猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒及引物和探针的制作方法
【专利摘要】本发明一种用于检测猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株gB基因和gE基因的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针。本发明建立了针对gB基因和gE基因的双重实时荧光定量PCR方法，能够快速鉴别伪狂犬病野毒株(同时含有gB基因和gE基因)与基因缺失株(仅含有gB基因)，并可对病毒拷贝数进行精确定量。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高，将在猪伪狂犬病毒的检测、毒株鉴定及疫苗生产中发挥作用。
【专利说明】
猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时黄光定量PCR检 测试剂盒及引物和探针
技术领域
[0001] 本发明属于动物病原检测领域，设及鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的方 法，特别设及一种用于鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和巧基因的双重实时 巧光定量PCR检测方法及其专用引物、TaqMan探针、检测试剂盒W及所述引物、探针在检测 猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株中浊基因和巧基因中的应用。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(PseudorabiesVirusJRV)引起的B 类传染病(0IE认定），分布广泛，危害严重，可W感染不同年龄段的猪，但W妊娠母猪和哺乳 仔猪感染最为严重，导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎，哺乳仔猪出现神经症状、麻搏、衰 竭死亡，死亡率高达100%。目前，伪狂犬病已成为对全球养猪业危害最大的传染病之一，每 年给养猪业造成了巨大的经济损失。
[0003] 伪狂犬病毒属于瘤疹病毒科中的a瘤疹病毒亚科，基因组为双链DNA分子，大小约 150kb，成熟病毒粒子携带50余种蛋白，其旨8、旨6、旨6、旨1、11(等毒力基因是其复制非必需基 因，其编码的蛋白为非必需糖蛋白，缺失运些基因后，其复制扩增及抗原性并不受任何影 响，但毒力却大大降低。巧基因是伪狂犬的主要毒力相关基因，也是世界动物卫生组织所规 定基因缺失疫苗的首选缺失基因。目前，欧美等发达国家应用巧基因缺失疫苗及其配套的 鉴别诊断方法已实现了伪狂犬的净化，中国也已广泛使用巧基因缺失弱毒疫苗用于伪狂犬 的预防和控制。浊基因是伪狂犬病毒复制所必需的基因，在野毒株与基因缺失株中均存在。
[0004] 目前，国内外常用的实验室诊断伪狂犬病毒的方法主要包括病毒分离、兔体接种 实验、抗体诊断、病原学诊断、分子生物学诊断等几大类，其中分子生物学诊断中的实时巧 光定量PCR检测技术W其快速、简便、准确等优点成为快速发展的检测手段。
[0005] 实时巧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR，qPCR)是 1996年由美国 Appl ied Biosystems公司推出的，该技术是指在PCR反应体系中加入巧光基团，利用巧光信 号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[Heid CA， Stevens J,Livak KJ,Williams PM.Real time quantitative PCR.Genome Res.19960ct； 6( 10): 986-94.]。实时巧光定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生 物学研究的各个领域。与常规PCR相比该技术可快速、灵敏的检测病毒RNA和DNAW及细菌 DNA，目前该方法已广泛用于人类传染病的诊断和病原定量、W及动物病原体的检测、畜禽 产品的检验检疫、生物制品的鉴定等领域[Jozefczuk J,Adjaye J.Quantitative real? time PCR-based analysis of gene expression.Methods Enzymol.2011;500:99-109.]。 目前针对浊基因和巧基因建立的双重qPCR检测方法较少，Ma等根据PRV浊和姐基因分别设 计引物和探针，建立了诊断PRV野毒株的巧光定量PCR方法，该方法对PRV野毒株具有良好的 扩增效果，而对疫苗缺失株及其他常见猪病原的检测均为阴性[文献l:Development of real-time polymerase chain reaction assays for rapid detection and differentiation of wild-typep seudorabies and gene-deleted vaccine viruses， MaW，LagerKM，Richt JA，et al.J Vet Dia即Invest,2008,20(4):440-447.]