一种实时荧光定量pcr检测番茄褪绿病毒的特异引物及方法
【专利摘要】本发明涉及一种实时荧光定量PCR检测番茄褪绿病毒的特异引物及方法。所述特异引物为一对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明中的检测引物基于ToCV CPm基因中的保守区域设计，通过在NCBI中进行比对分析，并结合克隆鉴定证明其具备较强的特异性，总体准确性高。
【专利说明】
-种实时黄光定量PCR检测番茄视绿病毒的特异引物及方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种实时巧光定量PCR检测番茄稱绿病毒的特异引物及方法，属于植 物保护和生物技术技术领域。
【背景技术】
[0002] 番茄稱绿病毒（Toma10 ch 1 or0S i S Virus , ToCV )，属于长线形病毒科 (Closteroviridae)毛形病毒属(Crinivirus)，是一类可侵染番茄、辣椒、烟草等多种作物 的RNA病毒。该病毒最早在20世纪90年代首次发现于美国佛罗里达州，现已蔓延至欧洲、非 洲、美洲、亚洲等世界多个地区。2004年，中国台湾首先报道了ToCV的发生，近年来，该病毒 成功入侵中国内陆并迅速蔓延，北京地区于2012年鉴定出其番茄和甜椒植株上带有该病 毒；随后，ToCV在山东省寿光、泰安、聊城、青岛等地发生；最新监测结果表明ToCV也已成功 扩散至山西、陕西、内蒙古和浙江等地的番茄种植区。ToCV发病率高，经烟粉風（Bemisia tabaci)、溫室白粉風（Trialeurodes vaporariorum)、纹翅粉風（Trialeurodes abuti lonea)传播，传播速度快，发病溫室内病株率达20 %-100 %，感病植株减产最高达 40%，给番茄等蔬菜生产造成了严重经济损失。
[0003] 植物病毒病素来被称为植物的"癌症"，早期监测、预警是防治其进一步扩散蔓延 的重要手段之一。因此，针对ToCV建立一种准确性强、灵敏度高的检测技术有助于在病毒侵 染初期(植株并未发病)完成早期诊断，提早防治，控制ToCV的暴发。检测植物病毒的方法多 种多样，分子生物学方法是目前已知类别植物病毒检测的常用手段，针对ToCV,采用比较多 的为普通PCR检测，检测灵敏度有限，无法满足病毒含量较低样本的准确诊断。
[0004] 中国专利文献CN103498010A(申请号201310474211.4)公开了一种快速检测番茄 稱绿病毒的引物，该引物包括上游引物和下游引物，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.4所 示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。该发明还公开了一种快速检测番茄稱绿病毒 的试剂盒，该试剂盒包括上述的上游引物和下游引物，W及常规PCR检测的常规试剂。该发 明提供的引物、试剂盒可W用于鉴定番茄稱绿病毒，W及检测待测样品中是否含有番茄稱 绿病毒。该技术方案基于常规PCR进行番茄稱绿病毒检测，在灵敏度方面低于实时巧光定量 PCR技术，此外在检测样本的过程中，只能对于病毒进行定性，而对于病毒具体拷贝数 (copy)无法做到定量。
[0005] 实时巧光定量PCR可满足低拷贝病毒的检测，而目前尚未有应用该方法进行ToCV 检测的报道。因此，十分有必要建立一种基于实时巧光定量PCR技术的灵敏、快速、准确检测 ToCV的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术的不足，提供一种灵敏、快速、可靠的鉴定检测番茄稱绿病毒 的方法。
[0007] 本发明技术方案如下：
[0008] -种实时巧光定量PCR检测番茄稱绿病毒的特异引物，该特异引物为一对，上游引 物的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 本发明所述的一对实时巧光定量PCR检测引物是根据NCBI数据库中ToCV次要外壳 蛋白（minor coat p;rotein,CPm)基因（AGN91010.1)的保守序列进行设计，并通过NCBI的 Pr imer-BLAST进行比对，保证引物的特异性。引物序列如下：
[0010] 上游引物ToCVqF:CTTTCTGGATGGTTTGCGGC;沈Q ID N0.1
[0011] 下游引物ToCVqR:TCCCCAACCAATGGTCGTTT;沈Q ID N0.2
[0012] -种实时巧光定量PCR检测番茄稱绿病毒的方法，包括如下步骤：
[OOU] (1)提取植株的总RNA;
[0014] (2)W植株的总RNA为模板，利用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA;
