检测马铃薯s病毒的成套试剂及其在利用数字pcr检测马铃薯s病毒中的应用

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检测马铃薯s病毒的成套试剂及其在利用数字pcr检测马铃薯s病毒中的应用
【专利摘要】本发明公开了检测马铃薯S病毒的成套试剂及其在利用数字PCR检测马铃薯S病毒中的应用。本发明公开的检测马铃薯S病毒的成套试剂,由名称为X1的引物对和名称为PVS?p的探针组成;X1由PVS?f和PVS?r组成;PVS?f是序列表中序列1所示的单链DNA;PVS?r是序列表中序列2所示的单链DNA;PVS?p的序列为序列表中序列3,PVS?p的5'端由FAM标记,3'端由TAMRA标记。实验证明,本发明的检测马铃薯S病毒的成套试剂可用于特异性数字PCR,并且特异性好、灵敏度高(灵敏度可达15拷贝/μL),适用于潜隐病症和病毒含量低的样品中PVS的检测。
【专利说明】
检测马铃善s病毒的成套试剂及其在利用数字PCR检测马铃善 S病毒中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域中检测马铃馨S病毒的成套试剂及其在利用数字PCR检 测马铃馨S病毒中的应用。
【背景技术】
[0002] 马铃馨S病毒病(potato virus S,PVS)是马铃馨的主要病毒病之一,我国马铃馨 种植区普遍发生,且危害较严重。PVS单独侵染一般不表现症状,但可导致马铃馨减产10 % - 20 %,与其他病毒混合侵染,可减产20 % -30 % dPVS易通过汁液传播,接触传染是自然传播 的主要途径,也可通过晒虫进行非持久性传播。感染PVS病毒的马铃馨植株常产生小块茎, 并通过块茎无性繁殖进行世代积累和传递,致使块茎种性变劣,产量不断下降。
[0003] 由于马铃馨S病毒病症潜隐难W辨认,同时在种馨脱毒过程中脱毒率通常较低。为 保证种馨质量,要求在脱毒种馨生产中要有严格的检测。目前,针对PVS主要采用指示植物 和酶联免疫法化LISA)等方法进行检测,ELISA虽然可W在短时间内检测大量样品,但该方 法存在标准阳性对照较难获得,相对费用低的抗血清种类不全,检测灵敏度低及整个实验 操作流程较复杂等因素的限制。RT-PCR技术相对于血清检测法不用制备抗体,而且省时又 省力,已经用于PVS的检测,但对病毒浓度低的样品(如初皮部样品和休眠未出芽或自然老 的块茎)却不足W做出可靠的诊断。
[0004] 数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的PCR检测方法,其基本原理是通过将微量样 品进行大倍数稀释和分液,直至每个样品中所含有的待测分子数不超过1个,再将所有样品 在相同条件下进行PCR扩增,有PCR扩增巧光信号记为1,无巧光信号记为0,有巧光信号的反 应单元中至少包含一个拷贝的目标分子,针对反应结果采用泊松分布(Poisson distribution)公式,便可计算出样本的最初拷贝数或浓度。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何检测马铃馨S病毒。
[0006] 为解决上述技术问题,本发明首先提供了检测马铃馨S病毒的成套试剂。
[0007] 本发明所提供的检测马铃馨S病毒的成套试剂,由名称为XI的引物对和名称为 PVS-P的探针组成;所述XI由PVS-f和PVS-r组成;
[000引所述PVS-f是如下al)至曰4)中的任一种单链DNA:
[0009] al)序列表中序列1所示的单链DNA;
[0010] a2)在al)的5/端和/或y端添加一个或几个核巧酸得到的单链DNA;
[001。 曰3)与al)或曰2)限定的单链DNA具有85 % W上的同一性的单链DNA;
[001^日4化严格条件下与al)或日2)限定的单链DNA杂交的单链DNA;
[OOU] 所述PVS-r是如下bl)至b4)中的任一种单链DNA:
[0014] bl)序列表中序列2所示的单链DNA;
[0015] b2)在bl)的5/端和/或y端添加一个或几个核巧酸得到的单链DM;
[0016] b3)与bl)或b2)限定的单链DM具有85% W上的同一性的单链DM;
[0017] b4化严格条件下与bl)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA;
