用于检测表达金属?β?内酰胺酶的细菌的基于6,7?反式头孢菌素的探针的制作方法
【专利摘要】本公开内容包括了对金属?β?内酰胺酶，特别地碳青霉烯酶的选择性检测有用，从而区分耐受碳青霉烯类的细菌的那些物种与是敏感的细菌菌株的探针的实施方案。基于头孢菌素的具有6,7R,R构型的探针容易被β?内酰胺酶裂解，但不能区分被金属?β?内酰胺酶和其他β?内酰胺酶的裂解。通过修饰头孢菌素的侧基，选择性可被引入，其允许探针区分多种类型的金属?β?内酰胺酶，并因此更狭窄地定义细菌的菌株以及产生的金属?β?碳青霉烯酶的类型。
【专利说明】用于检测表达金属-e-内醜胺酶的细菌的基于6，7-反式头抱 菌素的探针
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2014年1月17日提交，标题为"PROBES FOR DETECTION OF CARBAPE肥M-RESISTANT BACT邸lA"的美国临时专利申请系列号61/928,524?及于2014年3 月 21 日提交，标题为 "6,7-TRANS CEPHALOSPORIN-BASED 化U0R0GENIC PROBES FOR DETECTION OF METAliD-e-LACTAMASE-EXPRESSING BACT邸lA"的美国临时专利申请系列号 61 /968，404的优先权，其在此通过引用W其整体并入。
[0003] 序列表
[0004] 本公开内容包括通过引用W其整体并入本文的序列表。
[0005] 本公开内容的领域
[0006] 本公开内容设及对耐受碳青霉締类的肠杆菌科(enterobacteriaceaeKCRE)特异 并基于立体化学修饰的头抱菌素的巧光探针，所述立体化学修饰的头抱菌素被修饰W包括 6,7-反式构型。本公开内容还设及检测由于金属-0-内酷胺酶活性耐受碳青霉締类的细菌 菌株的方法。
[0007] 背景
[000引由于抗生素的滥用和过度使用，革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌化scherichia coli)、克雷伯杆菌属物种化lebsiella species)W及其他肠杆菌科中抗生素耐受性W惊 人的速度在全世界出现（Queenan&Bush(2007)Clin.Microbiol. Rev. 20:440-458 ;Richard 等，（1994) J. Infect. Dis. 170: 377-383 ;Spel 化 erg 等，（2013)N. Engl. J. Med. 368 :299- 302)。特别地，针对广谱(6-内酷胺类抗生素的耐受性已成为主要公共卫生问题。在许多抗生 素中，碳青霉締类具有针对不同类型的细菌的最广谱的活性和最大的效力，并已成为严重 细菌感染的治疗中的"最后手段"(化adley等，（1999)Int. J.Antimicrob.Agents 11:93- 100;化卵-Wallace等，（2011)Antimicrob. Agents Chemother. 55:4943-4960)。然而，主要 由于获得性碳青霉締酶，耐受碳青霉締类的肠杆菌科(CRE)现被频繁地观察到，且病例的数 目正稳步增长（如eenan&Bush(2007)Clin .Microbiol. Rev. 20:440-458 ;Nordmann等（2011) 血erg.Infect.Dis.17:1791-1798)。
[0009]碳青霉締酶是一组具有水解几乎所有(6-内酷胺类抗生素的能力的(6-内酷胺酶，并 包括KPC-类型的Ambler A类0-内酷胺酶、VIM-的金属-0-内酷胺酶（M化KAmbler B类）、 IMP-、新德里金属-0-内酷胺酶(New De化i me化ll〇-e-lactamase)(NDM)、W及0XA-48类型 的相对罕见的 D 类碳青霉締酶（Queenan&Bush(2007)Clin. Microbiol. Rev. 20 :440-458: Nor dmann 等，（2011) Em erg. Infect.Dis. 17 : 1791-1798;Mi;riagou 等，（2010) Clin.Microbiol. Infect. 16:112-122)。碳青霉締酶还被越来越多地报告为医院和社区获 得性感染，特别地对于M化的治疗失败的原因，由于它在不同菌株之间传播和对临床可用抑 制剂的不良敏感性（Queenan&Bush(2007)Cl in. Microbiol. Rev. 20: 440-458; Walsh 等， (201 l)Clin.Microbiol. 49:3222-3227)。因此，]\?心的生产者的快速和准确的检测对适当 的抗菌化学疗法及严格的感染控制至关重要。
[0010] 目前，用于检测e-内酷胺酶的标准诊断方法，诸如修改的Hodge测试（MHT) (Nor血ann等，（2012)Clin.Microbiol.Infect.18:432-438;Cohen(&Leverstein-van(2010) Int.J.Antimicrob.Agents 36:205-210;Bernabeu等，（2012) Diagn.Microbiol . Infect. Dis.74:88-90;Dortet等，（2012) Antimicrob.Agents.Qiemother.56:6437-6440)W及"double-disk synergy test"(DOST) (Arakawa等，（2000) J. Clin .Microbiol. 38:40-43)缺乏必要的特异性和灵敏度，并且耗时， 通常对于大部分细菌的准确检测要求至少24-48小时，但对于具有慢生长率的那些细菌要 求数天。
[0011] 基于 PCR 的方法（Poirel 等，（2011 )Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 70:119-125; Avlami等，（2010)J.Microbiol.Methods.83:185-187;Chen等，（2011) J.Clin.Microbiol.49:579-585)及质谱（Burckhardt&Zi mm e;rmann(2011) J.Clin.Microbiol.49:3321-3324;Hrabak等，（2011)J.Clin.Microbiol.49:3327-3332)具 有高的准确度和灵敏度，但与高成本、沉重仪器要求的缺点相关，且不能检测新进化的碳青 霉締酶基因。最近，由Nordmann开发的Carba-NP测试（CNP ) (Nordmann等，（201 2 ) 血erg.Infect.Dis.18:1503-1507;Dortet等，（2012)J.Clin.Microbiol.50:3773-3776; Dortet等，（2012)Antimicrob.Agents Qiemother.56:6437-6440)具有高特异性，但它仅可 适用于细菌裂解物。