[0015] (3)W步骤(2)制得的cDNA为模板，利用上述特异引物进行PCR扩增，制得PCR扩增 产物；
[0016] (4)将步骤(3)制得的PCR扩增产物纯化后连接至载体，转入感受态细胞，筛选阳性 克隆，提取质粒获得ToCV标准品，并按梯度稀释，制备标准曲线；
[0017] (5似步骤(2)制得的cDNA为模板进行实时巧光定量PCR检测，根据检测得到的扩 增曲线、烙解曲线判定待测样品是否携带病毒，根据检测得到的Ct值并结合步骤(4)制得的 标准曲线计算待测样品的含病毒量。
[0018] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中，提取植株的总RNA，步骤如下：
[0019] 称取待检测的植株样品叶片0.05g，置于去除RNase的研鉢中，加入液氮并研磨后， 按照Trizol提取法的相关步骤进行叶片总RNA的提取(Trizol试剂购于赛默飞世尔公司。
[0020] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，反转录合成cDNA的步骤如下：
[0021 ]取化g总RNA样品，去除基因组DNA，然后用PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒(购自宝生物工程有限公司）进行反转录-聚合酶链式反应合成第一链 cDNA，反转录体系如下：
[0022] PrimeScript RT Enzyme Mix I ljiL、RT Primer Mix 1化、5 XPrimeScript Buffer 2(for Real Time)化L、RNase化ee d出0化L，去除基因组DNA的反应液10化；
[0023] 反转录条件:37°C反应15min，然后85°C反应5sec;置于-20°C保存。
[0024] 根据本发明进一步优选的，所述去除基因组DNA的反应体系如下：
[00巧]总RNA 2]iL、5X曲NA Eraser Buffer 化L、曲NA Eraser 化L、RNase Free 地2〇 5 化；
[00%] 反应条件:42°C反应2min。
[0027]根据本发明优选的，所述步骤(3)中，PCR反应体系如下：
[002 引 10XPCR Buffer(Mg2+plus)2.化L、dNTP Mixture 化L、上游和下游引物各 1化、 cDNA模板化L、r hq 0.2^iL、d地20 17.2扣レ
[0029] PCR反应程序如下：
[0030] 94 °C 预变性 3min; 94°C 变性 30s，60 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s，35 个循环；72 °C 后延 伸lOmin，置于4°C保存。
[0031 ]根据本发明优选的，所述步骤(4)中，标准曲线采用如下方法获得：
[0032] (i)将PCR产物经纯化后连接至载体pMD? 18-T Vector(购自宝生物工程有限公 司），然后转入大肠杆菌感受态细胞化ans 5a (购自北京全式金生物技术有限公司），37°C过 夜培养后，筛选阳性克隆，经测序正确，继续扩大培养，然后提取重组质粒；
[0033] (ii)测定质粒浓度，计算出质粒浓度拷贝数，作为ToCV质粒标准品使用，计算公 式：
[0034] C=A/BX6.02X1014
[0(X3日]A代表质粒浓度ng/化，B代表质粒DM分子量，C代表copies/化；
[0036] (iii)用DNase/RNase free water对ToCV质粒标准品按照10倍的浓度梯度进行稀 释，将终浓度为2.7 X 105-2.7X 109copiesAiL的5个质粒样品作为模板进行实时巧光定量 PCR;仪器自动生成标准曲线，扩增效率为98 %，相关系数R2 = 0.9913，直线方程为：
[0037] Y = -3.37Xlg(X)+44.27
[0038] Y代表循环阔值即Ct值，X代表质粒初始浓度。
[0039] 进一步优选的，所述步骤(iii)中，实时巧光定量PCR反应体系如下：
[0040] SYBR Premix Ex Taq? n 10化、上游引物1化、下游引物1化、质粒样品1化、 d 地
[0041] 实时巧光定量PCR反应程序为:95°C预变性2min;95°C变性153,60°(：退火3〇3,40个 循环。
[0042] 根据本发明优选的，所述步骤(5)中，实时巧光定量PCR反应体系如下：
[0043] SYBR Premix Ex Taq? II 10化、上游引物1化、下游引物liiUcDNA模板1化、 d 地
[0044] 实时巧光定量PCR反应程序为:95°C预变性2min;95°C变性153,60°(：退火3〇3,40个 循环。
[0045] 根据本发明优选的，所述步骤(5)中，根据检测得到的扩增曲线、烙解曲线判定待 测样品是否携带病毒的步骤如下：
