一种同时检测四种呼吸道病毒的rt?pcr方法所用的四对上下游引物的制作方法
【专利摘要】一种同时检测四种呼吸道病毒的RT?PCR方法所用的四对上下游引物，属于生物工程技术领域。本发明结合无锡地区常见呼吸道病毒的流行特性，为建立一种能同时检测甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、副流感病毒Ⅰ型（PIVⅠ）和副流感病毒Ⅲ型（PIVⅢ）四种呼吸道病毒的多重PCR方法，提供四对上下游引物。该方法可以在一个反应体系中检测多种病毒，简化了实验过程，缩短了实验时间，降低了实验成本，提高了检测效率。
【专利说明】
-种同时检测四种呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四对上下 游引物
技术领域
[0001] -种同时检测四种呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四对上下游引物，属于生物工 程技术领域。
【背景技术】
[0002] 呼吸道疾病包括上、下呼吸道急、慢性感染，呼吸道变态反应性疾病等。其中急性 呼吸道感染最为常见，由急性呼吸道感染所引起的患者常表现为咳嗽、发热、四肢酸痛、流 涕、鼻塞、呼吸困难等症状。能够引起急性呼吸道感染的病原体种类繁多，包括细菌、病毒、 支原体、衣原体和真菌等，据统计，引起急性呼吸道感染80%W上是病毒性感染。
[0003] 目前，呼吸道病毒的实验室诊断主要包括病毒分离，血清学诊断，直接巧光抗体检 测W及核酸检测等方法。虽然病毒分离培养是呼吸道病毒感染诊断的"金标准"，但该方法 对设备技术的要求较高，耗时耗力，不能应用于临床早期诊断和疫情的快速处置。血清学诊 断则需采集急性期、恢复期的患者血液标本，只能起到回顾性诊断的作用，也不能应用于临 床早期诊断W及疫情的快速处置。直接巧光抗体检测虽然能在较短的时间内获得结果，但 特异性和灵敏度较低，判断具有一定的主观性，人力成本高。近年来，随着分子生物学技术 的不断发展核酸检测已广泛应用于临床病原学诊断，在普通PCR的基础上建立起来了多重 PCR核酸检测方法，该方法可W在一个反应体系中检测多种病毒，简化了实验过程，缩短了 实验时间，降低了实验成本，提高了检测效率。
[0004] 对于RT-PCR产物的检测方法主要有传统的琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳。琼脂糖 凝胶电泳是W琼脂或者琼脂糖为支持介质的一种电泳方法，需要人工配制凝胶，重复性差， 且对操作人员要求较高且耗时较长。而毛细管电泳分析，具有分辨率高、快速、需样量少、自 动等优点。
[0005] 基于此，本发明结合无锡地区常见呼吸道病毒的流行特性，建立一种能同时检测 甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病毒(FluB)、副流感病毒I型(PIVI)和副流感病毒虹型(PIV 虹）四种呼吸道病毒的多重PCR方法。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种同时检测四种呼吸道病毒的RT-PCR方法，及其所用的四对 上下游引物。建立起来了多重PCR核酸检测方法，该方法可W在一个反应体系中检测多种病 毒，简化了实验过程，缩短了实验时间，降低了实验成本，提高了检测效率。
[0007] 本发明的技术方案:一种同时检测四种呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四对上下 游引物； 引物设计:分别设计针对尸1^、尸1118、口1^和口1￥虹基因组保守区的4对引物如下：
设计的单一引物对病原的目标片段分别都能扩增出来的前提下，分别将四种引物的各 对上下游引物(4化M)按体积比1:1混合，再将引物FluA: FluB: PRI: PIV虹按体积比1:3:2: 2混合，混合后的引物作为本发明的使用引物;所述引物由上海生工生物工程股份有限公司 制备； 提取呼吸道标本的总核酸(DNA&RNA); PCR检测的反应体系为25化，包括化zyme Mix 1化，5 X buffer化L，dNTP 1化，混合后 的引物化L，待检模版5yL，水补充至25yL，待检模板为从呼吸道标本中提取的总核酸， Enzyme Mix、dNTP和5 X buffer为QIAGEN OneStep RT-PCR Kit试剂盒提供； PCR检测的反应程序为:50°C 30min;95°C 15min;94°C 变性30sec，50°C 退火30sec， 72°C 延伸lmin，35个循环；72°C lOmin。
