用于检测4种眼科感染病毒的lamp引物组合及应用

文档序号:10680073阅读:401来源:国知局
用于检测4种眼科感染病毒的lamp引物组合及应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测4种眼科感染病毒的LAMP引物组合及应用。本发明的引物组合,由序列1至24所示的24条单链DNA分子组成。本发明还保护所述引物组合的应用。本发明还保护一种鉴别待测病毒为单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘?带状疱疹病毒或巨细胞病毒的方法、一种鉴定待测病毒是否为单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒II型或水痘?带状疱疹病毒或巨细胞病毒的方法、一种鉴定待测样本是否感染了单纯疱疹病毒I型和/或单纯疱疹病毒II型和/或水痘?带状疱疹病毒和/或巨细胞病毒的方法。应用本发明的LAMP引物及方法,可快速、准确的检测出单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘?带状疱疹病毒和巨细胞病毒。
【专利说明】
用于检测4种眼科感染病毒的LAMP引物组合及应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种用于检测4种眼科感染病毒的LAMP引物组合及应用。
【背景技术】
[0002] 单纯瘤疹病毒化e巧es simplex virus,服V)是引起病毒性瘤疹的病原体,根据抗 原性的差别目前把该病毒分为单纯瘤疹病毒I型和单纯瘤疹病毒II型。I型首要引起生殖器 W外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染。n型首要引起生殖器部位皮肤粘膜感染。 健康人群中约有50% W上为本病毒的携带者。HSV在人体内不产生经久免疫力,每当机体相 称力降值时,如发热、胃肠功效素乱、月经、妊娠、病灶感染和动机变卦时,体内隐匿的HSV被 激活而发病,影响人类健康。单纯瘤疹性病毒引起的角膜感染称为单纯瘤疹病毒性角膜炎 化SK),它是当今世界上危害严重的感染性眼病之一,发病率占角膜病首位。在我国服K致盲 占角膜盲的42.8%,居首位。HSK发病率高,难治愈,易复发,严重影响患者的视功能,已成为 国内外眼科界极为关注的热点问题之一。
[0003] 巨细胞病毒(切tomegalovirus,CMV)亦称细胞包涵体病毒,在人群中感染非常广 泛,中国成人感染率达95% W上,通常呈隐性感染,多数感染者无临床症状,但在一定条件 下侵袭多个器官和系统可产生严重疾病。病毒可侵入肺、肝、肾、唾液腺、乳腺其他腺体,W 及多核白细胞和淋己细胞,可长期或间隙地自唾液、乳汗血液、尿液、精液、子宫分泌物多处 排出病毒。通常口腔,生殖道,胎盘,输血或器官移植等多途径传播,具有潜在致癌的可能 性。CMV视网膜炎是CMV感染的主要表现之一,CMV视网膜炎患者会出现视网膜水肿、视网膜 血管异常(血管闭塞)、视网膜脱离、脉络膜视网膜炎等症状及并发症,若不治疗,将缓慢而 不可逆地发展,留下擁痕盲点,视网膜萎缩。CMV还可引起视神经病变,使视力迅速减退。
[0004] 水痘-带状瘤疹病毒(varicella-zoster vi;rus,VZV),在儿童初次感染引起水痘, 恢复后病毒潜伏在体内,少数病人在成人后病毒再发而引起带状瘤疹,故被称为水痘-带状 瘤疹病毒。人是水痘-带状瘤疹病毒的惟一自然宿主,皮肤上皮细胞是主要祀细胞。水瘤皮 疹内含大量病毒,水痘消失后不遗留癒痕,病情一般较轻,但偶有并发间质性肺炎和感染后 脑炎者。细胞免疫缺陷、白血病、肾脏病或长期使用皮质激素、抗代谢药物的儿童患水痘表 现为重症,甚至危及生命。成人患水痘时,20 % -30 %并发肺炎,一般病情重,病死率亦高。孕 妇患水痘的表现亦较严重,并可引起胎儿崎形、流产或死产。水痘-带状瘤疹病毒感染可引 起带状瘤疹眼炎。水痘-带状瘤疹病毒除可引起传统的带状瘤疹眼炎外,还有两种临床形 式:一为急性视网膜坏死综合征,表现为双侧性视网膜周边广泛的灰白色混浊的视网膜坏 死,常有眼痛,伴有角膜炎或虹膜睫状体炎;另一为进展性外层视网膜坏死综合征,其玻璃 体或前节炎症反应不明显,但病程早期可有黄斑中屯、凹损害。
[0005] 目前临床针对病毒的检测方法主要是分离培养和血清学诊断。运些检测方法繁 琐,检测时间长,灵敏度低,容易发生漏检和错检,无法满足快速检测的要求。近几年发展起 来的分子检测技术,特别是PCR技术,在微生物快速鉴定和检测方面的应用,为病毒的快速 检测开辟了新的途径。但是,PCR存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点,使其应用受 到限制。环介导等溫扩增技术(loop-mediated isothermal amp 1 if i cat ion, LAMP)是近年 来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术,其原理是在一种具有链置换活性 的DNA聚合酶的作用下,识另化-8个区域的4-6条引物,在等溫条件下快速、特异地扩增目的 基因,可推广应用于快速、准确的检测病毒。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供一种用于检测4种眼科感染病毒的LAMP引物组合及应用。
[0007] 本发明提供一种引物组合,由引物组I、引物组II、引物组HI和引物组IV组成;
[000引所述引物组I由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1、引物BIP-1、引物LB-1和引物LF-1 组成;
[0009] 所述引物F3-1为如下(al)或(a2):
[0010] (al)序列表的序列1所示的单链DNA分子;
[0011] (a2)将序列1经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有 相同功能的DNA分子;
[001^ 所述引物B3-1为如下(日3)或(曰4):
[001引(日3)序列表的序列2所示的单链DNA分子;
[0014] (a4)将序列2经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有 相同功能的DNA分子;
[001引所述引物FIP-1为如下(日5)或(曰6):
[0016] (曰5)序列表的序列3所示的单链DNA分子;
[0017] (a6)将序列3经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有 相同功能的DNA分子;
[001引所述引物BIP-1为如下(曰7)或(曰8):
[0019](日7)序列表的序列4所示的单链DNA分子;
[0020] (a8)将序列4经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有 相同功能的DNA分子;
[0021] 所述引物LB-1为如下(a9)或(alO):
[0022] (a9)序列表的序列5所示的单链DM分子;
[0023] (alO)将序列5经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有 相同功能的DNA分子;
[0024] 所述引物LF-1为如下(all)或(al2):
[0025] (all)序列表的序列6所示的单链DM分子;
[0026] (al2)将序列6经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有 相同功能的DNA分子;
[0027] 所述引物组II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物LB-2和引物LF- 2组成;
[0028] 所述引物F3-2为如下(bl)或化2):
[0029] (bl)序列表的序列7所示的单链DNA分子;
[0030] (b2)将序列7经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有 相同功能的DM分子;
[0031] 所述引物B3-2为如下(b3)或(b4):
[0032] (b3)序列表的序列8所示的单链DM分子;
[0033] (b4)将序列8经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有 相同功能的DNA分子;