[0018] 所述PVS-P的序列为如下cl)至c4)中的任一种序列:
[0019] cl)序列表中序列3的序列;
[0020] c2)在cl)的5/端和/或y端添加一个或几个核巧酸得到的序列;
[0021] c3)与cl)或c2)限定的序列具有85% W上的同一性的序列;
[0022] c4)在严格条件下与cl)或c2)限定的序列杂交的序列。
[0023] 上述成套试剂中,曰2)所述在al)的5/端和/或3/端添加一个或几个核巧酸得到的 单链DNA为在序列1所示的单链DNA的5/端和/或3/端添加一至十个核巧酸得到的单链DNA。 b2)所述在bl)的5/端和/或y端添加一个或几个核巧酸得到的单链DNA为在序列2所示的单 链DNA的5/端和/或y端添加一至十个核巧酸得到的单链DNAdc2)所述在cl)的5/端和/或y 端添加一个或几个核巧酸得到的序列为在序列3所示的序列的5/端和/或3/端添加一至十 个核巧酸得到的序列。
[0024] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的序列1、序列2或序列3所示的核巧酸序列具有85%或更高,或90%或更高,或95%或更 高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件,两个 或多个序列之间的同一性可W用百分比(% )表示,其可W用来评价相关序列之间的同一 性。
[0025] 上述成套试剂中,所述严格条件是在2XSSC,0.1%SDS的溶液中,在68°C下杂交并 洗膜2次,每次5min,又于0.5 X SSC,0.1 % SDS的溶液中,在68 °C下杂交并洗膜2次,每次 15min;或,0.1 X SS阳(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中,65°C条件下杂交并洗膜。
[0026] 上述85% W上同一性,可为85%、90%或95% W上的同一性。
[0027] 上述成套试剂中,所述PVS-P的两端可被巧光染料标记。具体可为:所述PVS-P的5' 端由FAM标记,和/或,所述PVS-p的3 '端由TAMRA标记。
[0028] 上述成套试剂中,所述PVS-f、所述PVS-r和所述PVS-p均可独立包装。所述PVS-f和 所述PVS-r的摩尔比可为1:1。
[0029] 为解决上述技术问题,本发明还提供了检测马铃馨S病毒的引物对。
[0030] 本发明所提供的检测马铃馨S病毒的引物对,为所述XI。
[0031] 所述XI的两条单链DNA可独立包装。其中,所述PVS-f、所述PVS-r和所述PVS-p的摩 尔比可为2:2:1。
[0032] 为解决上述技术问题,本发明还提供了检测马铃馨S病毒的系统。
[0033] 本发明所提供的检测马铃馨S病毒的系统,包括所述成套试剂或所述引物对。
[0034] 上述系统,还可包括进行RNA逆转录和/或数字PCR检测马铃馨S病毒所需的试剂和 仪器。具体来说,检测马铃馨S病毒的系统可包括所述成套试剂W及进行RNA逆转录和/或数 字PCR所需要的其它试剂和仪器。
[0035] 所述系统具体可由所述成套试剂和Ml组成,所述Ml为Mia和/或mb,所述Mia为进 行RNA逆转录所需的试剂和/或仪器,所述mb进行数字PCR所需的试剂和/或仪器。
[0036] 所述成套试剂中的各单链DNAW及进行RNA逆转录所需要的其它试剂、进行数字 PCR所需要的其它试剂均可独立包装。
[0037] 进行RNA逆转录所需要的其它试剂可为化kara公司的逆转录试剂盒中试剂。
[0038] 进行数字PCR所需要的其它试剂可为数字PCR扩增SuperMix、数字PCR微滴生成卡 和微滴生成用油。数字PCR扩增S叫erMix、数字PCR微滴生成卡和微滴生成用油均可为Bio- Rad产品。进行数字PCR所需要的仪器可为数字PCR反应系统,如Bio-Rad数字PCR反应系统 (Bio-Rad QX200)。
[0039] 为解决上述技术问题,本发明还提供了下述任一方法:
[0040] 1)所述成套试剂的制备方法,包括将所述成套试剂中各单链DNA独立包装;
[0041] 2)所述引物对的制备方法,包括将所述引物对中两条单链DNA独立包装;
[0042] 3)所述系统的制备方法,包括将所述成套试剂中各单链DNA独立包装。
[0043] 为解决上述技术问题,本发明还提供了检测马铃馨S病毒的方法。