[000引本发明的有益效果:本发明建立了一种能同时检测甲型流感病毒(FluA)、乙型流 感病毒(FluB)、副流感病毒I型(PIVI)和副流感病毒虹型(PIV虹）的RT-PCR方法所用的四对 上下游引物。该方法可W在一个反应体系中检测多种病毒，简化了实验过程，缩短了实验时 间，降低了实验成本，提高了检测效率。
【附图说明】
[0009]图1所得PCR产物用QIAxcel全自动毛细管电泳系统分析所得电泳图谱。M:Marker; 1:FluA+FluB+PIVI; 2:FluA+FluB+PIV虹；3:FluA+PIVI+PIV虹；4: FluB+PIVI+PIV虹；5: FluA+Fl地+PIVI+PIV虹；N:阴性对照。 【具体实施方式】 [0010] 实施例1 1、引物设计:分别设计针对尸1^、尸1118、口1^和口1￥虹基因组保守区的四对引物如下：
在设计的单一引物对病原的目标片段分别都能扩增出来的前提下，分别将四种引物的 各对上下游引物(4化M)按体积比1:1混合，再将引物FluA: FluB: PIVI: PIV虹按体积比1:3: 2:2混合，混合后的引物作为本发明的使用引物； 2、 提取呼吸道标本的总核酸(DNA&RNA); 3、 PCR检测的反应体系为25化，包括化巧me Mix 1化，5 X buffer化L，dNTP 1化，混合 后的引物化L，待检模版5yL，水补充至25yL，待检模板为从呼吸道标本中提取的总核酸； Enzyme Mix、dNTP和5 X buffer为QIAGEN OneStep RT-PCR Kit试剂盒提供； 4、 PCR检测的反应程序为50°C 30min;95°C 15min;94°C 变性30sec，50°C 退火30sec， 72°C 延伸lmin，35个循环；72°C lOmin; 5、 所得PCR产物用QIAxcel全自动毛细管电泳系统分析，所得电泳图谱如图1所示。
【主权项】
1. 一种同时检测四种呼吸道病毒的RT-PCR方法所用的四对上下游引物，其特征在于： 引物设计:分别设计针对FluA、FluB、PIVI和PIVm基因组保守区的四对引物如下： PIVI上游引物：5'-CCGGTAATTT CTCATACCTA TG-3'， PIVI下游引物:5'-CCTTGGAGCG GAGTTGTTAA G-3'，产物大小:317bp; PlVm上游引物：5'-CTCGAGGTTG TCAGGATATA G-3'， PlVm下游引物:5'-CTTTGGGAGT TGAACACAGT T-3'，产物大小：189bp; FluA上游引物：5 ' -TTCTAACCGA GGTCGAAACG-3 '， FluA下游引物：5'-ACAAAGCGTC TACGCTGCAG-3'，产物大小：230bp; FluB上游引物：5 ' -GGGACATGAA CAACAAAGAT GC-3 '， FluB下游引物：5'-TGTCAGCTAT TATGGAGCTG-3'，产物大小：425bp; 在设计的单一引物对病原的目标片段分别都能扩增出来，分别将四种引物的各对40μΜ 的上下游引物按体积比1:1混合，再将引物FluA:FluB: PIVI: PlVm按体积比1:3:2:2混合， 混合后的引物作为本发明的使用引物； 提取呼吸道标本的总核酸DNA&RNA; PCR检测的反应体系为25yL，包括Enzyme Mix lyL，5 X buffer 6yL，dNTP lyL，混合后 的引物4tiL，待检模版5tiL，水补充至25tiL，待检模板为从呼吸道标本中提取的总核酸， Enzyme Mix、dNTP和5 X buffer为QIAGEN OneStep RT-PCR Kit试剂盒提供； PCR检测的反应程序为：50°C 30min;95°C 15min;94°C 变性30sec，50°C 退火30sec， 72°C 延伸lmin，35个循环;72°C lOmin。
【文档编号】C12Q1/70GK106048096SQ201610671979
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月16日 公开号201610671979.4, CN 106048096 A, CN 106048096A, CN 201610671979, CN-A-106048096, CN106048096 A, CN106048096A, CN201610671979, CN201610671979.4
【发明人】马广源, 凌霞, 肖勇, 鲍静, 王若澜, 季亚勇, 吴家林
【申请人】无锡市疾病预防控制中心