[0034] 所述引物FIP-2为如下化5)或化6):
[0035] 化5)序列表的序列9所示的单链DNA分子;
[0036] (b6)将序列9经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有 相同功能的DNA分子;
[0037] 所述引物BIP-2为如下化7)或化8):
[003引化7)序列表的序列10所示的单链DNA分子;
[0039] (b8)将序列10经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具 有相同功能的DNA分子;
[0040] 所述引物LB-2为如下化9)或(bio):
[0041 ] 化9)序列表的序列11所示的单链DNA分子;
[0042] (blO)将序列11经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具 有相同功能的DNA分子;
[0043] 所述引物LF-3为如下(bll)或(bl2):
[0044] (bll)序列表的序列12所示的单链DM分子;
[0045] (bl2)将序列12经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具 有相同功能的DNA分子;
[0046] 所述引物组III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-2、引物BIP-3、引物LB-3和引物 LF-3组成;
[0047] 所述引物F3-3为如下(cl)或(c2):
[004引 (cl)序列表的序列13所示的单链DNA分子;
[0049] (c2)将序列13经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具 有相同功能的DNA分子;
[0050] 所述引物B3-3为如下(c3)或(c4):
[0051 ] (c3)序列表的序列14所示的单链DM分子;
[0052] (c4)将序列14经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具 有相同功能的DNA分子;
[0053] 所述引物FIP-2为如下(c5)或(c6):
[0054] (c5)序列表的序列15所示的单链DNA分子;
[0055] (c6)将序列15经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具 有相同功能的DNA分子;
[0056] 所述引物BIP-3为如下(c7)或(c8):
[0057] (c7)序列表的序列16所示的单链DNA分子;
[005引(c8)将序列16经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具 有相同功能的DNA分子;
[0059] 所述引物LB-3为如下(c9)或(clO):
[0060] (c9)序列表的序列17所示的单链DM分子;
[0061] (clO)将序列17经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具 有相同功能的DNA分子;
[0062] 所述引物LF-3为如下(cll)或(cl2):
[0063] (cll)序列表的序列18所示的单链DM分子;
[0064] (cl2)将序列18经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具 有相同功能的DNA分子。
[0065] 所述引物组IV由引物F3-4、引物B3-4、引物FIP-4、引物BIP-4、引物LB-4和引物LF- 4组成;
[0066] 所述引物F3-4为如下(dl)或(d2):
[0067] (dl)序列表的序列19所示的单链DM分子;
[0068] (d2)将序列19经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具 有相同功能的DNA分子;
[0069] 所述引物B3-4为如下(d3)或(d4):
[0070] (d3)序列表的序列20所示的单链DM分子;
[0071] (d4)将序列20经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具 有相同功能的DNA分子;
[0072] 所述引物FIP-4为如下(d5)或(d6):
[0073] (d5)序列表的序列21所示的单链DNA分子;
[0074] (d6)将序列21经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具 有相同功能的DNA分子;
[0075] 所述引物BIP-4为如下(d7)或(d8):
[0076] (d7)序列表的序列22所示的单链DNA分子;
[0077] (d8)将序列22经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具 有相同功能的DNA分子;
[007引所述引物LB-4为如下(d9)或(dlO):
[0079] (d9)序列表的序列23所示的单链DNA分子;
[0080] (dlO)将序列23经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具 有相同功能的DNA分子;
[0081 ] 所述引物LF-4为如下(dll)或(dl2):
[0082] (dll)序列表的序列24所示的单链DM分子;
[0083] (dl2)将序列24经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具 有相同功能的DNA分子。
[0084] 所述引物组合的用途为如下(el)至(e6)中的任意一种:
[0085] (el)鉴别单纯瘤疹病毒I型、单纯瘤疹病毒II型、水痘-带状瘤疹病毒和巨细胞病 毒;
[0086] (e2)制备用于鉴别单纯瘤疹病毒I型、单纯瘤疹病毒II型、水痘-带状瘤疹病毒和 巨细胞病毒的试剂盒;
[0087] (e3)鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒I型或单纯瘤疹病毒II型或水痘-带状瘤 疹病毒或巨细胞病毒;
[0088] (e4)制备用于鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒I型或单纯瘤疹病毒II型或水 痘-带状瘤疹病毒或巨细胞病毒的试剂盒;
[0089] (e5)鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒I型和/或单纯瘤疹病毒II型和/或水 痘-带状瘤疹病毒和/或巨细胞病毒;
[0090] (e6)制备用于鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒I型和/或单纯瘤疹病毒II 型和/或水痘-带状瘤疹病毒和/或巨细胞病毒的试剂盒。
[0091] 本发明还保护所述引物组合的应用,为如下(el)至(e6)中的任意一种:
[0092] (el)鉴别单纯瘤疹病毒I型、单纯瘤疹病毒II型、水痘-带状瘤疹病毒和巨细胞病 毒;
[0093] (e2)制备用于鉴别单纯瘤疹病毒I型、单纯瘤疹病毒II型、水痘-带状瘤疹病毒和 巨细胞病毒的试剂盒;
[0094] (e3)鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒I型或单纯瘤疹病毒II型或水痘-带状瘤 疹病毒或巨细胞病毒;
[0095] (e4)制备用于鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒I型或单纯瘤疹病毒II型或水 痘-带状瘤疹病毒或巨细胞病毒的试剂盒;
[0096] (e5)鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒I型和/或单纯瘤疹病毒II型和/或水 痘-带状瘤疹病毒和/或巨细胞病毒;
[0097] (e6)制备用于鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒I型和/或单纯瘤疹病毒II 型和/或水痘-带状瘤疹病毒和/或巨细胞病毒的试剂盒。