[0044] 本发明所提供的检测马铃馨S病毒的方法,包括A1)或A2):
[0045] A1)利用所述成套试剂对待测样品进行数字PCR,根据反应结果中扩增微滴的有无 确定所述待测样品是否为马铃馨S病毒或是否含有马铃馨S病毒:如有扩增微滴,所述待测 样品为或候选为马铃馨S病毒或所述待测样品含有或候选含有马铃馨S病毒;如无扩增微 滴,所述待测样品不为或候选不为马铃馨S病毒或所述待测样品不含有或候选不含有马铃 馨S病毒;
[0046] A2)利用所述XI中对待测样品进行PCR扩增,根据扩增产物的有无确定所述待测样 品是否为马铃馨S病毒或是否含有马铃馨S病毒。
[0047] 上述检测马铃馨S病毒的方法中,进行所述数字PCR的体系包括:数字PCR扩增 SuperMix、所述PVS-f、所述PVS-r、所述PVS-p和所述待测样品。所述体系中所述PVS-f、所述 PVS-r和所述PVS-P的摩尔比可为2:2:1。
[004引所述体系可为体系1或体系2。所述体系1可为:2 X数字PCR扩增SuperMix 1化L,所 述PVS-f (所述PVS-f在所述体系1中的浓度可为0.4-0.5測,所述PVS-r (所述PVS-r在所述体 系1中的浓度可为0.4-0.5測,所述PVS-P (所述PVS-P在所述体系1中的浓度可为0.2-0. 所述待测样品,超纯水补至20化。所述体系2可为向所述体系1中加入70化的数字PCR反应用 油得到的体系。2 X数字PCR扩增SuperMix和数字PCR反应用油均可为Bio-Rad产品。
[0049] 上述检测马铃馨S病毒的方法中,进行所述数字PCR和所述PCR扩增的退火溫度均 可为58°C。进行所述数字PCR和所述PCR扩增的退火条件具体均可为58°C60s。
[0050] 所述数字PCR的扩增程序可为:50°C热激活5min;95°C预变性5min;40个循环:95°C 变性15s,58°C退火及延伸60s。
[0051 ] 所述数字PCR的扩增具体可在数字PCR反应系统中进行,如Bio-Rad数字PCR反应系 统(Bio-Rad QX200)。
[0052] 上述检测马铃馨S病毒的方法中,所述扩增微滴可为被进行数字PCR所需要的仪器 判定为阳性微滴的微滴。
[0053] 为解决上述技术问题,本发明还提供了所述成套试剂,所述引物对,或所述系统的 下述al)-a4)任一种中的应用:
[0054] al)在检测马铃馨S病毒中的应用;
[0055] a2)在制备检测马铃馨S病毒产品中的应用;
[0056] a3)在利用数字PCR检测马铃馨S病毒中的应用;
[0057] a4)在制备利用数字PCR检测马铃馨S病毒产品中的应用。
[0058] 本发明针对马铃馨S病毒设计检测马铃馨S病毒的成套试剂,包括扩增引物和探 针,该成套试剂可用于特异性数字PCR,本发明并基于该成套试剂建立了马铃馨S病毒的数 字PCR检测方法,该方法可对马铃馨S病毒进行定性检测。通过实验证明:本发明的检测马铃 馨S病毒的成套试剂特异性好(可从马铃馨S病毒、马铃馨X病毒、马铃馨Y病毒、黄瓜花叶病 毒和烟草花叶病毒中特异鉴定出马铃馨S病毒)、灵敏度高(灵敏度可达15拷贝/化),适用于 潜隐病症和病毒含量低的样品中PVS的检测。
【附图说明】
[0059] 图1为检测马铃馨S病毒的成套试剂数字PCR特异性检测结果。其中,B03:马铃馨S 病毒(PVS);C03、D03:马铃馨X病毒(PVX);E03、F03:马铃馨Y病毒(PVY);G03、朋3:烟草花叶 病毒(TMV) ;A04、B04:黄瓜花叶病毒(CMV) ;C04:阴性对照(NC) ;D04:空白对照(BC)。
[0060] 图2为检测马铃馨S病毒的成套试剂数字PCR灵敏度检测结果。其中,E04、F04:l〇-2; G04、H04: 10-3;A05、B05: 10-4;C05、D05: 10-5;E05、F05: 10-6;G05、朋5: 10-7;A06、B06:阴性对 照(NC); C06、D06:空白对照(BC)。
【具体实施方式】
[0061] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐 明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
[0062] 下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