[0012] 相比之下，基于巧光的生物分析测定提供了高灵敏度、易于使用、快速检测、低成 本，且在分析之前很少需要或不需要生物样品处理。许多能够W高灵敏度检测e-内酷胺酶 活性的巧光探针已被开发(Gao等，（2003) J.Am.Chem. Soc. 125:11146-11147 ;Zlokarnic等， (1998) Science 279 :86-88 ;Xing等，（2005) J. Am.畑 em.Soc. 127: 4158-4159; Kong 等， (2010)Proc.化tl.Acad.Sci.USA 419:9-16;Xie等，（2012)Nat.Chem.4:802-809;Wa化nabe 等，（2010) Biocon jugate 化 em. 21: 2320-2326; Zhang 等，（2012)Angew.化 em. Int. 51 版： 1865-1868;化ng等，（2007) J. Am. Chem. Soc. 129:266-267)。然而，运些探针的大部分缺乏对 碳青霉締酶的特异性。仅当与某些抑制剂组合时，一些探针已被用于检测碳青霉締酶 (Zhang等，（2012)Angew.Chem. Int. 51版：1865-1868)。因此，几乎没有巧光探针可用于特异 性检测碳青霉締酶。本公开内容提供了一系列具有适合于细菌中mL的特异性检测的6,7- 反式构型的、基于头抱菌素的巧光探针。
[001引概述
[0014] 本公开内容包括了对金属-0-内酷胺酶，特别地碳青霉締酶的选择性检测有用，从 而区分耐受碳青霉締类的细菌的那些物种与是敏感的细菌菌株的探针的实施方案。基于头 抱菌素的具有6,7R，財勾型的探针容易被0-内酷胺酶裂解，但不能区分被金属-0-内酷胺酶 和其他e-内酷胺酶的裂解。e-内酷胺环的6,7位置的由R，財勾型至S，R的修饰允许头抱菌素 可被金属-e-内酷胺酶，即，碳青霉締酶裂解，但基本上不可被其他内酷胺酶裂解。另外，通 过修饰头抱菌素的侧基，选择性可被引入，其允许探针区分多种类型的金属-e-内酷胺酶， 并因此更狭窄地定义细菌的菌株W及产生的金属-e-碳青霉締酶的类型。
[0015] 因此，本公开内容的一个方面包括了包含可被金属-0-内酷胺酶选择性裂解的探 针的组合物的实施方案，所述探针包含具有6,7-反式构型的头抱菌素和附连至其的可检测 的标记物。在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针可具有式I或式II:
[0016；
[0017]其中，Ri可选自由W下组成的组:烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基 团、巧光团及巧光巧灭剂。
[001引在本公开内容的该方面的一些实施方案中，Ri可选自由W下组成的组：甲基、乙 基、异丙基、叔下基、苄基-及甲苯横酷氧基-(tosylo巧-)。
[0019] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物是(2-氧代-2护色締- 7-基Kill)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并嚷挫-2-基)-4,5-二氨嚷挫-4-簇酸（IV)并且可具 有结构：
[0020]
[0021]在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针可选自由W下组成的组：
[0023]
[0024] 本公开内容的另一个方面包括了选择性检测金属-e-内酷胺酶活性的方法的实施 方案，所述方法包括使怀疑具有金属-e-内酷胺酶活性的样品与包含可被金属-e-内酷胺酶 选择性裂解的探针的组合物接触，所述探针包含具有6,7反式构型的头抱菌素部分和可检 测的标记物;允许金属-e-内酷胺酶活性裂解头抱菌素部分的有效时间段，从而从该头抱菌 素部分释放可检测的标记物，藉此生成可检测的信号;并且检测该信号，其中可检测的信号 指示该样品包含金属-e-内酷胺酶活性或金属-e-内酷胺酶活性的来源。
[0025] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针具有式I或式II:
[0026]
[0027]其中，Ri选自由W下组成的组：烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基 团、巧光团及巧光巧灭剂。在本公开内容的该方面的一些实施方案中，Ri选自由W下组成的 组：甲基、乙基、异丙基、叔下基、苄基-及甲苯横酷氧基-。
[00%]在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物是(2-氧代-2护色締- 7-基Kill)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并嚷挫-2-基)-4,5-二氨嚷挫-4-簇酸（IV)并且可具 有结构：
[0029；
[0030；
[0031；
[003；
[0034] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物可W是蛋光素酶底 物，并且所述方法还可包括使反应混合物与蛋光素酶接触，从而在释放的蛋光素酶底物的 存在下生成可检测的生物发光信号。
[0035] 附图简述
[0036] 本公开内容的各方面在回顾附图后将更容易被理解。附图在下面说明书和实施例 中被更详细地描述。
[0037] 图1A示出了对于本公开内容的巧光探针的实施方案的设计原理。
[0038] 图1B示出了对于祀向碳青霉締酶的巧光探针的设计原理及其一般结构。在运些实 施方案中，巧光团通过-0-被连接至头抱菌素部分，但此类连接还可W是，例如，-N-或-S-。
[0039] 图2A-2F是一系列说明本公开内容的探针的0-内酷胺酶选择性的图。指示量的0- 内酷胺酶在与探针（10山0在室溫在25化的lx PBS缓冲液(抑=7.4)中解育化之后的相对巧 光。
[0040] 图2A:探针CDC-1;图2B: (S)-CC-l;图2C: (S)-CC-3;图2D: (S)-CC-4;图沈：（S)-CC- 5;W及图2F:(s)-CC-6。相对巧光代表与和不与0-内酷胺酶解育的巧光强度的差异。巧光用 在363nm处激发和在454nm处发射(频带宽度=5/7.5nm)来测量。误差棒是± SD。
[0041 ]图3A-3F是一系列说明表达0-内酷胺酶的细菌在与CRE-特异性探针（10山0在室溫 在1X PBS缓冲液(pH=7.4)中解育化之后的相对巧光的图。
[0042] 图 3A:探针CDC-1;图 3B: (S) -CC-1;图 3C: (S) -CC-3;图 3D: (S) -CC-4;图 3E: (S) -CC- 5;W及图3F:(s)-CC-6。在每个图中从左至右:具有IMP-1的大肠杆菌化.coliKlMPl-大肠 杆菌）、具有VIM-27的肺炎克雷伯杆菌化.pneumoniae) (VIM27-KP)、具有NDM-1的大肠杆菌 (NDM1-大肠杆菌）、具有KPC-3的肺炎克雷伯杆菌化PC3-KP)、具有CTX-M的肺炎克雷伯杆菌 (CTX-Kp)、具有細V-18的肺炎克雷伯杆菌（SHV18-KP)、具有TEM-lBla的大肠杆菌(TEM1-大 肠杆菌）、具有AmpC的大肠杆菌(AmpC-大肠杆菌、用BlaC转化的大肠杆菌(BlaC-大肠杆菌）、 具有0XA-48的肺炎克雷伯杆菌(0XA48-KP)、具有IMI的大肠杆菌（IMI-大肠杆菌）。除了表达 AmpC的大肠杆菌W外，所有细菌数目为如所示的，在表达AmpC的大肠杆菌中代替使用 107c.f.u.。相对巧光代表与和不与(6-内酷胺酶解育的巧光强度的差异。巧光用在363nm处 激发和在454nm处发射(频带宽度=5/7.5nm)来测量。误差棒是± SD。