[0098] 本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒;所述试剂盒的用途为如下(fl)或(f2) 或的):
[0099] (fl)鉴别单纯瘤疹病毒I型、单纯瘤疹病毒II型、水痘-带状瘤疹病毒和巨细胞病 毒;
[0100] (f2)鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒I型或单纯瘤疹病毒II型或水痘-带状瘤 疹病毒或巨细胞病毒;
[0101] (f3)鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒I型和/或单纯瘤疹病毒II型和/或水 痘-带状瘤疹病毒和/或巨细胞病毒。
[0102] 本发明还保护所述试剂盒的制备方法,包括将各条引物单独包装的步骤。
[0103] 本发明还保护一种鉴别待测病毒为单纯瘤疹病毒I型、单纯瘤疹病毒II型、水痘- 带状瘤疹病毒还是巨细胞病毒的方法,包括如下步骤:
[0104] (1)提取待测病毒的基因组DNA;
[010引(2似步骤(1)得到的基因组DNA为模板,分别采用所述引物组合的引物组I、引物 组II、引物组III和引物组IV进行LAMP扩增反应,如果采用引物组I可W实现W所述基因组 DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为单纯瘤疹病毒I型,如果采用引物组II可W实现W所述 基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为单纯瘤疹病毒II型,如果采用引物组III可W实 现W所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为水痘-带状瘤疹病毒,如果采用引物组 IV可W实现W所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为巨细胞病毒。
[0106] 所述方法中,所述待测病毒为单纯瘤疹病毒I型或单纯瘤疹病毒II型或水痘-带状 瘤疹病毒或巨细胞病毒。
[0107] 本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒I型或单纯瘤疹 病毒II型或水痘-带状瘤疹病毒或巨细胞病毒的方法,包括如下步骤:
[010引(1)提取待测病毒的基因组DNA;
[0109] (2似步骤(1)得到的基因组DNA为模板,分别采用所述引物组合的引物组I、引物 组II、引物组III和引物组IV进行LAMP扩增反应,如果采用引物组I可W实现W所述基因组 DNA为模板的阳性扩增、待测病毒或候选为单纯瘤疹病毒I型,如果采用引物组II可W实现 W所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为或候选为单纯瘤疹病毒II型,如果采用引 物组III可W实现W所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为或获选为水痘-带状瘤 疹病毒,如果采用引物组IV可W实现W所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为或候 选为巨细胞病毒,如果使用引物组I、引物组II、引物组HI和引物组IV均不能实现W所述基 因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为非单纯瘤疹病毒I型且非单纯瘤疹病毒II型且非水 痘-带状瘤疹病毒且非巨细胞病毒。
[0110] 本发明还保护一种鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒I型和/或单纯瘤疹病 毒II型和/或水痘-带状瘤疹病毒和/或巨细胞病毒的方法,包括如下步骤:
[0111] (1)提取待测样本的总DNA;
[0112] (2似步骤(1)得到的总DNA为模板,分别采用所述引物组合的引物组I、引物组II、 引物组m和引物组IV进行LAMP扩增反应,如果采用引物组I可W实现W所述总DNA为模板 的阳性扩增、待测样品疑似感染了单纯瘤疹病毒I型,如果采用引物组II可W实现W所述总 DNA为模板的阳性扩增、待测样品疑似感染了单纯瘤疹病毒II型,如果采用引物组III可W 实现W所述总DNA为模板的阳性扩增、待测样品疑似感染了水痘-带状瘤疹病毒,如果采用 引物组IV可W实现W所述总DNA为模板的阳性扩增、待测样品疑似感染了巨细胞病毒,如果 使用引物组I、引物组II、引物组III和引物组IV均不能实现W所述总DNA为模板的阳性扩 增、待测样本疑似未感染单纯瘤疹病毒I型且疑似未感染单纯瘤疹病毒II型且疑似未感染 水痘-带状瘤疹病毒且疑似未感染巨细胞病毒。
[0113] W上任一所述方法中,具体可通过如下方法判断"阳性扩增":用巧光PCR仪检测巧 光信号,如果出现阳性扩增曲线则为阳性扩增。所述阳性扩增曲线具体可为S型扩增曲线。
[0114] 本发明还保护所述引物组I。
[0115] 所述所述引物组I的用途为如下(gl)或(g2):
[0116] (gl)鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒I型;
[0117] (g2)鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒I型。
[0118] 本发明还保护所述引物组I在制备试剂盒甲中的应用,所述试剂盒甲的用途为如 下(gl)或(g2):
[0119] (gl)鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒I型;
[0120] (g2)鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒I型。
[0121] 本发明还保护含有所述引物组I的试剂盒甲,所述试剂盒甲的用途为如下(gl)或 (邑 2):
[0122] (gl)鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒I型;
[0123] (g2)鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒I型。
[0124] 本发明还保护所述引物组II。
[0125] 所述所述引物组II的用途为如下(g3)或(g4):
[0126] (g3)鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒II型;
[0127] (g4)鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒II型。
[0128] 本发明还保护所述引物组II在制备试剂盒乙中的应用,所述试剂盒乙的用途为如 下(的)或(g4):
[0129] (g3)鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒II型;
[0130] (g4)鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒II型。
[0131] 本发明还保护含有所述引物组II的试剂盒乙,所述试剂盒乙的用途为如下(g3)或 (邑4):
[0132] (g3)鉴定待测病毒是否为单纯瘤疹病毒II型;
[0133] (g4)鉴定待测样本是否感染了单纯瘤疹病毒II型。
[0134] 本发明还保护所述引物组III。
[0135] 所述所述引物组HI的用途为如下(g5)或(g6):
[0136] (g5)鉴定待测病毒是否为水痘-带状瘤疹病毒;
[0137] (g6)鉴定待测样本是否感染了水痘-带状瘤疹病毒。
[0138] 本发明还保护所述引物组III在制备试剂盒丙中的应用,所述试剂盒丙的用途为 如下(g5)或(g6):
[0139] (g5)鉴定待测病毒是否为水痘-带状瘤疹病毒;
[0140] (g6)鉴定待测样本是否感染了水痘-带状瘤疹病毒。
[0141] 本发明还保护含有所述引物组III的试剂盒丙,所述试剂盒丙的用途为如下(g5) 或(邑6):
[0142] (g5)鉴定待测病毒是否为水痘-带状瘤疹病毒;
[0143] (g6)鉴定待测样本是否感染了水痘-带状瘤疹病毒。
[0144] 本发明还保护所述引物组IV。
[0145] 所述所述引物组IV的用途为如下(g7)或(g8):
[0146] (g7)鉴定待测病毒是否为巨细胞病毒;
[0147] (g8)鉴定待测样本是否感染了巨细胞病毒。
