基于线粒体nad5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其应用

基于线粒体nad5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其应用
【专利摘要】本发明涉及基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其应用。基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物，包括上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还涉及基于线粒体NAD5基因序列的DNA条形码的木霉属真菌快速种类鉴定方法。本发明首次发现不同株的木霉属真菌的线粒体NAD5基因序列均不相同，并以该序列为特征片段建立木霉菌的DNA条形码数据库，对木霉属真菌进行分类鉴定，该方法实验周期短，鉴定准确度高，克服了现有方法的局限性，显示了其准确、便捷、快速的优势。
【专利说明】
基于线粒体NADS基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其 应用
技术领域
[0001] 本发明设及基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其应用，特别 设及基于线粒体NAD5基因序列的DNA条形码的木霉属真菌快速种类鉴定引物及鉴定方法， 属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 木霉(Trichoderma SPP.)菌属于半知菌类的丝抱纲，丝抱目，丛梗抱科，广泛存在 于±壤、腐烂的木材及植物残体等基质中。木霉所产生的纤维素酶、半纤维素酶、几下质酶、 蛋白酶等，在食品、卫生、饲料、纺织、造纸等领域广泛应用，是重要工业酶制剂的生产菌。有 些木霉菌能促进植物生长，抑制植物病原真菌，在农业生产上作为重要的植病生防菌使用。
[0003] 种类鉴定往往是生物学研究的第一步，对种类的准确鉴定能够使人们获得研究目 标生物的背景信息，比如生理生化特性、生态学功能、效益与风险等。木霉菌形态多样、种类 繁多、功能各异，准确快速地对其进行分类鉴定，对木霉菌的研究和利用有重要的意义。
[0004] 传统的木霉菌鉴定方法是基于形态学分类研究的基础上，主要根据产抱结构、分 枝方式、抱子形态、颜色、大小、瓶梗的形态、数目和着生方式等形态特征进行分类。此外，从 能分离到木霉菌有性型形态入手，研究其无性型，也是一种有效的鉴定方法。但是由于木霉 菌形态特征的可变性比较强，表现不够稳定，因此利用形态学特征进行鉴定时，出错的可能 性比较大。而且，目前能发现有性型的木霉种类非常少，远不能满足分类鉴定的需求。
[0005] 2002年，Tautz D等在Na化re上首先提出要用DNA序列作为生物分类系统的主要平 台（DNA Taxonomy),随后2003年加拿大动物学家化ul化66刊首次提出DNA条形码（DNA Barcoding)的概念。DNA条形码是指利用一段标准DNA序列作为标记来实现快速、准确和大 批量的物种识别和鉴定。目前在木霉菌上使用的DNA条形码序列主要有内转录间隔区序列 (ITS)、转录延伸因子la亚基序列（tefl)等，上述DNA条形码系统为快速准确的鉴定木霉菌 提供了有力的工具。
[0006] 然而，现有木霉菌DNA条形码系统仍存在一些不足。例如，ITS条形码系统的区分能 力有限，对于近源种往往无法进行明确的区分;tefl条形码系统含有=个系统发生标记，即 第4、5内含子和第6外显子，由于对哪个发生标记作为鉴定标准的意见不统一，因此该条形 码系统鉴定结果的准确性值得商権。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的是提供基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物及其 应用。与现有方法中的ITS、ten序列相比，线粒体NAD5基因进化速率较快，即使近缘物种区 分度也很好;密码子保守性高、引物通用性强，目的片段更短更易扩增;约7(K)bp的序列长度 不需要双向测序，分类鉴定成本更低。
[000引本发明技术方案如下：
[0009] 基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物，包括上游引物核巧酸序列 如SEQID NO. 1所示，下游引物核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体序列如下：
[0010] SEQ ID N0.1 (上游引物）：5'-AATCATGCTTTCTATAAAGGA-3'
[0011] 沈Q ID N0.2(下游引物）：5'-GAATTCAACTAAGAAACGTTG-3'