[0043] 图4示意性地示出了本公开内容的祀向碳青霉締酶的巧光探针的合成。（a)化N02、 2N 此504、0〔1，01：，比。化）1?0山口-130山0〔1、0°(：至室溫^.1.)过夜。山）1):化1、丙酬^.1， 化；ii).7-?基香豆素、K2C03、CH3CN，r.t.，2.5h。（d)1.0当量（eqv.)m-CPBA、DCM，0°C，0.5h。 (e)Nal、TFAA、丙酬，0°C，lh。（f)DCM:TFA: TIPS:出0 = 65:30:2.5:2.5，30min，(TC。
[0044] 图5示出了一系列说明探针（s)-CC-2的(6-内酷胺酶选择性的数字图像。指示量的 e-内酷胺酶在与探针（10y^O在r.t在25化 lx ?85缓冲液(抑=7.4)中解育化之后的相对巧 光。在每个图中从左至右内酷胺酶是:VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC。相对巧光 代表与和不与e-内酷胺酶解育的巧光强度的差异。巧光用在363nm处激发和在454nm处发射 (频带宽度= 5/7.5nm)来测量。误差棒是±SD。
[0045] 图6示出了重组(6-内酷胺酶的成像。PBS(1X，抑=7.4)中指示的探针（10^1)在室 溫与多种0-内酷胺酶(4nM)解育化。图用紫外光(360nm)激发来获得。
[0046] 图 7A-13F示出 了一系列探针与内酷胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1 和 BlaC的巧光激活的时间过程的图形表示。误差棒是±SD。实屯、圆，空白；正方形，200飞摩尔 (fmoles)，2化l;S角形，20飞摩尔，2扣l;倒S角形，5飞摩尔，2扣l;菱形，l飞摩尔，2扣l。x 轴，分钟。
[0047] 图 7A-7F:CDC-1 分别与内酷胺酶 VIM-27、IMP-l、NDM-l、KPC-3、TEM-l和BlaC的巧光 激活的时间过程。
[004引 图8A-8F: (S)-CC-l分别与内酷胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的 巧光激活的时间过程。
[0049]图9A-9F: (S)-CC-2分别与内酷胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC的 巧光激活的时间过程。
[0化0]图 10A-10F: (S)-CC-3分别与内酷胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC 的巧光激活的时间过程。
[0化1 ]图 11A-11F: (S)-CC-4分别与内酷胺酶VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1和BlaC 的巧光激活的时间过程。
[0化2]图 12A-12F:(s)-CC-5 分别与内酷胺酶 VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1 和 BlaC 的巧光激活的时间过程。
[0化3]图 13A-13F:(s)-CC-6 分别与内酷胺酶 VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1 和 BlaC 的巧光激活的时间过程。
[0054] 图14A-14G示出了根据本公开内容的探针在缓冲液中的自发水解。
[0055] 图14A是说明本公开内容的探针在PBS缓冲液中的自发水解W释放伞形酬并从而 生成巧光信号的图解。[引0 = 20yM:探针的初始浓度，[門：形成的伞形酬的浓度（水解产 物)。
[0056] 图14B-14G示出了水解产物的百分比的时间过程的一系列图形表示。误差棒指示 =次重复实验的标准差。
[0057] 图15是说明典型SDS-PAGE分析的数字图像，显示表达的重组酶的制品的纯度。纯 化的VIM-27(29.化化)被示为代表性实例。其他酶的分子量也是约30KDa(BlaC，29.5脚a; TEM-1，32.4邸a;NDM-1，29.5邸a;KPC-3，32.3邸a; IMP-1，28.2邸a)，且它们显示与 WVIM-27 的纯度和产量相当的纯度和产量。M，蛋白标准；1，诱导之前的裂解物；2,诱导之后的裂解 物;3，细胞裂解之后的可溶性级分;4，Ni-NTA结合之后的流通物(f low-t虹ough); 5，洗涂1; 6，洗涂2; 7，洗涂5; 8，通过在PBS中的250mM咪挫洗脱的;9，通过PD-10柱纯化的酶。
[0058] 图16示出了用作用于生成编码W下的表达载体的模板的核酸序列:重组0-内酷胺 酶VIM-27(GenBank登录号HQ858608.1 KSEQ ID NO.:l)、IMP-l(GenBank登录号 KC200566.1)(沈QIDN0.:2)、NDM-l(GenBank登录号AF059836.1)(沈QIDN0.:3)、KPC-3 (GenBank登录号NC_019155.1)(SEQIDN0.:4)、0xa-48(沈QIDN0.:5)和TEM-l(GenBank 登录号KC493654.1KSEQ ID顯.：6)。对于酶的相应氨基酸序列的66础曰扯登录号在括号 中。在图中，用于PCR扩增步骤的引物序列（如表2中所示)在插入进表达载体之前的位置W 黑体和下划线来指示。
[0059 ]图 17示出 了探针（S) -CC-1、（ S) -CC-2、（ S) -CC-3、（ S) -CC-4、（ S) -CC-5、（ S) -CC-6和 (s)-CC-7 的式。
[0060] 图18示出了用于祀向碳青霉締酶的巧光探针（s)-CC-7的合成的方案。（a)化N02、 2N 出504、0〔1，01：，比。化）1-8110山9-130山0〔1，0°(：至'.1，过夜。（。）（1):船1、丙酬^.1，化； ii).7-?基香豆素、K2C03、C曲CN，r.t.，2.5h。（d)1.0当量m-CPBA、DCM，0°C，0.5h。（e)DCM: TFA: TIPS:出0 = 65:30:2.5:2.5，30min，0°C。
[0061] 图19A和19B是说明探针（s)-CC-7的重组(6-内酷胺酶选择性和CRE特异性的图。指 示量的e-内酷胺酶（图19A)和表达0-内酷胺酶的细菌（图19B)在与探针（10咖)在室溫在25ii L lx PBS缓冲液(pH = 7.4)中解育化之后的相对巧光。图19A，左至右在每个浓度的：VIM、 IMP、NDM、KPC、TEM-1、BlaC。图19B，左至右:具有IMP-1的大肠杆菌、具有VIM-27的肺炎克雷 伯杆菌、具有NDM-1的大肠杆菌、具有KPC-3的肺炎克雷伯杆菌、具有CTX-M的肺炎克雷伯杆 菌、具有SHV-18的肺炎克雷伯杆菌、具有TEM-lBla的大肠杆菌、具有AmpC的大肠杆菌、用 BlaC转化的大肠杆菌、具有0XA-48的肺炎克雷伯杆菌、具有IMI的大肠杆菌。除了使用 107c.f.u的表达AmpC的大肠杆菌W外，所有细菌数目为如所示的。相对巧光代表与和不与 e-内酷胺酶/解育的巧光强度的差异。巧光用在363nm处激发和在454nm处发射(频带宽度= 5/7.5nm)来测量。误差棒是± SD。
[0062] 图2〇是重组0-内酷胺酶(411]\〇与（3)-〇：-7(1〇咖)在室溫在1义口85(抑=7.4)中解 育化的数字图像。图用紫外光(360nm)激发来生成。
[0063] 图 21A-21F 是说明指示的探针与 VIM-27、IMP-1、NDM-1、KPC-3、TEM-1 和 BlaC 的巧光 激活的时间过程的图。误差棒是±SD。