。马兴杰等针 对gB、姐和gG建立了的鉴别诊断PRV强弱毒的纳米PCR检测方法并组装了试剂盒，试验结果 表明，该试剂盒具有较高的灵敏性、特异性及可重复性，检验结果可靠[文献2:鉴别猪伪狂 犬病毒巧/gB/gG的纳米PCR及巧光定量PCR方法的建立及评价，马兴杰，中国农业科学院学 位论文]。虽如此，由于病毒变异的风险客观存在，更丰富的检测技术有助于防范病毒变异 所导致的检测失利，本发明利用自主设计的引物和探针建立了猪伪狂犬病野毒株与基因缺 失株的鉴定、检测方法，与其它学者的引物和探针具有差异性。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和 姐基因进行双重实时巧光定量PCR检测的引物与TaqMan探针，W实现猪伪狂犬病野毒株与 基因缺失株的鉴别。
[0007] 本发明所提供的用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和姐基因进行 双重实时巧光定量PCR检测的引物为：
[000引用于检测gB基因的上游引物(gB-F)的核巧酸序列如序列表中SED ID N0:1所示， 用于检测浊基因的下游引物(浊-R)的核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；
[0009] 用于检测巧基因的上游引物(姐-F)的核巧酸序列如序列表中SED ID N0:3所示， 用于检测巧基因的下游引物(巧-R)的核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。
[0010]由上述引物衍生的引物序列也属于本
【发明内容】
。所述衍生序列是指在沈Q ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和/或沈Q ID N0:4的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失 或添加得到的引物序列。
[0011] 本发明所提供的用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和姐基因进行 双重实时巧光定量PCR检测的化qMan探针，用于检测gB基因的化qMan探针(PRV-gB)的核巧 酸序列如序列表中SED ID NO: 5所示；用于检测gB基因的化qMan探针(PRV-gE)的核巧酸序 列如序列表中SEQ ID N0:6所示;所述探针为经过巧光标记的，其5'端标记有报告巧光基 团，3 '端标记有泽灭巧光基团。
[0012] 由上述化qMan探针序列的衍生序列也属于本
【发明内容】
。所述衍生序列是指在SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6的基础上，在序列的5'端和/或3'端再添加、减少一个或多个碱基得 到的序列。
[001引所述PRV-gB的报告巧光基团为FAM，巧光泽灭基团为TAMRA;所述PRV-巧的报告巧 光基团为R0X，巧光泽灭基团为B册2。
[0014] 为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3'端已经憐酸化处理。
[0015] 本发明的第二个目的是提供用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和 巧基因进行双重实时巧光定量PCR检测的试剂盒。
[0016] 本发明所提供的实时巧光定量PCR检测试剂盒，包括上述用于对猪伪狂犬病野毒 株与基因缺失株的浊基因和巧基因进行双重实时巧光定量PCR检测的引物和化qMan探针。
[0017] 具体来讲，所述试剂盒包括W下用于25化双重实时巧光定量PCR反应体系的试剂： 实时巧光定量PCR反应液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(购于hkaRa公司），浊-F(2化 M) 0.5化，gB-R(20yM) 0.5化，gE-F(20yM) 0.5化，gE-R(20yM) 0.5化，PRV-gB (1 OiiM) 1化，PRV- 邑6(10咖）1化，尺臟-化66出0 6.5化。
[0018] 为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为猪伪 狂犬病野毒株基因组DNA和猪伪狂犬病毒基因缺失株基因组DNA或分别携带猪伪狂犬病野 毒株浊基因和巧基因的重组质粒pGEM-gB和pGEM-gE，所述阴性对照为不含猪伪狂犬病野毒 株与基因缺失株的反应体系，如出〇(双蒸水、无菌去离子水等）。
[0019] 本发明的第S个目的是提供一种用上述双重实时巧光定量PCR检测试剂盒及双重 实时巧光定量PCR技术对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和巧基因进行定性、定 量检测的方法。
[0020] 利用本发明所提供的试剂盒对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和姐基 因进行双重实时巧光定量PCR检测，可包括W下步骤：