[0012] 一种基于线粒体NAD5基因序列的DNA条形码的木霉属真菌快速种类鉴定方法，步 骤如下：
[OOU] (1)提取待鉴定的木霉属真菌样品的DM，制得基因组DNA;
[0014] (2) W步骤（1)制得的基因组DNA为模板，利用上述基于线粒体NAD5基因序列的木 霉属真菌种类鉴定引物进行PCR扩增，纯化，制得PCR扩增产物；
[0015] (3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行测序，将测序结果与已建立的木霉属真菌 NAD5条形码数据库进行比对，基于Kimura-2-paramete;r概率的遗传距离法或基于聚类分析 的系统发育树法进行物种鉴定，获得多个序列间的相似性，相似度最高或遗传距离最小的 对应种类即为待鉴别真菌的物种。
[0016] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中提取待鉴定的木霉属真菌样品的DNA采用酪/ 氯仿抽提法。酪/氯仿抽提法为本领域常规的真核生物DNA提取方法，参见《分子克隆实验指 南》。
[0017]根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下，总体系为50化： 2x时U阳R Red Mix 2目如， 正向引物10|uM 1曲.
[001引反向引物lOfoM 1冲， DNA 模板 15 ng/VL 2沾， 山化0 补足至日邸L 6
[0019]根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增的反应条件为：
[0020] 94°C 预变性 3min;94°C 变性 30s，42°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin，35 个循环;72°C 延伸 10min〇
[0021] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中的纯化为采用质量百分比为1.5%的琼脂糖凝 胶电泳后，利用纯化试剂盒回收纯化。
[0022] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中已建立的木霉属真菌DNA条形码数据库为采用 已经准确分类鉴定的木霉属真菌，按照上述步骤（1)获得基因组DNA，然后按照上述步骤(2) 获得PCR扩增产物，再经步骤(3)测序后，建立由含有已知木霉属真菌对应的PCR扩增产物序 列组成的木霉属真菌DNA条形码数据库。
[0023] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，基于Kimura-2-paramete;r概率的遗传距离法 进行物种鉴定的步骤如下：
[0024] 将PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中的 其它木霉菌DNA条形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件计算PCR扩增产物的测序结果的序 列与其它木霉菌的Kimura-2-paramete;r遗传距离，计算种内、种间变异值，当待鉴定菌株与 数据库中的基因片段比对后，得到多个序列间最小变异值即种间最小变异值，当最小变异 值等于或小于某物种的种内最大变异值，视为与其同一物种；
[0025] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，基于聚类分析的系统发育树法进行物种鉴定 的步骤如下：
[0026] 将PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中的 其它木霉菌DNA条形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件构建^、1^16、^614系统发育树， 检验PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中序列聚类 在一起的物种，若待鉴定菌株与数据库中的物种构成单支系，则待鉴定的木霉属真菌样品 鉴定为该物种。
[0027] 有益效果
[0028] 本发明首次发现不同株的木霉属真菌的线粒体NAD5基因序列均不相同，并W该序 列为特征片段建立木霉菌的DNA条形码数据库，对木霉属真菌该特征片段进行扩增、测序， 然后将待鉴定的木霉属真菌样品的序列与DNA条形码数据库进行比对，根据比对结果对木 霉菌进行分类鉴定，该方法实验周期短，鉴定准确度高，克服了现有方法的局限性，显示了 其准确、便捷、快速的优势。
【附图说明】
[0029] 图1所示为部分木霉菌株的NAD5基因 PCR扩增产物的电泳检测结果照片；
[0030] 图中：Marke;r:DL2000;l:T.guizhouenseSTSF1.0243;2:T.velutinum STSF1.0246；3：T.citrinoviride STSF1.0066；4：T.gamsii KUC1747；5：SPl；