[0064] 图22示出了用于祀向碳青霉締酶的产生生物发光探针(bioluminogenic probes) (s) -a-3和（s) -a-6的合成的方案。
[0065] 图23是说明探针（s)-a-3的(6-内酷胺酶选择性的图。指示量的(6-内酷胺酶在与探 针（化M)在室溫在25化的lx PBS缓冲液(抑=7.4)中解育化之后的相对巧光。相对巧光代表 与和不与0-内酷胺酶解育的巧光强度的差异。巧光用在350nm处激发(频带宽度= 5nm)和在 550nm处发射(频带宽度= 7.5nm)来测量。误差棒是±SD。
[0066] 图24是说明探针（s)-CL-6的(6-内酷胺酶选择性的图。指示的量的(6-内酷胺酶在与 探针（化^0在室溫在25化的lx ?85缓冲液(抑=7.4)中解育化之后的相对巧光。相对巧光代 表与和不与e-内酷胺酶解育的巧光强度的差异。巧光用在350nm处激发(频带宽度= 5nm)和 在550nm处发射(频带宽度= 7.5nm)来测量。误差棒是±SD。
[0067] 图25是说明表达(6-内酷胺酶的细菌裂解物在与探针（S)-化-3(liiM)在室溫在lx P B S缓冲液（P H = 7.4)中解育化之后的相对巧光的图。除了表达A m P C的大肠杆菌是在 107c.f.u. W外，所有细菌数目为如所示的。相对巧光代表与和不与0-内酷胺酶解育的巧光 强度的差异。巧光用在350nm处激发(频带宽度= 5nm)和在550nm处发射(频带宽度= 7.5nm) 来测量。误差棒是±SD。
[0068] 图26是说明表达(6-内酷胺酶的细菌裂解物在与探针（s)-化-6(liiM)在室溫在lx P B S缓冲液（P H = 7.4)中解育化之后的相对巧光的图。除了表达A m P C的大肠杆菌是在 107c.f.u. W外，所有细菌数目为如所示的。相对巧光代表与和不与0-内酷胺酶解育的巧光 强度的差异。巧光用在350nm处激发(频带宽度= 5nm)和在550nm处发射(频带宽度= 7.5nm) 来测量。误差棒是±SD。
[0069] 图27是说明生物发光发射对不同量的纯化的NDM-1 +在liiM的化UC. (S)-化-6 ]的依 赖性的图。
[0070] 图28是说明生物发光发射对不同浓度的NDM-1裂解物+在1測的化UC. (S)-化-6]的 依赖性的图。
[0071] 图29示出了（S)-化-6的0-内酷胺酶选择性。400飞摩尔0-内酷胺酶在与探针（1山〇 在室溫在1(K)化的lx PBS缓冲液(pH=7.4)中解育化随后添加50ng化UC之后的相对发光。 相对发光代表与和不与e-内酷胺酶解育的发光强度的差异。发光用IVIS 200来测量。误差 棒是±SD。
[0072] 图30示出了（S)-化-6的(6-内酷胺酶选择性。2x 105c.f.u的表达(6-内酷胺酶的细 菌裂解物在与探针（1山0在室溫在1(K)化的lx PBS缓冲液(抑=7.4)中解育化随后添加 50ng fLuc之后的相对发光。相对发光代表与和不与表达(6-内酷胺酶的细菌裂解物解育的发光强 度的差异。图通过IVIS来采集。误差棒是±SD。
[007引详述
[0074] 在更详细的描述本公开内容之前，要理解，该公开内容并不局限于描述的特定实 施方案，并且当然照此可变化。还要理解，本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目 的，且并非旨在限制，因为本公开内容的范围将仅被所附的权利要求书限制。
[0075] 在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值，至下 限的单位的十分之一，除非上下文另外清楚地规定，和在该陈述的范围中的任何其他陈述 的或中间的值被包括在本公开内容内。运些较小的范围的上限和下限可独立地被包括于所 述较小的范围，并且还被包括于本公开内容内，隶属于陈述的范围的任何特定的排除性限 审IJ。在陈述的范围包括上限和下限之一或两者的情况下，排除运些包括的限值中的任一个 或两者的范围也被包括在本公开内容中。
[0076] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本公开内容属 于的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本公开内容的实践或测试中还可 W使用与本文描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方 法和材料。
[0077] 在本说明书中引用的所有出版物及专利均通过引用并入本文，其程度如同每一单 独出版物或专利被具体地和单独地指明通过引用并入本文，并且在本说明书中引用的所有 出版物及专利均通过引用并入本文W公开和描述与被引用的出版物有关的方法和/或材 料。任何出版物的引用是为了其在提交日之前的公开内容，并且不应被解释为承认，本发明 由于之前的公开内容而无权先于此类出版物。
[0078] 如本领域技术人员阅读该公开内容之后将清楚的，本文描述并例证的个体实施方 案中的每个具有离散的组成部分和特征，其可容易地与其它若干实施方案中的任一个的特 征分开或组合，而不偏离本公开内容的范围或精神。任何所提及的方法可事件提及的 顺序或w逻辑上可能的任何其他顺序来进行。
[0079] 除非另有指示，否则本公开内容的实施方案将使用医学、有机化学、生物化学、分 子生物学、药物学等的技术，其在本领域的技术内。此类技术在文献中被充分地解释。
[0080] 必须注意，如在说明书和所附的权利要求书中使用的，单数形式"一个(a)"、" 一个 (an)"和"该（the)"包括复数指代对象，除非上下文另有清楚的指示。因此，例如提及"支撑 物(a 8啡9〇的)"包括多个支撑物。在该说明书中W及在之后的权利要求书中，将提及许多 术语，其将被定义为具有W下含义，除非相反的意向是明显的。
[0081] 如本文使用的，W下术语具有归于它们的含义，除非另有说明。在本公开内容中， "包括(comprises)"、"包括(comprising)"、"包含(containing)"和"具有化aving)"等可具 有在美国专利法中赋予它们的含义，且可意指"包括（includes)"、"包括（including)"等； "基本上由......组成"或"基本上包括"等，当应用于被本公开内容包括的方法和组合物 时，指像本文公开的那些的组合物，但其可包含另外的结构基团、组合物组分或方法步骤 (或其类似物或衍生物，如W上讨论的）。然而，与本文公开的相应组合物或方法的那些比 较，运样的另外的结构基团、组合物组分或方法步骤等，实质上不影响组合物或方法的基本 和新颖特征。
[0082] 在描述多个实施方案之前，提供了 W下定义并且应该被使用，除非另有指示。
[0083] 缩写
[0084] TFAA，S氣乙酸酢;MLB，金属-0-内酷胺酶;CRE，耐受碳青霉締类的肠杆菌科;PBS， 憐酸盐缓冲盐水;TsOH，甲苯横酸(PTSA或pTsOH)或对甲苯横酸;CPBA，氯过氧苯甲酸;DCM， 二氯甲烧;TFA，S氣乙酸;TIPS，SDS，十二烷基硫酸钢;r. t，室溫。
[0085] 定义
[0086] 在描述和要求保护公开的主题时，W下术语将根据W下陈述的定义被使用。