[0063] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0064] 下述实施例中的实时巧光一步RT-PCR试剂盒One Step PrimeScript? RT-PCR Kit(Perfect Real Time)是hkara公司的产品,产品目录号为RR064A。
[0065] 下述实施例中的马铃馨S病毒(Potato Virus S)在文献"田永蕾,张永江,刘冬梅, 刘梅,马占鸿,李明福,陈洪俊.马铃馨病毒疫情调查及马铃馨S病毒的检测鉴定[J].安徽农 业科学,2009,37 (3): 1001-1002中公开过,公众可从
【申请人】处获得。
[0066] 下述实施例中的马铃馨X病毒(Potato Virus X)在文献"魏梅生,刘洪义,李桂芬, 陈燕芳.马铃馨X病毒和马铃馨Y病毒胶体金免疫层析试纸条的研制[J].植物保护,2006,32 (6): 139-141中公开过,公众可从
【申请人】处获得。
[0067] 下述实施例中的马铃馨Y病毒(Potato Virus Y)在文献"魏梅生,刘洪义,李桂芬, 陈燕芳.马铃馨X病毒和马铃馨Y病毒胶体金免疫层析试纸条的研制[J].植物保护,2006,32 (6): 139-141中公开过,公众可从
【申请人】处获得。
[0068] 下述实施例中的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus)在文献"张永江,马荣群, 辛言言,黄粤.烟草花叶病毒属条形码鉴定方法的建立[J].湖北农业科学,2015,54(11): 2624-2627中公开过,公众可从
【申请人】处获得。
[0069] 下述实施例中的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus)在文献"李桂芬,朱水 芳,周群,施宗伟,张永江,李明福.侵染紫松果菊的黄瓜花叶病毒分离物鉴定[J].植物保护 2007,33 (1) 54-56中公开过,公众可从
【申请人】处获得。
[0070] 实施例1、检测马铃馨S病毒的成套试剂的制备
[0071] 检测马铃馨S病毒的成套试剂由引物对XI和探针PVS-P组成,引物对XI由正向引物 PVS-f(5'-CTCAC AATGC CCACA AGAGT ATG-3'(序列表中序列 1))和反向引物口¥5寸(5'- TCCCT CCAGT GTACT CAACA TTAG-3'(序列表中序列2))组成;探针PVS-p(5'-FAM-ACAAG TCGAA CAGAA ATGAG CGATT GGCC-TAMRA-3')的序列如序列表中序列3所示,探针PVS-p的5' 端由FAM标记,3 '端由TAMRA标记。
[0072] 检测马铃馨S病毒的成套试剂中的PVS-f、PVS-r与PVS-P分别独立包装,引物对XI 中PVS-f与PVS-r的摩尔比为1:1。
[0073] 实施例2、马铃馨S病毒数字PCR检测方法的建立
[0074] 1、实验材料
[007引本实施例中使用的马铃馨S病毒(PVS)、马铃馨X病毒(PVX)、马铃馨Y病毒(PVY)、烟 草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)均由中国检验检疫科学研究院提供。反转录试剂盒 PrimeScript? RT reagent Kit(Perfect Real Time)为hkara公司产品,RR037A;数字PCR 相关反应试剂耗材为美国Bio-Rad公司产品,包括SuperMix、数字PCR微滴生成卡(Droplet Generator Cartridge微滴生成卡)和数字PCR反应用油;Bio-Rad数字PCR反应系统(Bio- Rad QX200) 为美国Bio-Rad 公司产品 ,包括 PCR 仪、 Droplet Generator 微滴生成器与 Droplet Reader微滴读取仪。
[0076] 2、样品总RNA提取
[0077] 参照试剂盒操作(植物总RNA提取试剂盒,天根生物科技有限公司,货号为DP432) 分别提取感染了马铃馨S病毒的马铃馨叶片、感染了马铃馨X病毒的马铃馨叶片、感染了马 铃馨Y病毒的马铃馨叶片、感染了烟草花叶病毒的烟草叶片及感染了黄瓜花叶病毒的黄瓜 叶片的总RNA。
[007引 3、数字PCR扩增反应