[0021] 1)建立标准曲线：将分别携带猪伪狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重组质粒 pGEM-gB和pGEM-姐作为标准品，分别10倍梯度稀释成1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 1〇5、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 1 〇1拷贝（copi eS) /化，W不同浓度的标准品作为模板，在上述引物 和TaqMan探针的引导下进行双重实时巧光定量PCR检测，检测结束后，W各标准品的浓度 Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；
[0022] 2)提取待测样品的基因组DNA，W提取的基因组DNA为模板，在上述引物和化qMan 探针的引导下进行双重实时巧光定量PCR检测；
[0023] 3)用得到的CT值或巧光信号的变化实现对浊基因和巧基因定性检测，再根据巧光 信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含猪伪狂犬病毒gB基因和巧基因的 拷贝数，实现定量检测。
[0024] 利用W上检测结果，本发明提供一种鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的方 法，在上述步骤后还包括：
[00巧]4)结果判定：
[0026] 结果判定方法1:阳性对照样品CT值<38,阴性对照样品CT值>3別寸检测成立，待 测样品CT值<38时判定结果为阳性，CT值>38时则判定结果为阴性，若样品中检测到猪伪 狂犬病毒的gB基因和姐基因均为阳性，则判定样品为猪伪狂犬病野毒株;若样品中检测到 浊基因为阳性，巧基因为阴性，则判定样品为猪伪狂犬病毒基因缺失株；
[0027] 结果判定方法2:根据巧光信号的变化，对待测样品中的gB基因和巧基因进行定性 检测，同时出现gB基因和巧基因的巧光扩增曲线判定样品为猪伪狂犬病野毒株，只出现gB 基因巧光扩增曲线判定样品为猪伪狂犬病毒基因缺失株。
[0028] 在上述方法中，所述步骤2)中的待测样品主要包括:血清、病毒细胞培养物。
[0029] 所述步骤1)和步骤2)中的25化双重实时巧光定量PCR反应体系可包括:模板化L， 实时巧光定量PCR反应液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(购于hkaRa公司），浊-F(2化 M) 0.5化，gB-R(20yM) 0.5化，gE-F(20yM) 0.5化，gE-R(20yM) 0.5化，PRV-gB (1 OiiM) 1化，PRV- 姐（1〇咖）1化，RNA-free出0 6.化L。引物稀释为20ngAiL，反应体系中最终加量为lOng。 化qMan探针稀释为1 Ong/jiL，反应体系中最终加量为1 Ong。
[0030] 所述步骤1)和步骤2)中的实时巧光定量PCR反应条件可为:先95°C预变性2min;然 后95°C变性15s，60°C退火30s，共45个循环。在每个循环的延伸结束时进行巧光信号检测。
[0031] 本发明提供了一种鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时巧光定量PCR 检测试剂盒与检测方法。本发明的试剂盒中含有两对引物和两条探针，引物和探针分别针 对猪伪狂犬病病毒的浊基因和巧基因的保守区设计。本发明通过建立针对浊基因和巧基因 的双重实时巧光定量PCR方法，能够鉴别伪狂犬病野毒株（同时含有gB基因和巧基因）与基 因缺失株(仅含有gB基因），并可对病毒拷贝数进行精确定量。本发明可为疫苗生产过程中 的质量监控和合理化配苗提供有力依据，确保疫苗接种的安全性和合理性，对猪伪狂犬疫 苗的生产具有指导作用。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强，将在猪伪狂犬病 毒的检测及疫苗生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
[0032] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0033] 图1为浊、巧基因双重实时巧光定量PCR检测浊基因的标准品扩增曲线；
[0034] 图2为浊、巧基因双重实时巧光定量PCR检测浊基因的标准品标准曲线；
[0035] 图3为浊、巧基因双重实时巧光定量PCR检测巧基因的标准品扩增曲线；
[0036] 图4为浊、巧基因双重实时巧光定量PCR检测巧基因的标准品标准曲线；
[0037] 图5为浊、巧基因双重实时巧光定量PCR检测特异性实验的扩增曲线；
[0038] 图6为浊、巧基因实时巧光定量PCR引物与探针筛选的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russel1，David W.， Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd edit ion，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