[0087] 如本文单独或组合使用的术语"酷基"，意指与选自W下的基键合的幾基或硫代幾 基基团：例如，任选地被取代的，氨化化ydrido)、烷基(例如面代烷基）、締基、烘基、烷氧基 ("酷氧基"，包括乙酷氧基、下酷氧基、异戊酷氧基、苯基乙酷氧基(pheny lacetyloxy)、苯甲 酷氧基（berizoyloxy)、对-甲氧基苯甲酯基（p-methoxybenzoyloxy) W及被取代的酷氧基 诸如烷氧基烷基和面代烷氧基）、芳基、面素、杂环基、杂芳基、横酷基(例如締丙基亚横酷基 烷基）、横酷基(例如烷基横酷基烷基）、环烷基、环締基、硫代烷基、硫代芳基、氨基(例如烧 基氨基或二烷基氨基及芳烷氧基。"酷基"基团的说明性实例是甲酯基、乙酷基、2-氯乙 酷基、2-漠乙酷基、苯甲酯基、=氣乙酷基、邻苯二甲酯基、丙二酷基、烟酷基等。如本文所用 的术语"酷基"指基团-C(0)R26,其中R26为氨、烷基、环烷基、环杂烷基、芳基、芳基烷基、杂烧 基、杂芳基和杂芳烷基。实例包括，但不限于甲酯基、乙酷基、环己基幾基、环己基甲基幾基、 苯甲酯基、苯甲基幾基(beo巧1 carbonyl)等。
[0088] 如本文所用的术语"酷基氨基"指酷基-NH-基团，其中酷基如先前描述的。
[0089] 如本文所用的术语"酷氧基"指酷基-0-基团，其中酷基如先前描述的。
[0090] 单独的或在其他术语诸如本文所用的"硫代烷基"和"芳基烷基"内的术语"烷基" 意指可W是直链（即直链(linear))或支链的一价、饱和的控基。在本公开内容中使用的烧 基基通常包括从约1个至20个碳原子，特别地从约1个至10个、1个至8个或1个至7个，更特别 地约1个至6个碳原子，或3个至6个。说明性烷基基包括甲基、乙基、正丙基、正下基、正戊基、 正己基、异丙基、异下基、异戊基、戊基、仲下基、叔下基、叔戊基、正庚基、正乙酷基（n- actyl)、正壬基、正癸基、十一烷基、正十二烷基、正十四烷基、十五烷基、正十六烷基、十屯 烷基、正十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十二烷基(dosyl)、正二十四烷基等、W及其支链 变体。在本公开内容的某些方面，烷基基是包含W下或选自由W下组成的组的C1-C6低级烧 基：甲基、乙基、正丙基、正下基、正戊基、正己基、异丙基、异下基、异戊基、戊基三下基、仲 下基、叔下基、叔戊基和正己基。烷基基可在不显著干扰本公开内容的化合物的制备且不显 著降低化合物的效力的位置处任选地被如本文定义的取代基取代。在本公开内容的某些方 面，烷基基被一个至五个取代基取代，所述取代基包括面素、低级烷氧基、低级脂肪族、被取 代的低级脂肪族、径基、氯基、硝基、硫代、氨基、酬基、醒、醋、酷胺、被取代的氨基、簇基、横 酷基、硫酷基、亚横酷基、硫酸盐、亚讽、被取代的簇基、面代的低级烷基(例如CF3)、面代的 低级烷氧基、径基幾基、低级烷氧基幾基、低级烷基幾基氧基、低级烷基幾基氨基、脂环族 (cycloali地atic)、被取代的脂环族、或芳基（例如，苯基甲基苄基））、杂芳基（例如，化晚 基)和杂环基(例如，赃晚基、吗嘟基）。烷基基团上的取代基可自身被取代。
[0091] 如本文所用的术语"締基"指包含至少一个双键的不饱和的、无环支链或直链控 基。締基基可包含从约2个至24个或2个至10个碳原子，特别地从约3个至8个碳原子，且更特 别地约3个至6个或2个至6个碳原子。适合的締基基包括但不限于乙締基、丙締基(例如，丙- 1- 締-1-基、丙-1-締-2-基、丙-2-締-1-基(締丙基)和丙-2-締-2-基）、下締-1-基、下-1-締- 2- 基、2-甲基-丙-1-締-1-基、下-2-締-1-基、下-2-締-2-基、下-1,3-二締-1-基、0-1,3-二 締2-3/1、己締-1-基、3-径基乙締-基、庚締-1-基和辛締-1-基等。締基基可类似于烷基任选 地被取代。
[0092] 如本文所用的术语"烷基氨基甲酯基"指R'RN--C〇--基团，其中R和R'的一个是氨， 且R和R'的另一个是如先前描述的烷基和/或被取代的烷基。
[0093] 如本文所用的术语"亚烷基"指具有从约1个至10个、1个至8个、1个至6个或2个至6 个碳原子并具有两个或更多个共价键的附连点的直链或支链的基。此类基的实例是亚甲 基、乙締、丙締、下締、戊二締、亚己基、亚乙基、甲基亚乙基和亚异丙基。当亚締基基作为取 代基存在于另一个基上时，它通常被认为是单取代基，而不是由两个取代基形成的基。
[0094] 如本文所用的术语"亚締堂'指具有从约2个至10个、2个至8个或2个至6个碳原子、 至少一个双键并具有两个或更多个共价键的附连点的直链或支链的基。亚締基基的实例包 括1,1-亚乙締基（--CH2 = C-)、1,2-亚乙締基（-CH = CH-)和1,4-了间二締基（-CH = CH-CH = CH-)〇
[OOM]如本文使用的术语"芳烷氧基幾基"指芳烷基-0--C0--基团。示例性芳烷氧基幾基 是节氧基幾基。
[0096] 如本文所用的术语"芳烷基"指通过烷基基团诸如苄基直接键合的芳基或取代的 芳基基团。被取代的芳基基的其他具体实例包括氯苄基和氨基苄基。示例性的芳烷基包括 苄基、苯基乙基、和糞基甲基。
[0097] 如本文所用的术语"芳烷基氧基"指芳烷基-0-基团，其中芳烷基如先前描述的。示 例性芳烷基氧基是节氧基。
[0098] 如本文所用的术语"芳酷基"指如W上定义的芳基基，附连至如本文定义的幾基 基，包括但不限于苯甲酯基和甲苯甲酯基。芳酷基基可任选地被如本文公开的基团取代。
[0099] 如本文所用的术语"芳酷基氨基"指芳酷基-NH-基团，其中芳酷基如先前描述的。
[0100] 如本文所用的术语"芳基"指芳族取代基，其可W是单芳族环，或者被稠合在一起、 共价连接或与共同基团，诸如，但不限于，亚甲基或乙締基部分连接的多个芳族环。共同连 接基团还可W是如在二苯基甲酬中的幾基，或如在二苯酸中的氧，或如二苯胺中的氮。术语 "芳基"特别包括杂环芳族化合物。芳族环可包括苯基、糞基、联苯基、二苯酸、二苯胺和二苯 甲酬，W及其他。在特定实施方案中，术语"芳基"意指包含约5个至约10个碳原子，例如，5 个、6个、7个、8个、9个或10个碳原子，并包含5元和6元控和杂环芳环的环状芳族。
[0101] 芳基基团可任选地被一个芳基基团取代基或更多个可W是相同的或不同的芳基 基团取代基取代（"被取代的芳基"），其中"芳基基团取代基"包括烷基、被取代的烷基、芳 基、被取代的芳基、芳烷基、径基、烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、簇基、酷基、面素、硝基、烧 氧基幾基、芳基氧基幾基、芳烷氧基幾基、酷基氧基、酷基氨基、芳酷基氨基、氨基甲酯基、烧 基氨基甲酯基、二烷基氨基甲酯基、芳基硫基、烷基硫基、亚烷基和--NR ' R"，其中R '和R"可 W各自独立地为氨、烷基、被取代的烷基、芳基、被取代的芳基和芳烷基。
[0102] 芳基基团可任选地被一个至四个取代基取代，所述取代基诸如烷基、被取代的烧 基、締基、被取代的締基、烘基、被取代的烘基、芳基、被取代的芳基、芳烷基、面素、=氣甲氧 基、=氣甲基、径基、烷氧基、烧酷基、烧酷基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基、氨基、烷基氨基、 酷基氨基、芳烷基氨基、二烷基氨基、烧酷基氨基、硫醇、烷基硫代、脈基、硝基、氯基、簇基、 簇基烷基、氨基甲酯基、烷氧基幾基、烷基硫幾基、芳基硫幾基(arylthiono)、芳基横酷基胺 基(a巧Isulfonylamine)、次横酸、烷基横酷基(a化ysulfonyl)、横酷氨基、芳基氧基等。取 代基可被径基、面素、烷基、烷氧基、締基、烘基、芳基或芳烷基进一步取代。在本公开内容的 方面，芳基基被径基、烷基、幾基、簇基、硫醇、氨基和/或面素取代。