[0148] 本发明还保护所述引物组IV在制备试剂盒下中的应用,所述试剂盒下的用途为如 下(g7)或(g8):
[0149] (g7)鉴定待测病毒是否为巨细胞病毒;
[0150] (g8)鉴定待测样本是否感染了巨细胞病毒。
[0151] 本发明还保护含有所述引物组IV的试剂盒下,所述试剂盒下的用途为如下(g7)或 (邑 8):
[0152] (g7)鉴定待测病毒是否为巨细胞病毒;
[0153] (g8)鉴定待测样本是否感染了巨细胞病毒。
[0154] W上任一所述待测样本具体可为眼部临床样本培养物、眼液体或抽吸物。
[0155] W上任一所述采用引物组I进行LAMP扩增的反应体系中,引物组I中引物混合物的 浓度为:〇.5iiM F3-l、0.5iiMB3-l、2iiM FIP-l、2iiM BIP-1、化M LF-1、化M LB-1。
[0156] W上任一所述采用引物组II进行LAMP扩增的反应体系中,引物组II中引物混合物 的浓度为:〇.5iiM F3-2、0.5iiMB3-2、2iiM FIP-2、2iiM BIP-2、化M LF-2、化M LB-2。
[0157] W上任一所述采用引物组III进行LAMP扩增的反应体系中,引物组III中引物混合 物的浓度为:〇.5iiM F3-3、0.5iiMB3-3、2iiM FIP-3、2iiM BIP-3、化M LF-3、化M LB-3。
[015引 W上任一所述采用引物组IV进行LAMP扩增的反应体系中,引物组IV中引物混合物 的浓度为:0.5iiM F3-4、0.5iiMB3-4、2iiM FIP-4、2iiM BIP-4、化M LF-4、化M LB-4。
[0159] W上任一所述采用引物组I进行LAMP扩增的反应体系具体可为:1化1 0 X ThermoPol Buffera.化L 5M甜菜碱,0.1 化 50mg/ml BSA,0.4化 lOOmM MgS〇4,0.3化 20 XEvaGreen,0.1扣L100mMdNTPs,0.化L洲/mlBstDNA聚合酶大片段,l化引物混合物 (F3-1、B3-1、FIP-1、BIP-1、LF-1 和LB-1 的混合物),50pg-50ng模板DNA,用d地2〇补足至lOy L。
[0160] W上任一所述采用引物组11进行LAMP扩增的反应体系具体可为:1化10 X ThermoPol Buffera.化L 5M甜菜碱,0.1 化 50mg/ml BSA,0.4化 lOOmM MgS〇4,0.3化 20 XEvaGreen,0.1扣L100mMdNTPs,0.化L洲/mlBstDNA聚合酶大片段,l化引物混合物 巧3-2、83-2少1口-2、81口-2、1。-2和1^8-2的混合物),50口邑-50叫模板0魁,用(1地2〇补足至10^ L。
[0161] W上任一所述采用引物组III进行LAMP扩增的反应体系具体可为:1化10 X ThermoPol Buffera.化L 5M甜菜碱,0.1 化 50mg/ml BSA,0.4化 lOOmM MgS〇4,0.3化 20 XEvaGreen,0.1扣L100mMdNTPs,0.化L洲/mlBstDNA聚合酶大片段,l化引物混合物 巧3-3、83-3少1口-3、81口-3、1。-3和1^8-3的混合物),50口邑-50叫模板0魁,用(1地2〇补足至10^ L。
[0162] W上任一所述采用引物组IV进行LAMP扩增的反应体系具体可为:1 iiL 10 X ThermoPol Buffera.化L 5M甜菜碱,0.1 化 50mg/ml BSA,0.4化 lOOmM MgS〇4,0.3化 20 XEvaGreen,0.1扣L100mMdNTPs,0.化L洲/mlBstDNA聚合酶大片段,l化引物混合物 巧3-4、83-4少1?-4、81?-4、1。-巧化8-4的混合物),509邑-50叫模板0臟,用(1地20补足至10^ L。
[0163] W上任一所述LAMP扩增的反应程序具体可为:65°C恒溫50min。反应过程中,采用 巧光PCR仪检测巧光信号。
[0164] 本发明提供了用于检巧U4种眼科感染病毒的LAM巧I物及方法。所述4种病毒包括: 单纯瘤疹病毒1型、单纯瘤疹病毒2型、水痘-带状瘤疹病毒和巨细胞病毒。本发明所述的 LAMP引物共4套,每种病毒1套,每套包括外引物F3和B3,内引物FIP和BIP W及环引物LF和 LB,每套均可特异性识别祀序列上的六个独立区域进行扩增,具有高特异性。应用本发明的 LAMP引物及方法,可快速、准确的检测出单纯瘤疹病毒I型、单纯瘤疹病毒II型、水痘-带状 瘤疹病毒和巨细胞病毒。
【附图说明】
[0165] 图1为实施例2的LAMP扩增曲线图。
[0166] 图2为实施例6的LAMP扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0167] W下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验,均设置=次重复实验,结果取平 均值。
[0168] pGEM-T Easy Vector载体:购自promega公司,产品货号A1360。
[0169] 实施例1、引物设计及制备
[0170] 进行大量序列分析、比对获得了用于鉴定单纯瘤疹病毒I型、单纯瘤疹病毒II型、 巨细胞病毒和水痘-带状瘤疹病毒的若干引物。将各个引物进行预实验,比较灵敏度、特异 性等性能,最终得到用于鉴定单纯瘤疹病毒I型、单纯瘤疹病毒II型、水痘-带状瘤疹病毒和 巨细胞病毒的四套LAMP引物组。
[0171] 用于鉴定单纯瘤疹病毒I型的引物组,包括2条外引物巧3-1、83-1),2条内引物 (FIP-UBIP-1)和2条环引物(LF-ULB-1),各条引物序列如下所示(5'一3'):
[0172] F3-U序列表的序列1) :TGCGGCTCGTGAAGACC;
[0173] B3-l(序列表的序列2) :TACGGCGACGGTGCGTA;
[0174] FIP-1 (序列表的序列3):TACTTACAGGAGCCCTTGGGACTGGACGGAGATTACACAGCG;
[01 巧]BIP-U序列表的序列4) :ACCAGCAGGGGGTGACTCTCGGGGATGAAGCGGCT;
[0176] LF-1(序列表的序列5) :CGGTGCTCCAGGATAAACT;
[0177] LB-1(序列表的序列6) :TGGACAGCATCGGGGG。
[0178] 用于鉴定单纯瘤疹病毒II型的引物组,包括2条外引物(F3-2、B3-2),2条内引物 (FIP-2、BIP-2)和2条环引物(LF-2、LB-2),各条引物序列如下所示(5'一3'):
[0179] F3-2(序列表的序列7) :TGCCCCATCCGAACGTC;
[0180] B3-2(序列表的序列8) :CTTCGAGGTGAGGCAGC;
[0181 ] FIP-2(序列表的序列9) :CCGCGGTCTCAAAGGCCAGCTTTAGCGCCGTCAGAC;
[0182] BIP-2 (序列表的序列 10): GGCTAGTGAAGATAAACGACAGCGTACTTGCAGGAGGGC;
[0183] LF-2(序列表的序列11) :AGGAATCCCAGGTTATCCTCTC;
[0184] LB-2(序列表的序列 12) :GACGGAGATCACACAATTTATCTG。
[0185] 用于鉴定水痘-带状瘤疹病毒的引物组,包括2条外引物(F3-3、B3-3),2条内引物 (FIP-3、BIP-3)和2条环引物(LF-3、LB-3),各条引物序列如下所不(5'一3'):
[0186] F3-3(序列表的序列 13) :AGGATGAAGACGATGAACC;
[0187] B3-3(序列表的序列 14) :GTTTGGTCTTACGAATCCTC;
[018引 FIP-3(序列表的序列 15) :TTGACGGGGAAGGGGCGTGCGTTTCGGTGGGAAGT;
[0189] BIP-3(序列表的序列 16):CGGATGATTCGGACTCAAATGAGATCGGGACCGCTgATG;
[0190] LF-3(序列表的序列 17) :GACCTGCTGCCTGTAGTTTC;
[0191] LB-3(序列表的序列 18) :ACAAAATATCCAACCGGGATATCGA。
[0192] 用于鉴定巨细胞病毒的引物组,包括2条外引物(F3-4、B3-4),2条内引物(FIP-4、 BIP-4)和2条环引物(LF-4、LB-4),各条引物序列如下所示(5'^3'):