[0040] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/lOOg)百分比浓度、质 量/体积(W/V，单位g/lOOmU百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/lOOmU百分比浓度。
[0041] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径W达 到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的 来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可W按照实施例中的提 示替换使用。
[0042] 所用引物由华大基因公司合成，TaqMan探针由化kara公司合成。
[0043] 实施例在W本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0044] 实施例1、设计对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和姐基因进行双重实 时巧光定量PCR检测的引物及化qMan探针
[0045] 从NCBI的核酸数据库GenBank化t1:p://www.ncbi .nlm.nih.gov)检索获得猪伪狂 犬病野毒株的gB基因（GenBank号:NC_006151)和巧基因（GenBank号:AF207700)的序列，用 DNA Man软件进行比对后，根据引物设计原则，分别对gB基因和巧基因各设计3对引物对用 于PCR扩增，通过电泳结果各自筛选到引物特异性高、扩增效果好的引物对，确定gB基因特 异性的引物对序列为自5'端第17211-17574位碱基，姐基因特异性的引物对序列为自5'端 第443-1357位碱基;在此基础上再用Primer Express 6.0软件对猪伪狂犬病野毒株与基因 缺失株在该片段范围进行双重实时巧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针，各设计2对引物 探针，并通过单重巧光定量PCR进行优选，最终确定最优的浊基因特异性的引物探针序列为 自5'端第17411-17543位碱基，姐基因特异性的引物探针序列为自5'端第1060-1143位碱 基。
[0046] 引物和探针优选过程:分别对所设计的2对gB基因和巧基因 （gB 1、gB2; gE 1、巧2)巧 光定量引物与探针进行单重实时巧光定量PCR，所用反应体系与反应条件如下：
[0047] 1)25化单重实时巧光定量PCR反应体系可包括:模板化L，实时巧光定量PCR反应液 Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(购于hkaRa公司），上游引物F(20yM)0.扣L，下游引物 R(20山00.5化，探针（10咖）1化，RNA-free出08.5化。引物稀释为20ng/iiL，反应体系中最终 加量为lOngeTaqMan探针稀释为lOng/jiL，反应体系中最终加量为lOng。
[004引 2)单重实时巧光定量PCR反应条件可为:先95°C预变性2min;然后95°C变性15s，60 °C退火30s，共45个循环。在每个循环的延伸结束时进行巧光信号检测。
[0049] 反应结束后比较CT值和平台期所能达到的扩增值，筛选出较好的浊基因和巧基因 巧光定量引物与探针。实时巧光定量PCR扩增曲线见图6。
[0050] 经过优选，本发明确定的对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株进行双重实时巧光定 量PCR检测的引物及化qMan探针序列如下：
[0化1]浊基因上游引物（浊斗）：5'-6641'(：1'〔6口'61461〇：46646-3'（沈0 10備：1)
[0化2]浊基因下游引物（浊-1〇:5'-646616〔01；464〔641'〔46-3'（沈0 10備：2);
[0化3]巧基因上游引物（邑6斗）：5'-(：1'〔6164164〔〇：4〔44466-3'（沈0 10備：3)
[0化4]巧基因下游引物（邑6-10:5'-(：1764164〇1^'64〔614(：1'(：-3'（5邸10備:4);
[0055] gB基因 TaqMan巧光探针（PRV-gB) :5'-(FAM)TGACCCTGAACCTGACGCTGCTGGA (TAMRA)-3'（S邸 ID N0:5)
[0056] 姐基因 haMan巧光探针（PRV-gE): 5 ' -(ROX) CGCCACCTGGGACTACACGCT (BHQ2) -3 ' (沈D ID N0:6)。
[0057] PRV-gB的报告巧光基团为FAM，巧光泽灭基团为TAMRA;PRV-巧的报告巧光基团为 R0X，巧光泽灭基团为B册2。为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3'端已经憐酸化处理。
[0058] 实施例2、用本发明的引物及TaqMan探针对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB 基因和巧基因进行双重实时巧光定量PCR检测
[0化9] 一、提取待测样品的基因组DNA