[0103] 芳基基团的具体实例包括，但不限于，环戊二締基、苯基、巧喃、嚷吩、化咯、化喃、 化晚、咪挫、苯并咪挫、异嚷挫、异嗯挫、化挫、化嗦、=嗦、喀晚、哇嘟、异哇嘟、吗I噪、巧挫等。
[0104] 如本文所用的术语"芳基氧基"指附连至氧原子的如W上定义的芳基基。示例性芳 基氧基包括糞氧基、哇嘟氧基、异哇嗦氧基（isoquir iol iz iny 1〇巧)等。
[0105] 如本文所用的术语"芳基氧基幾基"指芳基-0--C0--基团。示例性的芳基氧基幾基 基团包括苯氧基-幾基和糞氧基-幾基。
[0106] 如本文所用的术语"芳基氧基"指芳基基团，其中芳基基团如先前描述的，包 括被取代的芳基。如本文所用的术语"芳基氧基"可W指苯基氧基或己基氧基及烷基、被取 代的烷基、面素或烷氧基取代的苯基氧基或己基氧基。
[0107] 如本文所用的术语"芳基烷氧基"指被附连至烷氧基基团的芳基基团。芳基烷氧基 基团的代表性实例包括，但不限于，2-苯基乙氧基、3-糞-2-基丙氧基和5-苯基戊氧基。
[0108] 如本文所用的术语"生物发光"指一种类型的化学发光，由生物分子，特别地蛋白 的光的发射。生物发光的必要条件是在加氧酶、蛋光素酶的存在下的结合或游离的分子氧， 加氧酶、蛋光素酶在分子氧的存在下对底物蛋光素起作用并将底物转化为激发态，其在返 回至较低能级时W光的形式释放能量。
[0109] 如本文所用的术语"碳环(carbocylic)"包括来源于饱和的或不饱和的、被取代的 或未被取代的5元至14元有机核的基，其的成环原子(除氨W外)仅是碳。碳环基的实例是环 烷基、环締基、芳基、特别是苯基、糞基、降冰片烷基（norbornanyl)、二环庚二締基 (bicycloheptadienyl)、甲苯酷基、二甲苯基（xylenyl)、巧基、均二苯代乙締基 (stilbenzyl)、S联苯基、二苯基乙締基（diphenyl ethyl enyl )、苯基环己基、起締基 (acenapththylenyi)、蔥基、联苯基、联苄基(Wbenzylyl)和相关联苄基同系物、八氨糞基 (octahydronaphthyl )、四氨糞基（tetrahydronaphthyl )、八氨哇嘟基 (oct址y化oquinol iny 1)、二甲氧基四氨糞基等。
[0110] 如本文单独或组合使用的术语"氨基甲酯基"，指附连至幾基基团中的两个非共享 键之一的氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、单环烷基氨基、烷基环烷基氨基 (曰化7167〇1〇曰化71日111；[]1〇)和二环烷基氨基（(1;[07010曰化71曰又曰;[]1〇)基。
[0111] 如本文所用的术语"氨基甲酯基"指出N-C0-基团。
[0112] 如本文所用的术语"碳青霉締类"是指一类具有广谱抗菌活性的0-内酷胺类抗生 素。对大部分e-内酷胺酶高度耐受。碳青霉締类抗生素最初从碳青霉締嚷締霉素(卡特利链 霉菌（Streptomyces cattleya)的一种天然来源的产物)开发。碳青霉締类是用于许多细菌 感染，诸如大肠杆菌化.coli)和肺炎克雷伯杆菌的最后手段的抗生素之一。对碳青霉締类 抗生素的药物耐受性在运些大肠杆菌群中的传播通常是由于碳青霉締酶，包括新德里金属 e-内酷胺酶(NDM-1)的产生。目前，不存在对抗耐受碳青霉締类的细菌的开发中的新抗生 素，且耐受性基因的全世界传播被认为是主要问题。与其他e-内酷胺类诸如青霉素类和头 抱菌素类相比，运些试剂具有最广的抗菌谱。碳青霉締类通过W高亲和力结合e-内酷胺酶 并酷化酶，使它失活来规避(circumvent)e-内酷胺酶。除了细胞内细菌(非典型），诸如衣原 体(Chlamydiae)W外，碳青霉締类针对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌两者，W及厌氧 菌是活性的。因此，碳青霉締类也是迄今能够抑制L，D-转肤酶的唯一 0-内酷胺类。碳青霉締 类非常类似于青霉素类(青霉烧类），但结构的位置1中的硫原子已被碳原子代替，且已被引 入不饱和。
[0113] 如本文所用的术语"碳青霉締酶"指针对氧基亚氨基头抱菌素类、头霉素类是活性 的，且但还针对碳青霉締类是活性的一组e-内酷胺酶。碳青霉締酶包括诸如是质粒介导的 碳青霉締酶的IMP型碳青霉締酶(金属-0-内酷胺酶），且可在细菌物种中被发现，细菌物种 诸如肠的革兰氏阴性生物体，假单胞菌属物种（Pseudomonas spp.)和不动杆菌属物种 (Acinetobacter spp. ；LVIM(维罗纳整合子编码型金属-0-内酷胺酶)包括10个成员，其大 部分存在于铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，还有恶臭假单胞菌(P.putida)中且很少存在于 肠杆菌科中。IMP和VIM两者是整合子缔合的，有时在质粒内。两者水解除了单环0-内酷胺类 W外的所有e-内酷胺类，并避开所有e-内酷胺抑制剂。
[0114] 0-内酷胺酶的0XA组主要存在于不动杆菌属(Acinetobacter)物种中。0XA碳青霉 締酶在体外非常慢地水解碳青霉締类，且对于一些不动杆菌宿主观察到的高MIC(大于 64mg/L)可反映继发性机制。0XA碳青霉締酶还趋向具有朝向青霉素类和头抱菌素类的降低 的水解效率。KPC(肺炎克雷伯杆菌碳青霉締酶）目前是产生KPC的肠杆菌科的最常见的碳青 霉締酶，在美国日趋普遍。CMY从产气肠杆菌化nterobacter aerogenes)的强毒株中分离。 它被携带在质粒pYMG-1上，并因此可传播至其他细菌菌株。NDM-1 (新德里金属-0-内酷胺 酶)在大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌中较为普遍。
[0115]可易受本公开内容的内酷胺酶影响的细菌包括革兰氏阴性细菌，诸如，但不限于， 阴沟肠杆菌化.cloacae)、弗氏巧樣酸杆菌（C.打eundii)、粘质沙雷氏菌（S.marcescens)、 铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌(Proteus mirabi 1 is)、肠杆菌科，包括埃希 氏杆菌属物种化scherichia spp.)、沙口氏菌属物种（Salmonella spp.)、流感嗜血杆菌 (H. inf luenzae)、淋病奈瑟菌(N. gonorrhoeae)、克吕沃尔菌属物种化luyvera spp.)、鼠伤 寒沙口氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimuri皿)等，W及革兰氏阳性菌，诸如葡 萄球菌属物种（Sl:a地ylococci spp.)、链球菌属物种（Streptococci spp.)、链杆菌属物种 (Streptobacilli spp.)、芽抱杆菌属物种(Bacilli spp.)等。
[0116] 如本文所用的术语"幾基"指具有四个共价键中的两个与氧原子共享的碳基。幾 基-如本文所用的术语"幾基"指--(c=o)--基团。
[0117] 如本文所用的术语"甲酯胺基"是指基团-C0NH-。簇基-如本文所用的术语"簇基" 指一C00H基团。