[0079] (1)逆转录反应按照逆转录试剂盒操作说明,单引物反应采用反向引物PVS-r将样 品RNA逆转录成cDNA;
[0080] (2)数字PCR体系的配置:Bio-Rad数字PCR平台反应体系总体积为20化,组分包括 数字PCR扩增S叩erMix、上下游引物W及探针和模板cDNAd20化数字PCR体系为:2X SuperMix 10化,实施例1的PVS-f及PVS-r(浓度均为10山〇各化L,实施例1的探针PVS-p(10ii M)0.扣L,步骤(1)的模板cDNA化L,超纯水补至20化;设置阴性对照与空白对照,阴性对照 中的模板用健康马铃馨RNA替换,空白对照中的模板用RNase化ee d出0替换;
[0081 ] (3)体系配置完成后,将反应体系转移至化oplet Generator Cartridge微滴生成 卡的体系加样孔中,并在反应用油加样孔中加入70化的数字PCR反应用油,在加样过程中, 应避免在孔底产生气泡;
[0082] (4)加样完成后,将微滴生成卡转移至化oplet Generator微滴生成器中,启动仪 器;
[0083] (5)微滴生成结束后,将生成完成后的微滴体系转移至96孔板中,封膜;
[0084] (6)将96孔板置于PCR仪中,PCR扩增程序为50°C热激活5min;95°C预变性5min;40 个循环:95°C变性15s,58°C退火及延伸60s。扩增结束后,将96孔板取出,置于化oplet Reader微滴读取仪中进行微滴巧光读取;
[0085] (7)通过FAM单通道巧光收集单个微滴巧光信号,巧光采集后,通过分析热点图确 定巧光阔值限W确定阴性微滴和阳性微滴;
[0086] (8)结果判断:反应结束后,根据不同病毒是否产生阳性微滴判断检测马铃馨S病 毒的成套试剂的特异性;根据不同梯度稀释样品扩增是否产生的阳性微滴数判断检测马铃 馨S病毒的成套试剂的灵敏度。
[0087] 实施例3、检测马铃馨S病毒的成套试剂的特异性检测 [008引 1、RNA的提取
[0089] 参照实施例2的步骤2中的RNA的提取方法,分别提取了感染了马铃馨S病毒的马铃 馨叶片、感染了马铃馨X病毒的马铃馨叶片、感染了马铃馨Y病毒的马铃馨叶片、感染了烟草 花叶病毒的烟草叶片及感染了黄瓜花叶病毒的黄瓜叶片的总RNA。
[0090] 2、数字PCR扩增
[0091] 分别W步骤1获得的各总RNA为模板,同时设置阴性对照(NC)和空白对照(BC);按 照实施例2的步骤3的数字PCR扩增反应方法进行数字PCR扩增。
[0092] 3、结果分析
[0093] 数字PCR特异性结果如图1所示。从图1中可W看出,只有马铃馨S病毒样品存在阳 性微滴,其它对照病毒样品、阴性对照和空白对照均无阳性微滴,此时判定为阳性微滴的的 巧光阔值限为1600,低于1600的微滴仪器判断为阴性,高于1600的微滴仪器判断为阳性;说 明本发明的检测马铃馨S病毒的成套试剂的特异性高。
[0094] 实施例4、检测马铃馨S病毒的成套试剂的灵敏度检测
[00M] 1、RNA的提取及梯度稀释模板制备
[0096] 参照实施例2的步骤2中的RNA的提取方法,从感染了马铃馨S病毒的马铃馨叶片中 提取总RNA,将总RNA进行10*\1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇- 5、1〇-6和1〇-7稀释后用作模板进行灵敏 度检测。
[0097] 2、数字PCR扩增
[009引分别W步骤1获得的10-2、10-3、10-4、10- 5、10-哺10-7稀释度的3酷为模板,同时设置 阴性对照(NC)和空白对照(BC);按照实施例2的步骤3的数字PCR扩增反应方法进行数字PCR 扩增。
[0099] 3、结果分析
[0100] 数字PCR灵敏度结果如图2所示。从图2中可W看出,1〇-2、1〇-哺1〇-4梯度稀释的反 应体系中均存在阳性微滴,i(T5、i(r哺1(T7梯度稀释的反应体系中无阳性微滴,此时判定为 阳性微滴的的巧光阔值限为1600,低于1600的微滴仪器判断为阴性,高于1600的微滴仪器 判断为阳性,1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇-哺1〇- 7梯度稀释的反应体系中模板拷贝数分别为1500 拷贝/化、150拷贝/化、15拷贝/化、1.5拷贝/化、0.15拷贝/化和0.015拷贝/化,表明,本发明 的检测马铃馨S病毒的成套试剂的灵敏度为15拷贝AiL。