[0046] 当特异扩增曲线中巧光吸收值有变化，则检测样品携带有病毒；如果特异扩增曲 线中巧光吸收值没有变化，则检测样品不携带病毒；
[0047] 当烙解曲线中出现单一特异吸收峰，则检测样品携带有病毒；如果烙解曲线中未 出现单一特异吸收峰，则检测样品不携带病毒；
[0048] 根据本发明优选的，所述步骤(5)中，计算待测样品的含病毒量的步骤为:将Ct值 代入步骤(4)制得的标准曲线中，计算待测样品的病毒拷贝数。
[0049] 有益效果
[0050] 1、本发明中的检测引物基于ToCV CPm基因中的保守区域设计，通过在NCBI中进行 比对分析，并结合克隆鉴定证明其具备较强的特异性，总体准确性高；
[0051] 2、本方法只需进行一轮实时巧光定量PCR反应，便可同时检测多个样品的携毒情 况，快速、高效;且比现有PCR检测灵敏度高100倍，保证了病毒含量较低样品的成功检测，提 高了带毒样品的总体检出率；
[0052] 3、本发明中所使用的均为分子生物学的常规试剂和材料，检测引物不需要特殊修 饰，相对于化qMan探针法等病毒检测方法，成本低廉。
【附图说明】
[0化3] 图1、使用ToCV检测引物(SEQ ID NO.l和沈Q ID ^.2)进行普通?0?扩增得到目的 片段的琼脂糖凝胶电泳图；
[0054] 图中：泳道M为DNA Maker DL2000,泳道1为感染ToCV的番茄样品，泳道2为阳性对 照，泳道3为阴性对照，泳道4为空白对照；
[0055] 图2、ToCV质粒标准品实时巧光定量PCR的标准曲线图；
[0056] 图中：纵坐标为循环阔值(Ct)，横坐标为质粒初始浓度的对数值，质粒标准品浓度 范围为2.7 X 1〇5-2.7 X l〇9copies/iiL;
[0057] 图3、田间样品实时巧光定量PCR检测结果曲线图；
[005引图中：i为扩增曲线图，A为阳性对照，B、C、D分别为田间样品1、2、3，E为阴性和空白 对照(重合）；
[0059] ii为烙解曲线图，A为阳性对照，B、C、D分别为田间样品1、2、3，E为阴性对照，F为空 白对照；
[0060] 图4、实时巧光定量PCR检测灵敏度曲线图；
[OOW]图中：曲线A-H分别为2.7 X 10心2.7 X 103copies/iiL的ToCV样品的扩增曲线，曲线 I为空白对照的扩增曲线。
[0062] 图5、PCR检测灵敏度电泳结果照片；
[0063] 图中：泳道M为DNA Maker DL2000,泳道 1-8分别为2.7Xl〇W-2.7Xl〇3copiesAiL 的ToCV样品，泳道9为空白对照；
[0064] 图6、对比实验PCR检测灵敏度电泳结果照片；
[0065] 图中：泳道M为DNA Maker DL2000，泳道1为阳性对照，泳道2-4分别为浓度稀释为 1〇-1-1〇-3的l^CV样品，泳道5为阴性对照；
[0066] 图7、对比实验实时巧光定量PCR检测灵敏度结果曲线图；
[0067] 图中：i为扩增曲线图，A为阳性对照，B、C、D分别为浓度稀释为的ToCV样 品，E为阴性对照；
[006引 i i为烙解曲线图，A为阳性对照，B、C、D分别为浓度稀释为1 0-1-1 0-3的ToCV样品，E 为阴性对照。
【具体实施方式】
[0069] 下面结合实施例和附图对本发明的原理和内容进行详细阐述，但本发明所保护范 围不限于此。
[0070] 实施例l、ToCV的RT-PCR扩增与克隆鉴定
[0071] (1)实时巧光定量检测引物的设计
[0072] 首先从NCBI数据库中检索得到ToCV次要外壳蛋白（minor coat protein,CRn)基 因（AGN91010.1)的碱基序列，根据其保守区域通过Primer 3.0设计定量检测引物，并通过 NCBI的Pr imer-BLAST进行比对，保证引物的特异性，从5对引物中筛选出1对。引物序列如 下：
[0073] 上游引物ToCVqF:CTTTCTGGATGGTTTGCGGC;沈Q ID N0.1
[0074] 下游引物ToCVqR:TCCCCAACCAATGGTCGTTT;沈Q ID N0.2 [00巧](2)感染ToCV番茄叶片的总RNA提取与RT-PCR扩增
[0076] 用体积百分比浓度为75%的乙醇消毒后的綴子分别剪取ToCV显症(叶脉间稱绿黄 化)番茄叶片、健康番茄叶片，分别称取〇.〇5g，置于去RNase的研鉢中，加入液氮并进行充分 研磨，将粉末转移至含有ImL Trizol的离屯、管中，充分震荡混匀，并根据化izol试剂说明书 的操作步骤，完成带毒叶片总RNA的提取(所用Trizol试剂购于赛默飞世尔公司）。
[0077] 分别取化g感染ToCV与健康番茄叶片的总RNA，运用PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)试剂盒(购自宝生物工程有限公司）进行RT-PCR合成第一链cDNA。