[011引如本文单独或组合使用的术语"簇基"，指-C(0)0R25-或-C(-0)0R25,其中R25为可任 选地被取代的氨、烷基、締基、烘基、环烷基、环締基、氨基、硫醇、芳基、杂芳基、硫代烷基、硫 代芳基、硫代烷氧基、杂芳基或杂环。在本公开内容的方面，簇基基团呈醋化形式，并可包含 作为醋化基团的低级烷基基团。在本公开内容的特定方面，-C(0)0R25提供了醋或氨基酸衍 生物。醋化形式在本文中也特别称为"簇酸醋"。在本公开内容的方面，"簇基"可被取代，特 别地被締丙基取代，其任选地被氨基、胺、面素、烷基氨基、芳基、簇基或杂环中的一个或多 个取代。簇基基团的实例是甲氧基幾基、下氧基幾基，叔烧氧幾基（tert. alkoxycarbony 1) 诸如叔下氧基幾基（tert. butoxycarbon^)、具有一个或两个芳基基的芳基甲氧基幾基，包 括但不限于任选被例如低级烷基、低级烷氧基、径基、面素和/或硝基取代的苯基，诸如节氧 基幾基、甲氧基苄基幾基、二苯基甲氧基幾基、2-漠代乙氧幾基（2-b;romoetho巧carbon}^)、 2-舰代乙氧幾基叔下基幾基（2-;[0(10日1:110巧。日1'130]1711日1'1:.1311171。日1'13〇1'171)、4-硝基节氧 幾基、二苯基甲氧基幾基、苄基径基幾基(benzhydro巧carbon^)、二-(4-甲氧基苯基-甲氧 基幾基、2-漠代乙氧基幾基、2-舰代乙氧基幾基、2-S甲基甲娃烷基乙氧基幾基、或2-S苯 基甲娃烷基乙氧基幾基。W醋化形式的另外的簇基基团是甲娃烷基氧基幾基基团，包括有 机甲娃烷基氧基幾基。此类化合物中的娃取代基可被低级烷基(例如甲基）、烷氧基(例如甲 氧基)和/或面素 (例如氯)取代。娃取代基的实例包括S甲基甲娃烷基(trimethylsilyi)和 二甲基叔下基甲娃烷基(dimethyltert.butylsil}^)。在本公开内容的方面，簇基基团可W 是烷氧基幾基，特别是甲氧基幾基、乙氧基幾基、异丙氧基幾基、叔下氧基幾基、叔戊氧基幾 基、sir庚氧基幾基(sir h巧tyloxy carbonyl),特别是甲氧基幾基或乙氧基幾基。
[0119] 如本文所用的术语"头抱菌素"指其中e-内酷胺环被稠合至6元二氨嚷嗦环，由此 形成头抱締核的e-内酷胺化合物。对头抱締核的侧链修饰可赋予抗菌活性的改进的谱、药 代动力学优势W及另外的副作用。基于它们的活性谱，头抱菌素类大致可分为四代。
[0120] 如本文所用的术语"环的"和"环烷基"指约3个至约10个碳原子，例如，3个、4个、5 个、6个、7个、8个、9个、或10个碳原子的非芳族单环或多环系统。环烷基基团可任选地是部 分不饱和的。环烷基基团还可任选地被如本文定义的烷基基团取代基、氧代和/或亚烷基取 代。可沿着环烷基链任选地插入一个或更多个氧、硫、或被取代或未被取代的氮原子，其中 氮取代基是氨、烷基、被取代的烷基、芳基或被取代的芳基，由此提供杂环基团。代表性的单 环环烷基环包括环戊基、环己基和环庚基。多环环烷基环包括金刚烷基、八氨糞基、十氨糞 基、精脑烷基、茨締烷基和正金刚烷基。
[0121] 如本文所用的术语"脂环族"指具有少于8个碳原子或者由不超过=个稠合的脂环 族环组成的稠合环系统的环烧控。此类基团的实例包括但不限于十氨糞基等。
[0122] 如本文所用的术语"环締基"指包含约4个至16个、2个至15个、2个至10个、2个至8 个、4个至10个、3个至8个、3个至7个、3个至6个或4个至6个碳原子、一个或更多个碳-碳双 键、W及的一个、两个、=个或四个环的基，其中此类环可悬垂的方式被附连或可被稠 合。在本公开内容的某些方面，环締基基是具有=个至屯个碳原子的"低级环締基"基。环締 基基的实例包括但不限于环下締基，环戊締基、环己締基和环庚締基。环締基基可任选地被 如本文公开的基团，特别地可W是相同的或不同的1个、2个或3个取代基取代。
[0123] 如本文所用的术语"环烷氧基"指附连至氧基基的环烷基基(特别是，具有3个至15 个、3个至8个或3个至6个碳原子的环烷基基）。环烷氧基的实例包括环己氧基和环戊氧基。 环烷氧基基可任选地被如本文公开的基团取代。
[0124] 如本文所用的术语"环烷基"指具有约3个至15个、3个至10个、3个至8个或3个至6 个碳原子并包含一个、两个、=个或四个环的基，其中此类环可悬垂的方式被附连或可 被稠合。在本公开内容的方面，"环烷基"指包含1个至2个环及每环3个至7个碳原子的任选 地被取代的、饱和的控环系统，其可与不饱和的C3-C7碳环进一步稠合。环烷基基团的实例 包括单环结构诸如环丙基、环下基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十 二烷基等，或者多环结构诸如金刚烷基等。在本公开内容的某些方面，环烷基基是具有从约 3个至10个、3个至8个、3个至6个或3个至4个碳原子的"低级环烷基"基，特别是环丙基、环下 基、环戊基、环己基和环庚基。术语"环烷基"还包括其中环烷基基与芳基基或杂环基基稠合 的基。环烷基基可任选地被如本文公开的基团取代。
[0125] 如本文所用的术语"可检测的部分"指本领域中已知的多种标记部分。所述部分可 W是，例如，放射性标记物(例如，化、1251、355、14(：、畔，等）、可检测的酶(例如，辣根过氧化物 酶化RP)、碱性憐酸酶等）、染料、比色标记物诸如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙 締、聚丙締、胶乳等）、珠或能够生成可检测信号诸如比色、巧光、化学发光或电化学发光 化CL)信号的任何其他部分。因此，"可检测的部分"与"标记物分子"同义地使用。本领域技 术人员已知的作为对检测有用的标记物分子包括化学发光分子或巧光分子。适合于用来标 记用于本公开内容的方法的核酸的多种巧光分子是本领域已知的。用于此类渗入的方案可 取决于使用的巧光分子而变化。对于各自的巧光分子，此类方案是本领域已知的。
[0126] 在本公开内容的探针的实施方案中，预期可检测的部分可在头抱菌素被碳青霉締 酶的水解裂解之后从探针释放，使得巧光染料，例如，不再被巧灭，因此，是可检测的。进一 步预期，可检测的部分诸如光吸收染料或放射性标记物可从未被裂解的探针释放并分离， W用于指示碳青霉締酶活性的存在的定量检测或定性检测。
[0127] 如本文所用的术语"可检测的标记的"意指，化合物诸如本公开内容的基于头抱菌 素的探针，可包含是放射性的、或被巧光团取代的、或被引发可被裸眼或通过仪器诸如，不 限于，闪烁计数器、色度计、紫外分光光度计等观察到或检测到的物理响应或化学响应的一 些其他分子物类取代的部分。
[0128] 光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学工具(means)可用来检测 此类标记物。检测装置和方法可包括，但不限于，光学成像、电子成像、用CCD照相机成像、集 成光学成像及质谱。另外，与祀结合的被标记的或未被标记的探针的量可被定量。此类定量 可包括统计分析。
[0129] 如本文所用的术语"二烷基氨基"指一NRR'基团，其中R和R'的每个独立地为如先 前描述的烷基基团和/或被取代的烷基基团。示例性烷基氨基基团包括乙基甲基氨基、二甲 基氨基及二乙基氨基。
[0130] 如本文所用的术语"二烷基氨基甲酯基"指R'RN--C〇--基团，其中R和R'的每个独 立地为如先前描述的烷基和/或被取代的烷基。
[0131] 如本文所用的术语"非对映体"指可包含一个或更多个不对称中屯、并可产生对映 体、非对映体，W及可根据绝对立体化学为(R)-或(S)-被定义的其他立体异构形式的本公 开内容的化合物。因此，本公开内容的化合物包括所有可能的非对映体和对映体W及它们 的外消旋和光学纯形式。光学活性(R)-异构体和(S)-异构体可使用手性合成子或手性试剂 制备，或者使用常规技术拆分。当本公开内容的化合物包含几何不对称中屯、时，且除非另有 说明，意图是化合物包括E和A几何异构体两者。所有互变异构形式也被包括在本公开内容 的化合物的范围之内。