[0060] 对灭活的猪伪狂犬野毒株与基因缺失株的细胞培养物W及收集的12份临床疑似 血清病料提取基因组DNA，具体方法包括W下步骤：
[0061] (1)分别取20化L灭活的伪狂犬野毒株与基因缺失株细胞培养物W及临床血清加 入到1.5mL离屯、管中，加入ImL DNAzol裂解液振荡混匀，静置10分钟裂解；
[00创 （2)12000rpm离屯、10分钟，取上清约800化至新的1.5mL离屯、管中，加入500化无水 乙醇，轻轻混匀静置5分钟，使DNA析出；
[0063] (3) 1200化pm离屯、10分钟，弃上清，加入80化L 75%乙醇洗涂DNA沉淀，轻轻混匀后 12000巧m离屯、5分钟；
[0064] (4)重复上一步骤；
[0065] (5)弃上清，待离屯、管中残留液体惊干后，加入20化无酶水溶解DM沉淀，-20°C冻 存备用。
[0066] 二、猪伪狂犬病毒浊基因和巧基因的双重实时巧光定量PCR标准曲线的建立
[0067] 1、PCR扩增猪伪狂犬病毒浊基因和巧基因
[0068] 对步骤一提取的猪伪狂犬病毒野毒株基因组DNA进行PCR扩增，分别得到猪伪狂犬 病毒浊基因（引物为gB-F和浊-R)和巧基因（引物为巧-F和巧-R)的目的片段，2扣L反应体系 如下：
[00例表1浊基因和巧基因的PCR扩增体系 「00701
[0071] 2、标准品制备
[0072] 将纯化回收的猪伪狂犬病毒浊基因和巧基因目的片段分别克隆至pGEM-T载体(购 自Promega公司）中，构建成重组质粒，并筛选阳性重组质粒送华大基因公司测序，验证质粒 构建知否成功。测序结果表明获得了序列正确的分别携带gB基因和巧基因的重组质粒，分 别命名为pGEM-浊和pGEM-巧。
[0073] 3、双重实时巧光定量PCR标准曲线的建立
[0074] 对测序正确的分别携带gB基因和姐基因重组质粒pGEM-gB和pGEM-姐用化no化op 测定浓度，并计算各标准品的拷贝数，按照10倍梯度将gB基因和巧基因标准品分别稀释至1 X 1〇8、1 X 1〇7、1 X 1〇6、1 X 1〇5、1 X 1〇4、1 X 1〇3、1 X 1〇2、1 X l〇icopiesAiL，每个样品做2个重 复，W不同浓度的标准品作为模板，在引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时巧光定量 PCR检测。
[0075] 双重实时巧光定量PCR的反应体系（2化L)如下：
[0076] 表2浊基因和巧基因的双重实时巧光定量PCR反应体系 r00771
[007引双重实时巧光定量PCR的反应条件为:先95°C预变性2min;然后95°C变性15s，60°C 退火30s，45个循环。
[0079] 标准品的双重实时巧光定量PCR扩增曲线如图l(gB基因）和图3(姐基因）所示，标 准品扩增曲线为平滑的"S"形曲线，图中八组线条从左向右对应的标准品浓度分别为IX 108、lX107、lX106、lX105、lX104、lX103、lX102、lX10lcopiesA^L。检测结束后，W各标 准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线，标准曲线如图2(gB基因） 和图4(姐基因）所示，相关系数分别为R2 = 0.998与R2 = 0.993,误差较小，标准曲线可用，由 标准曲线得到的线性方程为：
[0080] y = -0.998X+37.806 (gB基因）和y = -0.993X+42.716 (gE基因）。
[0081 ] 4、猪伪狂犬病临床血清病料的双重实时巧光定量PCR检测
[0082] 用本发明建立的猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时巧光定量PCR检测试 剂与方法，对所收集的12份临床疑似血清病料进行检测，分别W灭活的猪伪狂犬病野毒株 细胞培养物和基因缺失株细胞培养物为阳性对照，W无酶水为阴性对照，根据gB基因和姐 基因双重实时巧光定量PCR检测结果，对临床样本所感染的猪伪狂犬病毒的类型进行判定， 并对所感染病毒的拷贝数进行定量。
[0083] 结果如表3所示，所检测的12份疑似血清中有2份血清判定为阴性(不含gB基因和 巧基因，即未感染猪伪狂犬病毒），10份血清判定为阳性(感染猪伪狂犬病毒），其中4份血清 为猪伪狂犬病野毒株感染(含浊基因和巧基因），6份血清为猪伪狂犬病基因缺失株感染(仅 含浊基因，缺失巧基因）。
[0084] 表3疑似血清病料的双重实时巧光定量PCR检测结果
[0085]
[0086]
[0087]实施例3、本发明检测方法的特异性实验
[008引按照实施例2所述方法对猪攝病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)提取RNA并进 行反转录，对猪圆环病毒2型(PCV2)、鼻气管炎病毒（IBR)直接提取DNA，同时W灭活的猪伪 狂犬病野毒株细胞培养物为阳性对照，W无酶水为阴性对照，在本发明引物和化qMan探针 的引导下进行双重实时巧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2，W验证该 方法的特异性。