[0193] F3-4(序列表的序列 19) :AACAATCCGGCCAGCAC;
[0194] B3-4(序列表的序列20) :CAGTAACGGCCTACCTG;
[01 巧]FIP-4(序列表的序列 21):AGTTGGGCGAGTTAGTCTTGGCTTGCGGGTTCGGTGGTTA;
[0196] BIP-4(序列表的序列22): ATAAGCTCAACACTATGGCCGACGAAACAACGCGGGATG;
[0197] LF-4(序列表的序列23) :GCATACGGGGTACATGTCGA;
[019引 LB-4(序列表的序列24) :GCTTTACCTGCGGCAACGC。
[0199] 用于鉴定单纯瘤疹病毒I型的引物组命名为引物组I。
[0200] 用于鉴定单纯瘤疹病毒II型的引物组命名为引物组II。
[0201] 用于鉴定水痘-带状瘤疹病毒的引物组命名为引物组III。
[0202] 用于鉴定巨细胞病毒的引物组命名为引物组IV。
[0203] 引物组I、引物组II、引物组HI和引物组IV组成引物组合。
[0204] 实施例2、检测方法建立
[02化]1、提取待测病毒的基因组DNA或提取待测生物样本的总DNA。
[0206] 2、取步骤1得到的DNA,作为模板,采用实施例1中制备的引物组I进行LAMP扩增。
[0207] LAMP 扩增的反应体系:1 化 lOXThermoPol Buffera.化 L 5M 甜菜碱,0.1 化 50mg/ ml BSA,0.4]iL lOOmM MgS〇4,0.3]iL 20XEvaGreen,0.1f5]iL lOOmM dNTPs,0.4]iL 8U/ml Bst DNA聚合酶大片段,1化引物混合物巧3-1、83-1少1?-1、81?-1、口^-巧化8-1的混合物), 2ng模板DNA,用d地2〇补足至10化。反应体系中各引物的浓度如下:0.5iiM F3-1、0.5iiMB3-l、 化M FIP-1、化M BIP-1、化M LF-1、化M LB-1。
[0208] LAMP扩增的反应程序:65°C恒溫50min。反应过程中,采用巧光PCR仪检测巧光信 号。
[0209] 3、取步骤1得到的DNA,作为模板,采用实施例1中制备的引物组II进行LAMP扩增。
[0210] LAMP 扩增的反应体系:1 化 lOXThermoPol Buffera.化 L 5M 甜菜碱,0.1 化 50mg/ ml BSA,0.4]iL lOOmM MgS〇4,0.3]iL 20XEvaGreen,0.1f5]iL lOOmM dNTPs,0.4]iL 8U/ml Bst DNA聚合酶大片段,1化引物混合物巧3-2、83-2少1?-2、81?-2、口^-2和1^8-2的混合物), 2ng模板DNA,用d地2〇补足至10化。反应体系中各引物的浓度如下:0.5iiM F3-2,0.5iiMB3-2, 化M FIP-2,化M BIP-2,化M LF-2,化M LB-2。
[0211] LAMP扩增的反应程序:65°C恒溫50min。反应过程中,采用巧光PCR仪检测巧光信 号。
[0212] 4、取步骤1得到的DNA,作为模板,采用实施例1中制备的引物组n I进行LAMP扩增。
[0213] LAMP 扩增的反应体系:1 化 lOXThermoPol Buffera.化 L 5M 甜菜碱,0.1 化 50mg/ ml BSA,0.4]iL lOOmM MgS〇4,0.3]iL 20XEvaGreen,0.1f5]iL lOOmM dNTPs,0.4]iL 8U/ml Bst DNA聚合酶大片段,1化引物混合物巧3-3、83-3少1?-3、81?-3、口^-3和1^8-3的混合物), 2ng模板DNA,用d地2〇补足至10化。反应体系中各引物的浓度如下:0.5iiM F3-3,0.5iiMB3-3, 化M FIP-3,化M BIP-3,化M LF-3,化M LB-3。
[0214] LAMP扩增的反应程序:65°C恒溫50min。反应过程中,采用巧光PCR仪检测巧光信 号。
[0215] 5、取步骤1得到的DNA,作为模板,采用实施例1中制备的引物组IV进行LAMP扩增。
[0216] LAMP 扩增的反应体系:1 化 lOXThermoPol Buffera.化 L 5M 甜菜碱,0.1 化 50mg/ ml BSA,0.4]iL lOOmM MgS〇4,0.3]iL 20XEvaGreen,0.1f5]iL lOOmM dNTPs,0.4]iL 8U/ml Bst DNA聚合酶大片段,1化引物混合物巧3-4、83-4少1?-4、81?-4、口^-巧化8-4的混合物), 2ng模板DNA,用d地2〇补足至10化。反应体系中各引物的浓度如下:0.5iiM F3-4,0.5iiMB3-4, 化M FIP-4,化M BIP-4,化M LF-4,化M LB-4。
[0217] LAMP扩增的反应程序:65°C恒溫50min。反应过程中,采用巧光PCR仪检测巧光信 号。
[0218] 如果采用引物组I可W得到阳性扩增曲线,表明待测病毒为单纯瘤疹病毒I型;如 果采用引物组II可W得到阳性扩增曲线,表明待测病毒为单纯瘤疹病毒II型;如果采用引 物组III可W得到阳性扩增曲线,表明待测病毒为水痘-带状瘤疹病毒;如果采用引物组IV 可W得到阳性扩增曲线,表明待测病毒为巨细胞病毒。
[0219] 如果采用引物组I可W得到阳性扩增曲线,表明待测样本感染了单纯瘤疹病毒I 型;如果采用引物组II可W得到阳性扩增曲线,表明待测样本感染了单纯瘤疹病毒II型;如 果采用引物组III可W得到阳性扩增曲线,表明待测样本感染了水痘-带状瘤疹病毒;如果 采用引物组IV可W得到阳性扩增曲线,表明待测样本感染了巨细胞病毒。
[0220] 实施例3、参考品质粒构建
[0221] 单纯瘤疹病毒I型参考品质粒:将序列表的序列25所示的双链DNA分子插入pGEM-T Easy Vector载体的Apal和SacI酶切位点之间,得到参考品质粒。
[0222] 单纯瘤疹病毒II型参考品质粒:将序列表的序列26所示的双链DNA分子插入pGEM- T Easy Vector载体的Apal和SacI酶切位点之间,得到参考品质粒。
[0223] 水痘-带状瘤疹病毒参考品质粒:将序列表的序列27所示的双链DNA分子插入 pGEM-T Easy Vector载体的Apal和SacI酶切位点之间,得到参考品质粒。
[0224] 巨细胞病毒参考品质粒:将序列表的序列28所示的双链DNA分子插入pGEM-T化sy Vector载体的Apal和SacI酶切位点之间,得到参考品质粒。
[0225] 实施例4、特异性
[0226] 待测样本分别为:单纯瘤疹病毒I型参考品质粒DNA、单纯瘤疹病毒II型参考品质 粒DNA、水痘-带状瘤疹病毒参考品质粒DNA、巨细胞病毒参考品质粒DNA。
[0227] 采用实施例2的检测方法进行检测。
[0228] 结果见图1。图1中,横坐标为循环数,纵坐标为巧光信号强度,其中,A为采用引物 组I时各个待测样本的扩增曲线,B为采用引物组II时各个待测样本的扩增曲线,C为采用引 物组III时各个待测样本的扩增曲线,D为采用引物组IV时各个待测样本的扩增曲线。由图 1A可见,单纯瘤疹病毒I型参考品质粒DNA得到S型扩增曲线,扩增结果为阳性,单纯瘤疹病 毒II型参考品质粒DNA、水痘-带状瘤疹病毒参考品质粒DNA和巨细胞病毒参考品质粒DNA均 没有得到S型扩增曲线,扩增结果为阴性。由图1B可见,单纯瘤疹病毒II型参考品质粒DNA得 至化型扩增曲线,扩增结果为阳性,单纯瘤疹病毒I型参考品质粒DNA、水痘-带状瘤疹病毒参 考品质粒DNA和巨细胞病毒参考品质粒DNA均没有得到S型扩增曲线,扩增结果为阴性。由图 1C可见,水痘-带状瘤疹病毒参考品质粒DNA得到S型扩增曲线,扩增结果为阳性,单纯瘤疹 病毒I型参考品质粒DNA、水痘-带状瘤疹病毒参考品质粒DNA和巨细胞病毒参考品质粒DNA 均没有得到S型扩增曲线,扩增结果为阴性。结果表明,实施例1制备的引物组合均具有很高 的特异性。
[0229] 实施例5、灵敏度
[0230] 待测样本为分别为:单纯瘤疹病毒I型参考品质粒DNA、单纯瘤疹病毒II型参考品 质粒DNA、水痘-带状瘤疹病毒参考品质粒DNA、巨细胞病毒参考品质粒DNA。
[0231] 1、用无菌水10倍梯度稀释各待测样本,得到各稀释液。
[0232] 2、分别取步骤1得到的各稀释液作为模板,采用实施例2的检测方法进行检测。
[0233] 由于采用的稀释度不同,形成如下不同的反应体系:
