一种枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的区分方法
【专利摘要】一种枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的区分方法，它涉及一种相近芽孢杆菌的区分方法。方法：一、获取待鉴定芽孢杆菌CheA基因；二、与已知枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌模式菌株的CheA基因进行同源性比较，同源性低于80％的为异种芽孢杆菌。本发明方法通过CheA基因区分枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌，方法简单、准确。
【专利说明】
-种枯草芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌的区分方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种相近芽抱杆菌的区分方法。
【背景技术】
[0002] 1970年Colwell提出的多相分类(Polyphasic taxonomy)方法是区分微生物领域 各级分类单元的最有效的手段，也更客观反应生物间自然系统进化关系的分类方法。该分 类方法数据和信息有3种类型类:分别是表型、基因型和系统发育型。表型信息包括:培养形 态、生理生化指标、细胞壁化学组成和憐酸类脂、酿、全细胞脂肪酸等细胞化学的分析，还有 全细胞可溶性蛋白电泳及核糖体蛋白图谱共8类;基因型信息来自于对细胞核酸分子的分 析，GC含量测定、核酸杂交、限制性片段长度多态性、随机扩增DNA片段多态性的分析等;而 系统发育信息责是采用一些特定的基因片段作作为分析对象，运些基因就是系统发育标记 (Phylogenetic Markers)。用编码蛋白质基因作为系统发育基因越来越得到行业内的认 同，系统发育标记是表示遗传关系的标识，应用不同的标记再结合其它分类信息可W将细 菌的遗传关系及分类单元确定到种、属、科等不同的等级。
[0003] 芽抱杆菌(Bacillus. SP)是革兰氏阳性菌的一种，因为芽抱杆菌属的菌株具有易 于培养和储存的诸多优点，比其他微生物菌种更适用于生物防治领域研究。特别是枯草芽 抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌已经被证明可产生促进植物生长作用的赤霉素和吗I噪乙酸，胞外 植酸酶物质，几下质酶和抗真菌多肤，应用于农作物可显著提高作物产量。
[0004] 枯草芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌属于形态特征相似的芽抱杆菌属，具有很近的亲 缘关系，致使很早W前人们将解淀粉芽抱杆菌称为枯草芽抱杆菌的亚种，在1967年Welker 等人研究，确定解淀粉芽抱杆菌是独立的有效物种之一。正是因为枯草芽抱杆菌与解淀粉 芽抱杆菌为近缘菌种，仅仅通过生理生化反应和leSrRNA技术，甚至包括应用梅里埃的API 菌种鉴定条都不能有效区分，因此传统的菌株分类方法受到了挑战，急需更具分辨力的技 术来进行枯草芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌的分类鉴定工作。
【发明内容】
[0005] 本发明为了解决现有菌株分类方法难W分辨枯草芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌的 问题，而提供的一种枯草芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌的区分方法。
[0006] 本发明枯草芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌的区分方法按W下步骤进行：
[0007] 一、获取待鉴定芽抱杆菌化eA基因；
[000引二、与已知枯草芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌模式菌株的畑eA基因进行同源性比 较，同源性低于80%的为异种芽抱杆菌。
[0009] 本发明方法通过化eA基因区分枯草芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌，方法简单、准确。
[0010] 化eA基因广泛存在于芽抱杆菌体内，并W单拷贝的形式存在于芽抱杆菌活体内。 化eA基因具备一定的长度，而且被精确测序。
[0011] 本发明W化eA基因为系统发育基因标识，具有非常优良的辨识度，能够准确的区 分枯草芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌。
【附图说明】
[0012]图1是实施例1模式菌株比对点阵分析图。
[OOK]图視实施例1模式菌株比对结果图。
[0014] 图3是根据Bacillus subtilis subsp.subtilis 8化.168的QieA基因构建的系统 发育树。
[0015] 图4是根据Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum st;r.FZB42的QieA基 因构建的系统发育树。
【具体实施方式】
[0016] 本发明技术方案不局限于W下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0017] 一:本实施方式枯草芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌的区分方法按W下 步骤进行：
[0018] 一、获取待鉴定芽抱杆菌化eA基因；
[0019] 二、与已知枯草芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌模式菌株的畑eA基因进行同源性比 较，同源性低于80%的为异种芽抱杆菌。
【具体实施方式】 [0020] 二：本实施方式与一的不同点是：步骤二中选 Bacillus subtilis subsp.subtilis str. 168作为已知枯草芽胞杆菌的模式菌株；选 Bacillus amyloliquefaciens subsp.plan1:a;rum st;r.FZB42作为已知解淀粉芽抱杆菌的 模式菌株。其它步骤及参数与实施方式一相同。
[0021] Bacillus subtilis subsp.subtilis 8化.168全基因组登陆号为GI:728882887; Bacillus amyloliquefaciens subsp .plantarum str.FZB42，全基因组登录号为GI: 154350369。
[0022] 实施例1
[002；3]本实施例采用BLASTN 2.2.30 +比对模式菌株（Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168和Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42) 基因组的16SrRNA、Gyr A、GyrB、CheA和GroEL基因之间的同源性。
[0024] 本实施模式菌株比对点阵分析(Dot Matrix View)图如图1所示。模式菌株基因之 间同源性测试结果如表1所示。模式菌株比对分析结果如图2所示。
[0025] 表 1 rm,"
[0027]图 1 和图2显示Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168与Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42之间有区别，80%的核酸具同源性，另外 20%的序列在两种菌株中存在明显差异，进一步证明枯草芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌应分 属不同的种。
