉴定 对中华铸物种保护具有重要意义，但由于目前中华铸天然群体数量稀少，传统调查方法面 临困难，声学探测在对目标物种的识别率低，误差较大，传统捕拱对中华铸个体产生较大损 伤，目前已全面禁止；同时人工增殖放流是目前中华铸物种保护的重要措施，人工繁殖中中 华铸物种DNA鉴定是确保种质的重要方法，而剪取罐条获得DNA会对中华铸个体造成损伤且 对于较大个体操作困难。
[0003] 环境DNA检测技术为存在采样困难的物种监测提供了新的方法。生物体通过皮肤、 粘液、尿液、粪便、血液、精卵和腐烂的尸体等多种途径将自身的DNA释放到其生存的环境 中，称为环境DNA。任何环境样本中都包含大量的环境DNA，样品处理和测序技术的发展使得 环境DNA检测成为可能，环境DNA所包含的大量信息正逐渐为科学家们所掲示。环境DNA检测 不分离目标个体，直接从环境样本(如上壤、水或空气）中提取的DNA，通过特异性DNA分子标 记检测样本中的特定种属。大型生物环境DNA检测所用的分子标记主要为线粒体DNA标记， 现有线粒体DNA序列数据库已涵盖众多物种，且线粒体DNA序列在物种鉴定中应用广泛，有 利于寻找物种特异性区段和进行序列比对。由于环境DNA检测方法改善了传统调查方法对 标祀生物捕获率低W及人力和时间消耗较大的缺陷，同时具有更高的敏感度和对生物体无 伤害等特点，近年来在国际上得到了广泛关注和快速发展。利用环境DNA进行中华铸物种检 测可免除对中华铸个体的损伤，在野外调查中可降低调查研究对个体及其生境的影响。
[0004] 环境DNA与生物组织DNA的存在方式不同，在不同条件下环境DNA会发生不同程度 的降解，因此用于环境DNA检测的引物须具有扩增片段短、灵敏度高、扩增产物清晰稳定的 特点，同时进行物种鉴定还须在较短DM片段区域具有可与其他物种区分的稳定突变位点， 才可W作为环境DNA物种检测引物。对于中华铸物种鉴定，由于达氏铸与中华铸线粒体DNA 具有99% W上的相似性，要在2(K)bp长度W内的DNA片段鉴别中华铸物种，需要寻找特定的 分子标记位点来实现。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种适用于中华铸环境DNA检 测鉴定中华铸物种的PCR扩增引物及检测方法和应用。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
[0007] -种适用于中华铸环境DNA检测鉴定中华铸物种的PCR扩增引物，其特征在于，上 游引物45〔81尸序列为：5'-4〔4416(^4(：(：(：門4(：-3'，下游引物45〔811?序列为：5'- TGTCTGCGTCTGAGTTT-3'。
[000引上述PCR扩增引物在进行中华铸环境DNA检测鉴定中华铸物种中的应用，用于鉴定 中华铸物种的DNA分子标记位点位于中华铸线粒体CYTB基因，DNA片段长度为138bp，DNA序 列如SEQ ID NO. 1所示，将环境DNA检测结果与所述DNA分子标记位点序列进行比对，非引物 区100%匹配即为中华铸物种。
[0009] 上述PCR扩增引物用于中华铸环境DNA检测鉴定中华铸物种的检测方法，其特征在 于，包括如下步骤：
[0010] (1)采集表层水样，用0.45化微孔滤膜真空抽滤，滤膜于-2(TC保存备用；
[0011] (2)采用DNA提取试剂盒提取滤膜上的DNA;
[001。 （ 3)利用PCR上游引物ASCB1巧日下游引物ASCB1R对步骤(2)提取所得DNA进行PCR扩 增，扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，阳性条带进行DNA片段测序，得到的DNA片段序 列与用于鉴定中华铸物种的DNA分子标记位点序列进行比对，非引物区100%匹配即为中华 铸物种。
[001引上述方案中，所述PCR扩增的40化反应体系包括：上下游引物各0.5iiM，dNTP 0.2mM，2U hq DM聚合酶和祉L模板DM。
[0014] 上述方案中，所述PCR扩增的反应条件为:94°C预变性5min;94°C变性lmin，56°C退 火lmin，72°C延伸1.5min，45个循环；72°C最后延伸7min。
[0015] 本发明的有益效果：（1)本发明提供了一个用于鉴定中华铸物种的特定的DNA分子 标记位点，利用该DNA分子标记位点进行中华铸环境DNA检测可W有效地将中华铸与其他物 种区别开来；（2)本发明提供了一对适用于中华铸环境DNA检测的PCR扩增引物，该PCR扩增 引物具有扩增片段短、灵敏度高、扩增产物清晰稳定等特点；（3)与现有技术相比，本发明所 述检测方法仅从水体中采集水样进行环境DNA检测就可W实现对中华铸物种的鉴定，无需 采集鱼体样本，可避免对鱼体的损伤，且通过DNA序列比对进行物种鉴定的准确度非常高。
【附图说明】
[0016] 图1为采用引物ASCB1扩增中华铸组织DNA的检测电泳图。
[0017] 图2为采用引物ASCB1扩增中华铸人工循环水养殖水样DNA检测的电泳图，第1、2泳 道为空白对照，第3~6泳道为养殖水样DNA检测结果。
【具体实施方式】
[0018]为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的 内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0019]实施例1
[0020] 中华铸环境DNA检测鉴定中华铸物种的检测方法，包括如下步骤：
[0021] (1)用化全新无菌密封广口瓶于待测水体表层采集化水样，用0.45iiL微孔滤膜真 空抽滤，室溫条件下8小时内完成水样抽滤，滤膜于-20°C保存直至DNA提取；
[0022] (2)用Mobio化werwater DNA提取试剂盒提取滤膜DNA;