[0234] 反应体系1中,参考品质粒DNA的初始含量为:10000个拷贝;
[0235] 反应体系2中,参考品质粒DNA的初始含量为:1000个拷贝;
[0236] 反应体系3中,参考品质粒DNA的初始含量为:500个拷贝;
[0237] 反应体系4中,参考品质粒DNA的初始含量为:100个拷贝。
[0238] 每种病毒参考品质粒分别按上述4个体系进行检测。
[0239] 结果表明,单纯瘤疹病毒I型参考品质粒、单纯瘤疹病毒II型参考品质粒、水痘-带 状瘤疹病毒参考品质粒、巨细胞病毒参考品质粒的DNA含量为500-10000个拷贝时均得到S 型扩增曲线,单纯瘤疹病毒I型参考品质粒、单纯瘤疹病毒II型参考品质粒、水痘-带状瘤疹 病毒参考品质粒、巨细胞病毒参考品质粒的DNA浓度浓度为100个拷贝时均没有得到S型扩 增曲线。该结果表明本发明所提供的用于检测4种眼科感染病毒的LAMP引物组合具有较高 的灵敏度。
[0240] 实施例6、临床样本检测
[0241] 待测样本为:经过临床鉴定为单纯瘤疹病毒I型阳性的眼部抽吸物样本、经过临床 鉴定为单纯瘤疹病毒II型阳性的眼部抽吸物样本、经过临床鉴定为水痘-带状瘤疹病毒阳 性的眼部抽吸物样本、经过临床鉴定为巨细胞病毒的眼部抽吸物样本和经过临床鉴定不存 在单纯瘤疹病毒I型、水痘-带状瘤疹病毒、巨细胞病毒的健康者的眼部抽吸物样本。
[0242] 采用实施例2的检测方法进行检测。
[0243] 结果见图2。图2中,横坐标为循环数,纵坐标为巧光信号强度,其中,A为采用引物 组I时各个待测样本的扩增曲线,B为采用引物组II时各个待测样本的扩增曲线,C为采用引 物组III时各个待测样本的扩增曲线,D为采用引物组IV时各个待测样本的扩增曲线。由图 2A可见,只有单纯瘤疹病毒I型阳性样本得到S型扩增曲线(经测序,如序列表的序列25所 示),单纯瘤疹病毒II型阳性样本、水痘-带状瘤疹病毒阳性样本和巨细胞病毒阳性样本均 没有得到S型扩增曲线,与临床鉴定结果相符。由图2B可见,只有单纯瘤疹病毒II型阳性样 本得到S型扩增曲线(经测序,如序列表的序列26所示),单纯瘤疹病毒I型阳性样本、水痘- 带状瘤疹病毒阳性样本和水痘-带状瘤疹病毒阳性样本均没有得到S型扩增曲线,与临床鉴 定结果相符。由图2C可见,只有水痘-带状瘤疹病毒阳性样本得到S型扩增曲线(经测序,如 序列表的序列27所示),单纯瘤疹病毒I型阳性样本、单纯瘤疹病毒II型阳性样本和巨细胞 病毒阳性样本均没有得到S型扩增曲线,与临床鉴定结果相符。由图2D可见,只有巨细胞病 毒阳性样本得到S型扩增曲线(经测序,如序列表的序列28所示),单纯瘤疹病毒I型阳性样 本、单纯瘤疹病毒II型阳性样本和水痘-带状瘤疹病毒阳性样本均没有得到S型扩增曲线, 与临床鉴定结果相符。结果表明,使用实施例1制备的引物组合进行病毒鉴定,结果准确可 靠。健康组织不显示阳性S型扩增曲线,证明四个引物组对于人正常基因组来说不存在非特 异性扩增。
【主权项】
1.引物组合,由引物组I、引物组II、引物组III和引物组IV组成; 所述引物组I由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1、引物BIP-1、引物LB-1和引物LF-1组 成; 所述引物F3-1为如下(al)或(a2): (al)序列表的序列1所示的单链DNA分子; (a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同 功能的DNA分子; 所述引物B3-1为如下(a3)或(a4): (a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子; (a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同 功能的DNA分子; 所述引物FIP-1为如下(a5)或(a6): (a5)序列表的序列3所不的单链DNA分子; (a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同 功能的DNA分子; 所述引物BIP-1为如下(a7)或(a8): (a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子; (a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同 功能的DNA分子; 所述引物LB-1为如下(a9)或(alO): (a9)序列表的序列5所不的单链DNA分子; (alO)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同 功能的DNA分子; 所述引物LF-1为如下(all)或(al2): (all)序列表的序列6所不的单链DNA分子; (al2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同 功能的DNA分子; 所述引物组II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物LB-2和引物LF-2组 成; 所述引物F3-2为如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列7所示的单链DNA分子; (b2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同 功能的DNA分子; 所述引物B3-2为如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列8所示的单链DNA分子; (b4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同 功能的DNA分子; 所述引物FIP-2为如下(b5)或(b6): (b5)序列表的序列9所不的单链DNA分子; (b6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同 功能的DNA分子; 所述引物BIP-2为如下(b7)或(b8): (b7)序列表的序列10所示的单链DNA分子; (b8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LB-2为如下(b9)或(blO): (b9)序列表的序列11所示的单链DNA分子; (blO)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LF-3为如下(bll)或(bl2): (bll)序列表的序列12所示的单链DNA分子; (bl2)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相 同功能的DNA分子; 所述引物组III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-2、引物BIP-3、引物LB-3和引物LF-3组 成; 所述引物F3-3为如下(cl)或(c2): (cl)序列表的序列13所示的单链DNA分子; (c2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相 同功能的DNA分子; 所述引物B3-3为如下(c3)或(c4): (c3)序列表的序列14所示的单链DNA分子; (c4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相 同功能的DNA分子; 所述引物FIP-2为如下(c5)或(c6): (c5)序列表的序列15所不的单链DNA分子; (c6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相 同功能的DNA分子; 所述引物BIP-3为如下(c7)或(c8): (c7)序列表的序列16所不的单链DNA分子; (c8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LB-3为如下(c9)或(clO): (c9)序列表的序列17所示的单链DNA分子; (clO)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LF-3为如下(ell)或(cl2): (ell)序列表的序列18所示的单链DNA分子; (cl2)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相 