[0031 ]图2所示为NAD5序列系统发育树并分析亲缘关系图。
【具体实施方式】：
[0032] 下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，可W用于W下典型实 验方案达到
【发明内容】
的目的，本发明的保护范围并不限于此，凡依照本发明公开序列和引 物进行的PCR所做的修改、优化的实施内容，均属于本发明的保护范围。
[0033] 实施例1
[0034] 木霉菌属DNA条形码即NAD5基因序列片段数据库的建立，步骤如下：
[0035] (1)收集不同的木霉菌株，根据菌株的形态特征，然后提取其基因组DNA，结合它们 的ten条形码序列，对菌株进行准确种类鉴定。供试木霉菌株详细信息见表1。
[0036] 表1 [00371
r0038l
[0039] (2)将表1中所列菌株的纯培养接种于PDA平板，于25°C培养7d后，收集菌丝，采用 酪/氯仿抽提法提取木霉菌株的基因组DNA。
[0040] (3似步骤(2)制得的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增上游引物核巧酸序 列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体序列如下：
[0041 ]沈Q ID N0.1:5'-AATCATGCTTTCTATAAAGGA-3'
[0042] 沈Q ID N0.1:5'-GAATTCAACTAAGAAACGTTG-3'
[0043] PCR反应体系如下，总体系为50iiL 2xP化 PCR Red Mix 茲juL， 正向引物10.uM 1如.，
[0044] 反向引物lOfJI ]叫" DNA 模板 1 日ng/VL 2|uL，： d册2〇 补足至50叫
[0045] PCR扩增的反应条件为：
[0046] 94°C 预变性 3min;94°C 变性 30s，42°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin，35 个循环;72°C 延伸 10min〇
[0047] 然后经质量百分比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳后(部分电泳结果见图1)，利用纯化 试剂盒回收纯化，制得PCR扩增产物，产物保存于-20°C或直接送上海生工进行测序，测序引 物与PCR扩增的引物一致。
[004引（4)将测序得到的序列与GenBank数据库中已发表的木霉菌NAD5基因片段序列合 并，建立木霉菌属NAD5基因片段的数据库。所述数据库包括下述序列编号所示的NAD5基因 片段序列：SEQ ID N0.3-SEQ ID齡.39。数据库中的酷05基因片段序列用程序(：1113*曰1胖进 行比对，利用程序加 locksO. 9化优化比对的保守区域，然后利用MEGA5.1软件计算出木霉菌 属的种内最大变异值为0.008。
[0049] 实施例2:木霉菌属未知种类菌株的鉴定
[0050] 1、选未经鉴定的木霉菌株SP1，分别用传统分类方法和本发明中所用的方法进行 鉴定。
[0化1] 2、采用实施例1中所述步骤提取木霉菌株的基因组DNA，WSEQ ID N0.1和SEQ ID NO.2作为引物扩增NAD5基因片段，条件同实施例1所述，经PCR产物检测、测序，然后通过下 述方法进行菌株鉴定。
[0052] 3、未经鉴定的木霉菌株SP1的鉴定:将测序结果(SEQ ID NO.40)与其它木霉属真 菌的NAD5条形码数据库进行比对，基于Kimura-2-paramete;r概率的遗传距离法和基于聚类 分析的系统发育树法设立鉴定规则来进行鉴定，获得多个序列间的相似性，相似度最高或 遗传距离最小的对应种类即为待鉴别真菌的物种，具体方法如下：
[0053] a.基于Kimura-2-paramete;r概率的遗传距离法进行物种鉴定
[0054] 将未经鉴定的木霉菌株SP1的NAD5基因片段序列与数据库中的其它木霉菌DNA条 形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件计算未经鉴定的木霉菌株SP1的DNA条形码序列与其 他木霉菌的Kimura-2-paramete;r遗传距离，计算种内、种间变异值，当待鉴定菌株与数据库 中的基因片段比对后，得到多个序列间最小变异值即种间最小变异值，当运些值等于或小 于某物种的种内最大变异值，视为与其同一物种;该物种与T.asperellum的遗传距离最小， 与其两个菌株STSF1.0222和B05的遗传距离分别为0.003和0，初步鉴定为T. asperell皿。
[0055] b.基于聚类分析的系统发育树法进行物种鉴定