[0089] 检测结果如图5所示，阳性对照gB基因和姐基因的CT值分别为20/21 (< 38 )，结果 阳性；阴性对照CT值为41/40( >38)，试验成立；而猪攝病毒（CSFV)、牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、鼻气管炎病毒（IBR)的CT值均>38,且未出现特定的扩增曲 线，结果阴性。检测结果表明用本发明的方法可特异性地检测出猪伪狂犬病野毒株。
[0090] 实施例4、本发明检测方法的灵敏度实验
[0091] 按照实施例2所述，将gB基因和姐基因标准品按照10倍梯度分别稀释至IX 108、1 X 1〇7、1 X 1〇6、1 X 1〇5、1 X 1〇4、1 X 1〇3、1 X 1〇2、1 X l〇icopiesAiL，W不同浓度的标准品作为 模板，在本发明引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时巧光定量PCR检测，PCR反应体系 及反应条件参照实施例2，W验证该方法的灵敏度。
[0092] 结果浊基因和巧基因的扩增曲线如图1和图3所示，显示gB基因和巧基因的双重实 时巧光定量PCR检测均可W检测至lXl〇icopiesAiL，灵敏度较高，与文献2检测灵敏度相 当。
[0093] 实施例5:鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时巧光定量PCR检测试剂 盒
[0094] 基于实施例1和2,本发明所提供的实时巧光定量PCR检测试剂盒，包括所述用于对 猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和巧基因进行双重实时巧光定量PCR检测的引物 和l^gMan探针。
[00M]具体来讲，该试剂盒包括W下用于25化双重实时巧光定量PCR反应体系的试剂:实 时巧光定量PCR反应液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(购于hkaRa公司），gB-F(20yM) 0.5化，gB-R(20yM) 0.5化，gE-F(20yM) 0.5化，gE-R(20yM) 0.5化，PRV-gB (1 OiiM) 1化，PRV-gE (10咖）1化，3臟-化66出0 6.5化。
[0096] 为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，阳性对照为猪伪狂犬病野 毒株基因组DNA和猪伪狂犬病毒基因缺失株基因组DNA或分别携带猪伪狂犬病野毒株gB基 因和姐基因的重组质粒pGEM-gB和pGEM-gE;阴性对照为不含猪伪狂犬病野毒株与基因缺失 株的反应体系，如出〇(双蒸水、无菌去离子水等）。
[0097] 试剂盒中各试剂的使用可参考实施例2的内容。
【主权项】
1. 用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量 PCR检测的引物，是基于猪伪狂犬病野毒株的gB基因的特异性保守序列自5'端第17411-17543位碱基和gE基因的特异性保守序列自5 '端第1060-1143位碱基作为检测序列，通过软 件设计得到。2. 根据权利要求1所述的引物，其特征在于：用于检测gB基因的上游引物(gB-F)的核苷 酸序列如序列表中SED ID ΝΟ:1所示，用于检测gB基因的下游引物(gB-R)的核苷酸序列如 序列表中SEQ ID NO:2所示；用于检测gE基因的上游引物(gE-F)的核苷酸序列如序列表中 SED ID NO:3所示，用于检测gE基因的下游引物（gE-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 4所示。3. 用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量 PCR检测的TaqMan探针(0F-P)，是基于猪伪狂犬病野毒株的gB基因的特异性保守序列自5 ' 端第17411-17543位碱基和gE基因的特异性保守序列自5'端第1060-1143位碱基作为检测 序列，通过软件设计得到。4. 根据权利要求3所述的TaqMan探针(0F-P)，其特征在于：用于检测gB基因的TaqMan探 针（PRV-gB)的核苷酸序列如序列表中SED ID N0:5所示，用于检测gB基因的TaqMan探针 (PRV-gE)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 6所示;所述探针为经过荧光标记的，其5 '端 标记有报告荧光基团，3 '端标记有淬灭荧光基团。5. 根据权利要求4所述的TaqMan探针(0F-P)，其特征在于:所述PRV-gB的报告荧光基团 为FAM，焚光淬灭基团为TAMRA;所述PRV-gE的报告荧光基团为R0X，焚光淬灭基团为BHQ2;为 防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3'端已经磷酸化处理。6. 用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量 PCR检测试剂盒，包括权利要求1或2和权利要求3或4或5所述的用于对猪伪狂犬病野毒株与 基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。7. 