同功能的DNA分子; 所述引物组IV由引物F3-4、引物B3-4、引物FIP-4、引物BIP-4、引物LB-4和引物LF-4组 成; 所述引物F3-4为如下(dl)或(d2): (dl)序列表的序列19所示的单链DNA分子; (d2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相 同功能的DNA分子; 所述引物B3-4为如下(d3)或(d4): (d3)序列表的序列20所示的单链DNA分子; (d4)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相 同功能的DNA分子; 所述引物FIP-4为如下(d5)或(d6): (d5)序列表的序列21所示的单链DNA分子; (d6)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相 同功能的DNA分子; 所述引物BIP-4为如下(d7)或(d8): (d7)序列表的序列22所示的单链DNA分子; (d8)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LB-4为如下(d9)或(dlO): (d9)序列表的序列23所示的单链DNA分子; (dlO)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LF-4为如下(dll)或(dl2): (dll)序列表的序列24所示的单链DNA分子; (dl2)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相 同功能的DNA分子。2.权利要求1所述引物组合的应用,为如下(el)至(e6)中的任意一种: (el)鉴别单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘-带状疱疹病毒和巨细胞病毒; (e2)制备用于鉴别单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘-带状疱疹病毒和巨细 胞病毒的试剂盒; (e3)鉴定待测病毒是否为单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒II型或水痘-带状疱疹病 毒或巨细胞病毒; (e4)制备用于鉴定待测病毒是否为单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒II型或水痘-带 状疱疹病毒或巨细胞病毒的试剂盒; (e5)鉴定待测样本是否感染了单纯疱疹病毒I型和/或单纯疱疹病毒II型和/或水痘-带状疱疹病毒和/或巨细胞病毒; (e6)制备用于鉴定待测样本是否感染了单纯疱疹病毒I型和/或单纯疱疹病毒II型和/ 或水痘-带状疱疹病毒和/或巨细胞病毒的试剂盒。3. 含有权利要求1所述引物组合的试剂盒;所述试剂盒的用途为如下(Π )或(f2)或 (f3): (Π )鉴别单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘-带状疱疹病毒和巨细胞病毒; (f2)鉴定待测病毒是否为单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒II型或水痘-带状疱疹病 毒或巨细胞病毒; (f3)鉴定待测样本是否感染了单纯疱疹病毒I型和/或单纯疱疹病毒II型和/或水痘-带状疱疹病毒和/或巨细胞病毒。4. 权利要求3所述试剂盒的制备方法,包括将各条引物单独包装的步骤。5. -种鉴别待测病毒为单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘-带状疱疹病毒还 是巨细胞病毒的方法,包括如下步骤: (1) 提取待测病毒的基因组DNA; (2) 以步骤(1)得到的基因组DNA为模板,分别采用权利要求1所述引物组合的引物组I、 弓丨物组II、引物组III和引物组IV进行LAMP扩增反应,如果采用引物组I可以实现以所述基 因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为单纯疱疹病毒I型,如果采用引物组II可以实现以 所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为单纯疱疹病毒II型,如果采用引物组III可 以实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为水痘-带状疱疹病毒,如果采用引 物组IV可以实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为巨细胞病毒。6. -种辅助鉴定待测病毒是否为单纯疱疹病毒I型或单纯疱疹病毒II型或水痘-带状 疱疹病毒或巨细胞病毒的方法,包括如下步骤: (1) 提取待测病毒的基因组DNA; (2) 以步骤(1)得到的基因组DNA为模板,分别采用权利要求1所述引物组合的引物组I、 弓丨物组II、引物组III和引物组IV进行LAMP扩增反应,如果采用引物组I可以实现以所述基 因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为或候选为单纯疱疹病毒I型,如果采用引物组II可 以实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为或候选为单纯疱疹病毒II型,如果 采用引物组III可以实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为或候选为水痘-带状疱疹病毒,如果采用引物组IV可以实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒 为或候选为巨细胞病毒,如果使用引物组I、引物组II、引物组III和引物组IV均不能实现以 所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测病毒为非单纯疱疹病毒I型且非单纯疱疹病毒II型 且非水痘-带状疱疹病毒且非巨细胞病毒。7. -种鉴定待测样本是否感染了单纯疱疹病毒I型和/或单纯疱疹病毒II型和/或水 痘-带状疱疹病毒和/或巨细胞病毒的方法,包括如下步骤: (1) 提取待测样本的总DNA; (2) 以步骤(1)得到的总DNA为模板,分别采用权利要求1所述引物组合的引物组I、引物 组II、引物组III和引物组IV进行LAMP扩增反应,如果采用引物组I可以实现以所述基因组 DNA为模板的阳性扩增、待测样品疑似感染了单纯疱疹病毒I型,如果采用引物组II可以实 现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测样品疑似感染了单纯疱疹病毒II型,如果采用 引物组III可以实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测样品疑似感染了水痘-带状 疱疹病毒,如果采用引物组IV可以实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测样品疑似 感染了巨细胞病毒,如果使用引物组I、引物组II、引物组III和引物组IV均不能实现以所述 基因组DNA为模板的阳性扩增、待测样本疑似未感染单纯疱疹病毒I型且疑似未感染单纯疱 疹病毒II型且疑似未感染水痘-带状疱疹病毒且疑似未感染巨细胞病毒。8.