[0056] 将未经鉴定的木霉菌株SP1的NAD5基因片段序列与数据库中的其它木霉菌DNA条 形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件构建NJ、ML、ME、UPGMA系统发育树，检验未经鉴定的木 霉菌株SP1的DNA条形码序列与数据库中T.asperellum的两个菌株STSF1.0222和B05菌序列 聚类在一起，且构成单支系，如图2所示，鉴定为T. asperel 1皿。
[0057]经本方法鉴定后的结论，与传统分类鉴定方法得到的结果一致，但本方法比传统 方法更加简便、快速。
【主权项】
1. 基于线粒体NAD5基因序列的木霉属真菌种类鉴定引物，包括上游引物核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. -种基于线粒体NAD5基因序列的DNA条形码的木霉属真菌快速种类鉴定方法，其特 征在于，步骤如下： (1) 提取待鉴定的木霉属真菌样品的DNA，制得基因组DNA; (2) 以步骤（1)制得的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述基于线粒体NAD5基因序列 的木霉属真菌种类鉴定引物进行PCR扩增，纯化，制得PCR扩增产物； (3) 对步骤（2)制得的PCR扩增产物进行测序，将测序结果与已建立的木霉属真菌NAD5 条形码数据库进行比对，基于Kimura-2-parameter概率的遗传距离法或基于聚类分析的系 统发育树法进行物种鉴定，获得多个序列间的相似性，相似度最高或遗传距离最小的对应 种类即为待鉴别真菌的物种。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中提取待鉴定的木霉属真菌样 品的DNA采用酚/氯仿抽提法。4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR反应体系如下，总体系为 50UL： 2xPfti PCR Rad Mix 25fxL, 正向引物1%M l|uL， 反向引物l^L, DNA 模板 1.5ng/pL 2^iL, ddHn0 补足至 50pL。5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增的反应条件为： 94°C 预变性 3min;94°C 变性 3〇8,42°(：退火3〇8,72°(：延伸1111111，35个循环；72°(：延伸 10min〇6. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的纯化为采用质量百分比为 1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，利用纯化试剂盒回收纯化。7. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中已建立的木霉属真菌DNA条形 码数据库为采用已经准确分类鉴定的木霉属真菌，按照上述步骤（1)获得基因组DNA，然后 按照上述步骤(2)获得PCR扩增产物，再经步骤(3)测序后，建立由含有已知木霉属真菌对应 的PCR扩增产物序列组成的木霉属真菌DNA条形码数据库。8. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，基于Kimura-2-parameter概 率的遗传距离法进行物种鉴定的步骤如下： 将PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中的其它 木霉菌DNA条形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件计算PCR扩增产物的测序结果的序列与 其它木霉菌的Kimura-2-parameter遗传距离，计算种内、种间变异值，当待鉴定菌株与数据 库中的基因片段比对后，得到多个序列间最小变异值即种间最小变异值，当最小变异值等 于或小于某物种的种内最大变异值，视为与其同一物种。9. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，基于聚类分析的系统发育树 法进行物种鉴定的步骤如下： 将PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中的其它 木霉菌DNA条形码序列进行比对，利用MEGA5.1软件构建町、1^、腿、1^61^系统发育树，检验 PCR扩增产物的测序结果的序列与已建立的木霉属真菌NAD5条形码数据库中序列聚类在一 起的物种，若待鉴定菌株与数据库中的物种构成单支系，则待鉴定的木霉属真菌样品鉴定 为该物种。
【文档编号】C12Q1/68GK106048071SQ201610676912
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月16日
【发明人】张新建, 周红姿, 张广志, 吴晓青, 赵晓燕, 谢雪迎, 周方园, 李天元
【申请人】山东省科学院生态研究所