[0023] (3) W水样DNA为模板，ASCB1F(序列为：5 ' -ACAATGCCACCCTTAC-3'）和ASCB1R(序列 为:5 ' -TGTCTGCGTCTGAGTTT-3 '）为扩增引物，进行PCR扩增，4化LPCR反应体系包括:上下游 引物各〇.5iiM，dNTP 0.2mM，2U Taq DNA聚合酶和祉L模板DNA;PCR反应条件如下：94°C预变 性 5min;94°C 变性 lmin，56°C 退火 lmin，72°C 延伸 1.5min，45 个循环；72°C 最后延伸 7min;
[0024] (4)扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小138bp的为阳性条带，将含有 阳性条带的PCR产物进行产物回收和DNA片段测序，测序得到的DNA片段序列与中华铸DNA分 子标记位点（DNA序列如SEQ ID NO. 1所示)进行比对，非引物区域100 %匹配即为中华铸物 种。
[0025] 实施例2
[0026] 中华铸环境DNA检测近源物种区分：
[0027] (1)利用NCBI在线引物检索软件Primer Blast对扩增引物ASCB1F和ASCB1R进行所 有生物物种的GenBank核酸序列数据库检索。检索结果显示，除中华铸外，扩增引物仅在达 氏铸、达氏避、施氏铸、西伯利亚铸、俄罗斯铸和欧洲避中具有同源序列，其中DNA序列和中 华铸最为相近的为达氏铸，二者在该分子标记核屯、序列有1个不匹配碱基，可辨别中华铸物 种。
[0028] (2)取达氏铸和中华铸各3尾罐条样本，利用高盐法提取组织DNA作为PCR扩增模 板，用ASCB1引物对进行扩增，扩增产物回收测序。比对6个样本测序DNA片段序列，达氏铸和 中华铸具有稳定不匹配碱基，验证了该引物可将二者明确区分，鉴定中华铸物种。
[0029] 实施例3
[0030] 本发明所述PCR扩增引物有效性检测：
[0031] (1)采集人工循环养殖系统中中华铸养殖水体样本并提取环境DNA，平均总DNA浓 度为15ng/iiL，用ASCB1引物对可检测到中华铸环境DNA，将此DNA原液稀释1000倍，再用 ASCB1引物对进行扩增，仍可W得到清晰的目的条带(PCR扩增电泳图如图1所示，其中第1、2 泳道为空白对照，第3~6泳道为养殖水样DNA检测结果）。
[0032] (2)提取中华铸组织DNA，稀释至梯度浓度5 X 1〇-1叫/化、5 X l〇-3ng/iiL和5 X 1〇- Sng/iiL，用ASCB1引物对进行扩增，均可获得目的条带，表明ASCB1在低浓度DNA溶液中仍可 检测到目的DNA(PCR扩增电泳图如图1所示）。
[0033] (3)采集露天半人工池塘中华铸养殖水体样本并提取环境DNA，平均总DNA浓度约 为eOngAiL，其中包含大量微生物及其他水生生物DNA，用ASCB1进行扩增，可获得目的条带， 对目的条带进行测序，核屯、区域与中华铸DNA序列100%匹配，表明ASCB1在混合水生态系统 中可检测并鉴定中华铸物种。
[0034]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可W做出其它不同形式的变化或 变动。运里无需也无法对所有的实施方式予W穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变 动仍处于本发明创造的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种适用于中华舞环境DNA检测鉴定中华舞物种的PCR扩增引物，其特征在于，上游 引物八5〇81?序列为 ：5'-八0八八丁6(^八(：(：(：1^八(：-3'，下游引物八5〇811?序列为：5'-TGTCTGCGTCTGAGTTT-3'。2. 权利要求1所述PCR扩增引物在进行中华舞环境DNA检测鉴定中华舞物种中的应用， 其特征在于，用于鉴定中华舞物种的DNA分子标记位点位于中华舞线粒体CYTB基因，DNA片 段长度为138bp，DNA序列如SEQ ID NO. 1所示，将环境DNA检测结果与所述DNA分子标记位点 序列进行比对，非引物区100%匹配即为中华舞物种。3. 权利要求1所述PCR扩增引物用于中华舞环境DNA检测鉴定中华舞物种的检测方法， 其特征在于，包括如下步骤： (1)采集表层水样，用0.45nL微孔滤膜真空抽滤，滤膜于-20°C保存备用； (2 )采用DNA提取试剂盒提取滤膜上的DNA; (3)利用PCR上游引物ASCB1 F和下游引物ASCB1 R对步骤(2)提取所得DNA进行PCR扩 增，扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，阳性条带进行DNA片段测序，得到的DNA片段序列 与用于鉴定中华舞物种的DNA分子标记位点序列进行比对，非引物区100%匹配即为中华舞 物种。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的40HL反应体系包括:上 下游引物各0.5 yM，dNTP 0.2 mM，2 U Taq DNA聚合酶和8 yL模板DNA。5. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为:94°C预 变性5 min;94°C变性1 min，56°C退火1 min，72°C延伸1.5min，45个循环；72°C最后延 伸7 min〇
【文档编号】C12N15/11GK106048065SQ201610662966
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月12日 公开号201610662966.0, CN 106048065 A, CN 106048065A, CN 201610662966, CN-A-106048065, CN106048065 A, CN106048065A, CN201610662966, CN201610662966.0
【发明人】徐念, 常剑波
【申请人】水利部中国科学院水工程生态研究所