根据权利要求4所述的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒 包括以下用于25yL双重实时荧光定量PCR反应体系的试剂:实时荧光定量PCR反应液Premix Ex Taq(Probe qPCR) 12 · 5yL(购于TakaRa公司），gB-F(20yM)0 · 5yL，gB-R(20yM)0 · 5yL，gE-F (20μΜ)0·5yL，gE-R(20μΜ)0·5yL，PRV-gB(1ΟμΜ)lyL，PRV-gE(1ΟμΜ)1yL，RNA-free H20 6 · 5μ L〇8. 根据权利要求6或7所述的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于:所述试剂 盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为猪伪狂犬病野毒株基因组DNA和猪伪 狂犬病毒基因缺失株基因组DNA或分别携带猪伪狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重组质粒 pGEM-gB和pGEM-gE，所述阴性对照为不含猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的反应体系，如 H20(双蒸水、无菌去离子水等）。9. 权利要求6或7或8所述的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒的应用，该应用为对猪伪 狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行定性、定量检测，检测包括以下步骤： 1)建立标准曲线：将分别携带猪伪狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重组质粒pGEM-gB 和pGEM-gE作为标准品，分别10倍梯度稀释成1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 101拷贝（C〇pieS)AiL，以不同浓度的标准品作为模板，在权利要求1所述引 物和权利要求2或3所述TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，检测结束后， 以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线； 2) 提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在所述引物和TaqMan探针 的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测； 3) 用得到的CT值或荧光信号的变化实现对gB基因和gE基因定性检测，再根据荧光信号 的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含猪伪狂犬病毒gB基因和gE基因的拷贝 数，实现定量检测； 所述步骤1)和步骤2)中的25yL双重实时荧光定量PCR反应体系包括:模板2yL，实时荧 光定量PCR反应液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5yL，gB-F(20yM)0.5yL，gB-R(20yM)0.5y L，gE-F(20μΜ)0·5yL，gE-R(20μΜ)0·5yL，PRV-gB(ΙΟμΜ)lyL，PRV-gE(ΙΟμΜ)lyL，RNA-free H 20 6.5yL;双重实时荧光定量PCR反应条件为:先95°C预变性2min;然后95°C变性15s，60°C 退火30s，共45个循环。10.-种鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的方法，在权利要求9所述步骤后还包 括： 4) 结果判定： 结果判定方法1:阳性对照样品CT值<38,阴性对照样品CT值多38时试验成立，待测样 品CT值<38时判定结果为阳性，CT值多38时则判定结果为阴性，若样品中检测到猪伪狂犬 病毒的gB基因和gE基因均为阳性，则判定样品为猪伪狂犬病野毒株;若样品中检测到gB基 因为阳性，gE基因为阴性，则判定样品为猪伪狂犬病毒基因缺失株； 结果判定方法2:根据荧光信号的变化，对待测样品中的gB基因和gE基因进行定性检 测，同时出现gB基因和gE基因的荧光扩增曲线判定样品为猪伪狂犬病野毒株，只出现gB基 因荧光扩增曲线判定样品为猪伪狂犬病毒基因缺失株。
【文档编号】C12R1/93GK106048094SQ201610634845
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月3日 公开号201610634845.5, CN 106048094 A, CN 106048094A, CN 201610634845, CN-A-106048094, CN106048094 A, CN106048094A, CN201610634845, CN201610634845.5
【发明人】韩志玲, 张贵刚, 商晓桂, 郝鹏, 孔彩萍, 闫聪, 陈君彦, 刘国英, 范秀丽
【申请人】金宇保灵生物药品有限公司