[007引首先进行基因组DNA的去除，10化反应体系中总RNA 2化、5X曲NA Eraser Buffer 化L、曲NA化aser化L、RNase化ee d出0扣L，轻柔混匀后42°C2min;
[0079] 其次进行反转录反应，将上述lOiiL反应液加入到W下体系中：
[0080] PrimeScript RT Enzyme Mix I ljiL、RT Primer Mix 1化、5 XPrimeScript Buffer 2(for Real Time)化L、RNase Rree 地2〇
[0081 ] 轻柔混匀后37 °C 15min，85 °C 5sec，反转录获得的第一链cDNA置于-20°C保存。
[0082] (3)ToCV基因片段克隆与鉴定
[0083] W反转录后的cDNA作为模板，使用（1)中所设计检测引物进行普通PCR扩增，其中 健康番茄植株cDNA为阴性对照，实验室保存的ToCV样品cDNA为阳性对照，d地2〇为空白对 照。
[0084] 反应为25化体系：
[00 化]10XPCR Buffer(Mg2+plus)2.化L、dNTP Mixture 化L、上游和下游引物各 1化、 cDNA模板化L、r hq 0.2^iL、d地2〇 17.2扣レ [00化]PCR反应程序为：
[0087] 94 °C 预变性 3min; 94°C 变性 30s，60 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s，35 个循环;72 °C 后延 伸lOmin;
[0088] 将样品置于4°C保存，W备电泳。将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1 所示。
[0089] 经PCR扩增后，感染ToCV番茄植株样品条带同阳性对照在同一位置(230bp)，初步 预测为目的条带，将其切下后，使用hKaRa Mini肥ST Agarose G化DNA Extraction Kit (购自宝生物工程有限公司）试剂盒进行回收，将纯化后的P C R产物连接至p M D ? 18 - T Vector(购自宝生物工程有限公司）后，将连接有目的基因的载体转入大肠杆菌感受态细胞 Trans 5a(购自北京全式金生物技术有限公司），37°C过夜培养后，进行蓝白斑筛选后，挑取 白色的单菌落放入含有氨节青霉素的液体培养基中进行培养，37°C振荡(220rpm/min)培养 化后，用特异引物ToCVqF与ToCVqR进行菌液检测，将阳性克隆菌液送至英潍捷基(上海）贸 易有限公司进行测序，并将核巧酸序列在NCBI上进行BLASTn比对，结果证实该序列为ToCV 〔口111基因片段，测序结果如56〇10^.3所示。
[0090] 实施例2、ToCV质粒标准品的制备与标准曲线的制作
[0091] 根据测序结果，选择序列完全正确的阳性克隆菌液样品，放入含有氨节青霉素的 液体培养基中继续扩大培养，37 °C振荡（220巧m/min)过夜后，根据说明书使用TIANprep Mini Plasmid Kit(购自天根生化科技有限公司）完成ToCV质粒的提取。
[0092] 使用核酸蛋白浓度测定仪测定质粒浓度后，经公式：
[OOW] C=A/BX6.02X1014
[0094] A代表质粒浓度ng/化，B代表质粒DM分子量，C代表copies/化；
[00M]计算出质粒浓度拷贝数，即作为ToCV质粒标准品使用。
[0096] 用測ase/RNase打ee water对质粒标准品按照10倍的浓度梯度进行稀释，将终浓 度为2.7 X 105-2.7 X 109copiesAiL的5个质粒样品作为模板。反应采用20化体系，包括SYBR Premix Ex Taq? II 10化、上游和下游引物各化L、cDNA模板化L、dd出0化L。
[0097] 其中SYBR巧光染料购自宝生物工程有限公司。
[009引实时巧光定量PCR采用两步法，程序为:95°C预变性2min;95°C变性15s，60°C退火 30s，40个循环。
[0099] 仪器自动生成标准曲线（图2)，扩增效率为98%，相关系数R2 = 0.9913,直线方程 为：
[0100] Y = -3.37Xlg(X)+44.27
[0101 ] Y代表循环阔值即Ct值，X代表质粒初始浓度。
[0102] 实施例3、田间植株检测
[0103] 从田间采集疑似ToCV感染的番茄叶片，按照实施例1中的方法提取RNA并反转录合 成第一链cDNA，按照实施例2中的方法进行实时巧光定量PCR，结合扩增曲线、烙解曲线和Ct 值可W确定来自田间的S份样品均携带ToCV,结果如图3所示。
[0104] 根据实施例2中的标准曲线可最终计算出待测样品含毒量，=份样品分别携带 ToCV的病毒数为 1.47 X l〇6c〇piesAiL、3.48 X l〇5copiesAiL、2.65 X l〇5copies/iiL。