【主权项】
1. 检测马铃薯S病毒的成套试剂,由名称为XI的引物对和名称为PVS-P的探针组成;所 述XI由PVS-f和PVS-r组成; 所述PVS-f是如下a 1)至a4)中的任一种单链DNA: al)序列表中序列1所示的单链DNA; a2)在al)的5'端和/或3'端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA; a3)与al)或a2)限定的单链DNA具有85 %以上的同一性的单链DNA; a4)在严格条件下与a 1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA; 所述PVS-r是如下b 1)至b4)中的任一种单链DNA: b 1)序列表中序列2所示的单链DNA; b2)在bl)的5'端和/或3'端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA; b3)与b 1)或b2)限定的单链DNA具有85 %以上的同一性的单链DNA; b4)在严格条件下与bl)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA; 所述PVS-p的序列为如下cl)至c4)中的任一种序列: cl)序列表中序列3的序列; c2)在cl)的5'端和/或3'端添加一个或几个核苷酸得到的序列; c3)与cl)或c2)限定的序列具有85%以上的同一性的序列; c4)在严格条件下与cl)或c2)限定的序列杂交的序列。2. 根据权利要求1所述的成套试剂,其特征在于:所述PVS-p的两端被荧光染料标记。3. 根据权利要求1或2所述的成套试剂,其特征在于:所述PVS-p的5'端由FAM标记,和/ 或,所述PVS-p的3 '端由TAMRA标记。4. 检测马铃薯S病毒的引物对,为权利要求1中所述XI。5. 检测马铃薯S病毒的系统,包括权利要求1-3中任一所述成套试剂或权利要求4所述 引物对。6. 根据权利要求5所述的系统,其特征在于:所述系统由权利要求1-3中任一所述成套 试剂和Ml组成,所述Ml为Mia和/或Mlb,所述Mia为进行RNA逆转录所需的试剂和/或仪器,所 述Mlb进行数字PCR所需的试剂和/或仪器。7. 下述任一方法: 1) 权利要求1-3中任一所述成套试剂的制备方法,包括将所述成套试剂中各单链DNA独 立包装; 2) 权利要求4所述引物对的制备方法,包括将所述引物对中两条单链DNA独立包 3) 权利要求5或6所述系统的制备方法,包括将权利要求1-3中任一所述成套试剂中各 单链DNA独立包装。8. 检测马铃薯S病毒的方法,包括A1)或A2): A1)利用权利要求1-3中任一所述成套试剂对待测样品进行数字PCR,根据扩增微滴的 有无确定所述待测样品是否为马铃薯S病毒或是否含有马铃薯S病毒:如有扩增微滴,所述 待测样品为或候选为马铃薯S病毒或所述待测样品含有或候选含有马铃薯S病毒;如无扩增 微滴,所述待测样品不为或候选不为马铃薯S病毒或所述待测样品不含有或候选不含有马 铃薯S病毒; A2)利用权利要求1所述XI中对待测样品进行PCR扩增,根据扩增产物的有无确定所述 待测样品是否为马铃薯S病毒或是否含有马铃薯S病毒。9. 根据权利要求8所述的方法,其特征在于:进行所述数字PCR和所述PCR扩增的退火温 度均为58°C。10. 权利要求1-3中任一所述成套试剂,权利要求4所述引物对,或权利要求5或6所述系 统的下述al)_a4)任一种中的应用: al)在检测马铃薯S病毒中的应用; a2)在制备检测马铃薯S病毒产品中的应用; a3)在利用数字PCR检测马铃薯S病毒中的应用; a4)在制备利用数字PCR检测马铃薯S病毒产品中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK106048099SQ201610697225
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月19日
【发明人】张永江, 黄洁芳, 朱鹏宇, 付伟, 王晨光
【申请人】中国检验检疫科学研究院, 中华人民共和国吴江出入境检验检疫局
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