[0028] 经过比对枯草芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌两个模式菌株的五条基因（leSrRNA、 GyrA、GyrB、CheA和GroEL)中CheA基因的同源性最低为77%，适合用于区别、鉴定枯草芽抱 杆菌与解淀粉芽抱杆菌。而枯草芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌的leSrRNA同源性最高达到 99%，无法对两种菌加 W区分。
[0029] 实施例2
[0030] W美国国立生物技术信息中屯、网站GenBanK数据库中存储的枯草芽抱杆菌与解淀 粉芽抱杆菌菌株为对照菌株进行验证。
[0031 ]采用I3LASTN2.2.30+在线软件分别比较Bacillussubtilissubsp.subtilis 8化.168与GenBank数据库中Bacillus amyloliquefaciens基因的同源性，W及Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42与GenBank数据库中Bacillus subtilis 的同源性。比对基因为5个，16SrRNA、Gyr A、GyrB、CheA和GroEL。
[0032] 比对结果：
[0033] l、Bacillus subtilis subsp.subtilis s1:;r. 168与GenBank数据库中Bacillus amyloliquefaciens的 16sRNA序列同源性均在99% W上。Bacillus amyloliquefaciens subsp. plan1:a;rum str.FZB42与GenBank数据库中Baci 1 lus subti 1 is的 16sRNA序列同源性 均在99% W上。
[0034] 2、Bacillus subtilis subsp.subtilis s1:;r. 168与GenBank数据库中Bacillus amyloliquefaciens的GyrA基因序列同源性在81 %~87%，GyrB基因同源性在79%~82%， Gro化基因同源性在93 %~98 %，CheA基因同源性在68 %~77 %。
[0035] 除了Bacillus subtilis strain Bs-916、Baci 1 lus subtilis strain ATCC 19217、Bacillus subtilis strain B-1 和Bacillus subtilis strain ATCC 13952之外， Bacillus amyloliquefaciens FZB42与GenBank数据库中Bacillus subtilis的GyrA基因 序列同源性在81%~83%，GyrB基因同源性在78%~82%，Gro化基因同源性在92%~ 99%，畑eA基因同源性在70%~77% oBacillus amyloliquefaciens FZB42与Bacillus subtilis strain Bs-916、Bacillus subtilis strain ATCC 19217和Bacillus subtilis strain B-1 的GyrA、GyrB、CheA和GroEL基因序列同源性均达到99% ;Bacillus amyloliquefaciens FZB42与Bacillus subtilis strain ATCC 13952的GyrA、GyrB、CheA 和GroEL基因序列同源性达到了95%~96%。分析认为Bacillus subtilis strain Bs- 916、Bacillus subtilis strain ATCC 19217、Bacillus subtilis strain B-1和 Bacillus subtilis strain ATCC 13952菌种分类有误，运也说明原有枯草芽抱杆菌与解 淀粉芽抱杆菌区分和分类不准确。
[0036] 经过实施例1和2的比对获知枯草芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌的leSrRNA基因不能 用于区分两种芽抱杆菌，而两种芽抱杆菌的Gro化基因同源性也相对较高，因此leSrRNA基 因和Gro化基因都无法对枯草芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌做出区分。两种芽抱杆菌的GyrA 和Gy巧基因同源性虽然在78%~82%左右，但是考虑两种模式菌株基因组同源性为80%， 并不适合作为枯草芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌的区别。
[0037] 两种芽抱杆菌的化eA基因同源性低，能够准确的加 W区分。分别根据枯草芽抱杆 菌化eA基因和解淀粉芽抱杆菌化eA基因构建系统发育树，结果如图3和图4所示。上述结果 显示，用Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 和 Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42的CheA基因在不限定物种的前提下进行BLAST分析比对分析 并绘制系统发育树，NCBI数据库中枯草芽抱杆菌168的化eA基因相似性均达到92% W上，尤 其是完成基因组测序的枯草芽抱杆菌相似性可达到95%，多数菌株相似性为100%，与解淀 粉芽抱杆菌最高相似性为76%，最低为70%。解淀粉芽抱杆菌FZB42的化eA基因与数据库中 解淀粉芽抱杆菌相似性均达到95 % W上，与枯草芽抱杆菌相似性为71 %~78 %。两种模式 菌株的系统发育树也可W看到，分别W两条化eA基因分别构建系统发育树，解淀粉芽抱杆 菌和枯草芽抱杆菌分属于不同分支，且芽抱杆菌属内的短小芽抱杆菌（Bacillus pumilis)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)、莫哈韦芽抱杆菌（Baci 1 lus mo javensis)、萎缩芽抱杆菌（Bacillus atrophaeus)、凝结芽抱杆菌（Bacillus coagulans)和巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)均处于独立分支范围，可见QieA基因 在芽抱杆菌属内具有非常高的辨识度。通过W上结果可W证明应用化eA基因完全能够区分 枯草芽抱杆菌和解淀粉芽抱杆菌。
【主权项】
1. 一种枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的区分方法，其特征在于该方法按以下步骤进 行： 一、 获取待鉴定芽孢杆菌CheA基因； 二、 与已知枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌模式菌株的CheA基因进行同源性比较，同 源性低于80%的为异种芽孢杆菌。2. 根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌的区分方法，其特征在 于步骤二中选Bacillus subtilis subsp.subtilis str. 168作为已知枯草芽胞杆菌的模 式菌株；选Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum str.FZB42作为已知解淀粉芽 孢杆菌的模式菌株。
【文档编号】C12Q1/68GK106048072SQ201610685753
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月18日
【发明人】赵晓宇, 王佳龙, 于冲, 沙长青, 孟利强
【申请人】黑龙江省科学院微生物研究所