[0105] 实施例4、灵敏度检测
[0106] 将质粒标准品按照梯度稀释成2.7 X l〇W-2.7 X 103copiesAiL的9个样品，分别作 为模板进行实时巧光定量PCR和普通PCR，比较运两种检测方法的灵敏度。结果表明实时巧 光定量PCR能够检测到2.7 X 103copies/化的病毒样品，结果如图4所示;而普通PCR仅能够 检测到2.7 X 105copiesAiL的病毒样品，结果如图5所示；
[0107] W上结果表明实时巧光定量PCR方法的检测灵敏度比普通PCR方法检测提高了100 倍。
[010引对比例、比较专利文献CN103498010A(申请号201310474211.4)和本发明中的方法 检测ToCV的灵敏度
[0109] 取感染ToCV番茄叶片，按照实施例1中的方法提取RNA并反转录合成第一链cDNA， 并按照10倍梯度依次稀释得到10^、10^、10可勺立个样品，作为两种方法检测的模板。
[0110] (1)专利文献CN103498010A(申请号201310474211.4)中的方法检测ToCV
[0111] 按照专利文献CN103498010A(申请号201310474211.4)中的方法，引物使用其筛选 得到的第S对引物，序列如下：
[0112] 上游引物T〇CV(CN10：M98010A)F:TCTGCACCGAGAATAAATGAACG;SEQ ID N0.4
[0113] 下游引物T〇CV(CN103498010A)R:CACCAAAGCATCCACCAAAACG;SEQ ID N0.5
[0114] 反应体系按照其最优条件，反应体系：
[0115] d地2〇1 祉L、10XPCR 6证'6八]\%2+91113)2.5化、(1^?(1〇111111〇1/1)1.0化、上游和下游 引物ToCV(CN103498010A)F/R(10mmol/L)各0.化L、模板2.0化和TaqDNApolymerase (10mmol/L)0.5 化组成。
[0116] 反应程序为；
[0117] 94°C 预变性 3min;94°C 变性 30s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 7〇3,30个循环;72°(：后延 伸lOmin。
[0118] 待反应结束后将PCR样品进行琼脂糖凝胶电泳。结果发现仅稀释浓度为l(Ti的样品 和阳性对照一样，在l〇74bp处有特异条带，其余样品均未出现条带，结果如图6所示。说明该 方法仅能检测到稀释浓度为l(Ti的病毒样品。
[0119] (2)本发明中的方法检测ToCV
[0120] 按照本发明中的实施例2中的方法对样本进行实时巧光定量PCR检测，结果发现稀 释浓度为i(Ti、i(r2、i(r3的=个样品同阳性对照一样均表现出良好的扩增曲线（如图7i所 示)和特异烙解峰(如图7ii所示），其Ct值分别为18.48、24.15、29.81。说明该方法能够检测 到稀释浓度为1(T3的病毒样品。
[0121] 综合比较上述两种检测方法，本发明的检测灵敏度至少高于CN103498010A(申请 号201310474211.4)中的方法100倍，并且通过Ct值和标准曲线，能够精确计算出样本中病 毒的拷贝数。
【主权项】
1. 一种实时荧光定量PCR检测番茄褪绿病毒的特异引物，其特征在于，该特异引物为一 对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所 不。2. -种实时荧光定量PCR检测番茄褪绿病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 提取植株的总RNA; (2) 以植株的总RNA为模板，利用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA; (3) 以步骤⑵制得的cDNA为模板，利用上述特异引物进行PCR扩增，制得PCR扩增产物； (4) 将步骤(3)制得的PCR扩增产物纯化后连接至载体，转入感受态细胞，筛选阳性克 隆，提取质粒获得ToCV标准品，并按梯度稀释，制备标准曲线； (5) 以步骤(2)制得的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，根据检测得到的扩增曲 线、熔解曲线判定待测样品是否携带病毒，根据检测得到的Ct值并结合步骤(4)制得的标准 曲线计算待测样品的含病毒量。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中，提取植株的总RNA，步骤如 下： 称取待检测的植株样品叶片〇.〇5g，置于去除RNase的研钵中，加入液氮并研磨后，按照 Trizol提取法的相关步骤进行叶片总RNA的提取。