引物组I或引物组II或引物组III或引物组IV; 所述引物组I由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1、引物BIP-1、引物LB-1和引物LF-1组 成; 所述引物F3-1为如下(al)或(a2): (al)序列表的序列1所示的单链DNA分子; (a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同 功能的DNA分子; 所述引物B3-1为如下(a3)或(a4): (a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子; (a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同 功能的DNA分子; 所述引物FIP-1为如下(a5)或(a6): (a5)序列表的序列3所不的单链DNA分子; (a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同 功能的DNA分子; 所述引物BIP-1为如下(a7)或(a8): (a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子; (a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同 功能的DNA分子; 所述引物LB-1为如下(a9)或(alO): (a9)序列表的序列5所不的单链DNA分子; (alO)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同 功能的DNA分子; 所述引物LF-1为如下(all)或(al2): (all)序列表的序列6所不的单链DNA分子; (al2)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同 功能的DNA分子; 所述引物组II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物LB-2和引物LF-2组 成; 所述引物F3-2为如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列7所示的单链DNA分子; (b2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同 功能的DNA分子; 所述引物B3-2为如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列8所示的单链DNA分子; (b4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同 功能的DNA分子; 所述引物FIP-2为如下(b5)或(b6): (b5)序列表的序列9所不的单链DNA分子; (b6)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同 功能的DNA分子; 所述引物BIP-2为如下(b7)或(b8): (b7)序列表的序列10所示的单链DNA分子; (b8)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LB-2为如下(b9)或(blO): (b9)序列表的序列11所示的单链DNA分子; (blO)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LF-3为如下(bll)或(bl2): (bll)序列表的序列12所示的单链DNA分子; (bl2)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相 同功能的DNA分子; 所述引物组III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-2、引物BIP-3、引物LB-3和引物LF-3组 成; 所述引物F3-3为如下(cl)或(c2): (cl)序列表的序列13所示的单链DNA分子; (c2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相 同功能的DNA分子; 所述引物B3-3为如下(c3)或(c4): (c3)序列表的序列14所示的单链DNA分子; (c4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相 同功能的DNA分子; 所述引物FIP-2为如下(c5)或(c6): (c5)序列表的序列15所不的单链DNA分子; (c6)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相 同功能的DNA分子; 所述引物BIP-3为如下(c7)或(c8): (c7)序列表的序列16所不的单链DNA分子; (c8)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LB-3为如下(c9)或(clO): (c9)序列表的序列17所示的单链DNA分子; (clO)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LF-3为如下(ell)或(cl2): (ell)序列表的序列18所示的单链DNA分子; (cl2)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相 同功能的DNA分子; 所述引物组IV由引物F3-4、引物B3-4、引物FIP-4、引物BIP-4、引物LB-4和引物LF-4组 成; 所述引物F3-4为如下(dl)或(d2): (dl)序列表的序列19所示的单链DNA分子; (d2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相 同功能的DNA分子; 所述引物B3-4为如下(d3)或(d4): (d3)序列表的序列20所示的单链DNA分子; (d4)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相 同功能的DNA分子; 所述引物FIP-4为如下(d5)或(d6): (d5)序列表的序列21所示的单链DNA分子; (d6)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相 同功能的DNA分子; 所述引物BIP-4为如下(d7)或(d8): (d7)序列表的序列22所示的单链DNA分子; (d8)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LB-4为如下(d9)或(dlO): (d9)序列表的序列23所示的单链DNA分子; (dlO)将序列23经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列23具有相 同功能的DNA分子; 所述引物LF-4为如下(dll)或(dl2): (dll)序列表的序列24所示的单链DNA分子; (dl2)将序列24经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列24具有相 同功能的DNA分子。9.权利要求8所述引物组I在制备试剂盒甲中的应用,或,所述引物组II在制备试剂盒 乙中的应用,或,所述引物组III在制备试剂盒丙中的应用,或,所述引物组IV在制备试剂盒 丁中的应用; 所述试剂盒甲的用途为如下(gl)或(g2): (gl)鉴定待测病毒是否为单纯疱疹病毒I型; (g2)鉴定待测样本是否感染了单纯疱疹病毒I型; 所述试剂盒乙的用途为如下(g3)或(g4): (g3)鉴定待测病毒是否为单纯疱疹病毒II型; (g4)鉴定待测样本是否感染了单纯疱疹病毒II型; 所述试剂盒丙的用途为如下(g5)或(g6): (g5)鉴定待测病毒是否为水痘-带状疱疹病毒; (g6)鉴定待测样本是否感染了水痘-带状疱疹病毒; 所述试剂盒丁的用途为如下(g7)或(g8): (g7)鉴定待测病毒是否为巨细胞病毒; (g8)鉴定待测样本是否感染了巨细胞病毒。10.含有权利要求8所述引物组I的试剂盒甲,或,含有权利要求8所述引物组II的试剂 盒乙,或,含有权利要求8所述引物组III的试剂盒丙,或,含有权利要求8所述引物组IV的试 剂盒丁; 所述试剂盒甲的用途为如下(gl)或(g2): (gl)鉴定待测病毒是否为单纯疱疹病毒I型; (g2)鉴定待测样本是否感染了单纯疱疹病毒I型; 所述试剂盒乙的用途为如下(g3)或(g4): (g3)鉴定待测病毒是否为单纯疱疹病毒II型; (g4)鉴定待测样本是否感染了单纯疱疹病毒II型; 所述试剂盒丙的用途为如下(g5)或(g6): (g5)鉴定待测病毒是否为水痘-带状疱疹病毒; (g6)鉴定待测样本是否感染了水痘-带状疱疹病毒; 所述试剂盒丁的用途为如下(g7)或(g8): (g7)鉴定待测病毒是否为巨细胞病毒; (g8)鉴定待测样本是否感染了巨细胞病毒。
【文档编号】C12Q1/68GK106048088SQ201610404661
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】陶勇
【申请人】首都医科大学附属北京朝阳医院
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