4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中，反转录合成cDNA的步骤如 下： 取lyg总RNA样品，去除基因组DNA，然后用PrimeScript RT reagent Kit试剂盒进行反 转录-聚合酶链式反应合成第一链cDNA，反转录体系如下： PrimeScript RT Enzyme Mix I lyL、RT Primer Mix lyL、5XPrimeScript Buffer 2 4yL、RNase Free dH20 4yL，去除基因组DNA的反应液 10yL; 反转录条件:37°C反应15min，然后85°C反应5sec; 进一步优选的，所述去除基因组DNA的反应体系如下： 总RNA 2yL、5XgDNA Eraser Buffer 2yL、gDNA Eraser lyL、RNase Free dH2〇 5yL; 反应条件:42°C反应2min。5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤⑶中，PCR反应体系如下： 10XPCR Buffer 2.5yL、dNTP Mixture 2yL、上游引物lyL、下游引物lyL、cDNA模板 1μ L、r Taq 0.25yL、ddH2〇 17.25yL; PCR反应程序如下： 94°C预变性3min;94°C变性3〇8,60°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,35个循环；72°(：后延伸 10min〇6. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，标准曲线采用如下方法获 得： (i) 将PCR产物经纯化后连接至载体pMD? 18-T Vector，然后转入大肠杆菌感受态细胞 Trans 5a，37°C过夜培养后，筛选阳性克隆，经测序正确，继续扩大培养，然后提取重组质 粒； (ii) 测定质粒浓度，计算出质粒浓度拷贝数，作为ToCV质粒标准品使用，计算公式： C=A/BX6.02X1014 A代表质粒浓度ng/yL，B代表质粒DNA分子量，C代表copies/yL; (iii)用DNase/RNase free water对ToCV质粒标准品按照10倍的浓度梯度进行稀释， 将终浓度为2.7 X 105-2.7 X 109c〇pieSAiL的5个质粒样品作为模板进行实时荧光定量PCR; 仪器自动生成标准曲线，扩增效率为98%，相关系数R 2 = 0.9913，直线方程为： Y = -3.37Xlg(X)+44.27 Y代表循环阈值即Ct值，X代表质粒初始浓度。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（i i i)中，实时荧光定量PCR反应体 系如下： SYBR Premix Ex Taq? II 10yL、上游引物lyL、下游引物lyL、质粒样品lyL、ddH207yL; 实时荧光定量PCR反应程序为：95°C预变性2min; 95°C变性15s，60°C退火30s，40个循 环。8. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，实时焚光定量PCR反应体系 如下： SYBR Premix Ex Taq? II 10yL、上游引物lyL、下游引物lyL、cDNA模板lyL、ddH207yL; 实时荧光定量PCR反应程序为：95°C预变性2min; 95°C变性15s，60°C退火30s，40个循 环。9. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，根据检测得到的扩增曲线、 熔解曲线判定待测样品是否携带病毒的步骤如下： 当特异扩增曲线中荧光吸收值有变化，则检测样品携带有病毒；如果特异扩增曲线中 荧光吸收值没有变化，则检测样品不携带病毒； 当熔解曲线中出现单一特异吸收峰，则检测样品携带有病毒；如果熔解曲线中未出现 单一特异吸收峰，则检测样品不携带病毒。10. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，计算待测样品的含病毒量 的步骤为:将Ct值代入步骤(4)制得的标准曲线中，计算待测样品的病毒拷贝数。
【文档编号】C12Q1/68GK106048097SQ201610674736
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月15日 公开号201610674736.6, CN 106048097 A, CN 106048097A, CN 201610674736, CN-A-106048097, CN106048097 A, CN106048097A, CN201610674736, CN201610674736.6
【发明人】丁天波, 褚栋, 张桂健, 李洁, 姜德锋
【申请人】青岛农业大学