[0132] 如本文所用的术语"染料"指其的存在可通过它的光吸收或光发射特性来检测的 任何报告物基团。例如，切5是花青染料家族的反应性水溶性巧光染料。切5是在红色区域的 巧光（约650nm至约67化m)。它可W被合成为带有在氮侧链的任一或两者上的反应性基团， W便它们可被化学连接至核酸或蛋白分子。标记出于可视化和定量目的而进行。的5在约 64化m处被最大激发，在约67化m处被最大发射，处在光谱的远红部分中；量子产率是0.28。 FW = 792。用于本公开内容的探针的适合的巧光团（色原酬(chromes))可选自，但并不意图 被限制为，异硫氯酸巧光素(FITC，绿色），花青染料切2、切3、切3.5、切5、切5.5切7、切7.5 (范围从绿色至近红外），德克萨斯红等。用于在本公开内容的实施方案中使用的运些染料 的衍生物可 W是，但不限于，切染料（Amersham Bioscience)、Alexa FluorS(Molecular Probes Inc.，）、HiLYTE.RTM Fluors(AnaSpec)W及DYLITE.RTM Fluors(Pierce,Inc.)。
[0133] 如本文所用的术语"巧光"指主要在冷的主体中作为光学现象被发现的发光，其中 光子的分子吸收触发具有较长(较低能量)波长的光子的发射。吸收的和发射的光子之间的 能量差随着分子的旋转、振动或发热而消失。有时吸收的光子在紫外线范围内，且发射的光 在可见光范围内，但运取决于特定巧光团的吸光度曲线和斯托克斯位移(Stokes shift)。
[0134] 如本文所用的术语"巧光团"指导致分子是巧光的分子的组分。如本文所用的术语 "巧光团"指其的存在可通过它的光发射特性来检测的任何报告物基团。它是分子中将吸收 特定波长的能量并在不同（但同样特定)波长处再发射能量的官能团。所发射的能量的量和 波长取决于巧光团和巧光团的化学环境两者。用于在本公开内容的组合物中使用的巧光团 包括，但不限于，异硫氯酸巧光素(FITC)，一种巧光素的反应性衍生物，其是化学地附连至 其他、非巧光分子W创建新的巧光分子用于多种应用的最常见的巧光团之一。其他历史上 常见的巧光团是若丹明（TRITC)、香豆素和花青素的衍生物。更新代的巧光团诸如ALEXA 化U0RS.RTM、D化IGHT化UORS.rtmW及绿色巧光的巧光团东京绿（Tokyo Green)通常比其 他可比的激发和发射的标准染料里耐光、更明亮且较少抑敏感。
[0135] 如本文所用的术语"FRET"指分子之间的巧光共振能量转移。在FRET方法中，一种 巧光团能够作为能量供体，且另一种是能量受体分子。运些有时被分别称为报告物分子和 巧灭剂分子。供体分子被特定波长的光激发，对于其，它将通常会表现出巧光发射波长。受 体分子也在该波长处被激发，使得它可通过多种距离依赖性能量转移机制接受供体分子的 发射能量。通常，当它们很靠近(例如，在相同或相邻的分子上)时，受体分子接受供体分子 的发射能量。FRET技术是本领域熟知的，并且可容易地用来检测本公开内容的铁氧化物结 合的肤。参见例如，美国专利号 5,668,648、5,707,804、5,728,528、5,853,992和5,869,255 (对于FRET染料的描述），TMer即y等，（1994)NucleicAcidRes.22:920-928，W及Wolf等， (1988)Proc.化11. Acad. Sci . USA 85:8790-8794(对于用于FRET的一般性描述和方法），其 的每个在此通过引用W其整体并入。
[0136] 如本文所用的术语"杂芳基"指完全不饱和的包含杂原子的环形芳族基，该环形芳 族基具有选自碳、氮、硫和氧的至少一个杂原子。杂芳基基可包含一个、两个或=个环，且环 可悬垂的方式被附连或可被稠合。在本公开内容的方面，该术语指完全不饱和的包含 杂原子的环形芳族基，该环形芳族基具有从3个至15个、3个至10个、3个至8个、5个至15个、5 个至10个或5个至8个环成员，该环成员选自碳、氮、硫和氧，其中至少一个环原子是杂原子。 "杂芳基"基的实例，包括但不限于，包含1个至4个氮原子的不饱和的5元至6元杂单环基团， 特别地，化咯基、化咯嘟基、咪挫基、化挫基、2-化晚基、3-化晚基、4-化晚基、化晚基、喀晚 基、化嗦基、化嗦基、=挫基、四挫基等;包含1个至5个氮原子的不饱和的稠合杂环基团，特 别地吗I噪基、异吗I噪基、中氮巧基（indolizinyl)、苯并咪挫基、哇嘟基、异哇嘟基、吗I挫基、 哇挫嘟基、蝶晚基、哇嗦基、献嗦基、糞晚基(naphthyridiny 1)、哇喔嘟基、增嘟基、菲晚基、 口丫晚基、菲咯嘟基（phenanthrolinyl)、吩嗦基(phenazinyl)和巧挫基；嚷岭基、苯并咪挫 基、哇嘟基（quinolinyl)、异哇嘟基、苯并S挫基（beazotriazolyl)、四挫并U达嗦基 (tetrazolopyridazinyl)等;包含氧原子的不饱和的3元至6元杂单环基团，特别地，2-巧喃 基、化喃基等;包含硫原子的不饱和的5元至6元杂单环基团，特别地，嚷吩基、2-嚷吩基、3- 嚷吩基等;包含1个至2个氧原子和1个至3个氮原子的不饱和的5元至6元杂单环基团，特别 地巧咱基、苯并巧咱基、嗯挫基、异嗯挫基和嗯二挫基(oxadiazolyl);包含1个至2个氧原子 和1个至3个氮原子的不饱和的稠合杂环基团，特别地苯并嗯挫基、苯并嗯二挫基等;包含1 个至2个硫原子和1个至3个氮原子的不饱和的5元至6元杂单环基团，例如，嚷挫基、异嚷挫、 嚷二挫基等;包含1个至2个硫原子和1个至3个氮原子的不饱和的稠合杂环基团，诸如苯并 嚷挫基、苯并嚷二挫基(benzothiadiazolyl)等。该术语还包括其中杂环基与芳基基，特别 地二环基稠合的基，诸如苯并巧喃基、苯并嚷吩基、献嗦基、色締基、咕吨基等。杂芳基基可 任选地W如本文公开的基团，例如W烷基、氨基、面素等取代，特别地杂芳基胺。该术语可指 包含1个至4个氮原子的不饱和的5元至6元杂单环基团，特别地化咯基、化咯嘟基、咪挫基、 化挫基、2-化晚基、3-化晚基、化晚基、喀晚基、化嗦基、化嗦基、=挫基、四挫基等。杂芳基基 可任选地W本文公开的基团，例如W烷基、氨基、面素等取代，特别地被取代的杂芳基基是 杂芳基胺。
[0137] 如本文所用的术语"杂环基"指具有少于8个碳原子或由不超过=个的稠合环组成 的稠合环系统(其中该环碳原子中的至少一个被氧、氮或硫代替）的环烧控和/或芳环系统。 此类基团的实例包括，但不限于，吗嘟代等。
[0138] 如本文所用的术语"杂环的"指饱和的和部分饱和的包含杂原子的环形基，该环形 基具有选自碳、氮、硫和氧的至少一个杂原子。杂环基基可包含一个、两个或=个环，其中此 类环可悬垂的方式被附连或可被稠合。在一个方面，该术语指饱和的和部分饱和的包 含杂原子的环形基，该环形基具有从约3个至15个、3个至10个、5个至15个、5个至10个或3个 至8个环成员，该环成员选自碳、氮、硫和氧，其中至少一个环原子是杂原子。示例性饱和的 杂环基包括但不限于包含1个至4个氮原子的饱和的3元至6元杂单环基团（例如化咯烷基、 咪挫烷基和赃嗦基）；包含1个至2个氧原子和1个至3个氮原子的饱和的3元至6元杂单环基 团（例如吗嘟基;悉尼酬基（sydnonyl)]; W及包含1个至2个硫原子和1个至3个氮原子的饱 和的3元至6元杂单环基团[例如，嚷挫烷基）等。部分饱和的杂环基基的实例包括但不限于 二氨嚷吩基、二氨化喃基、二氨巧喃基和二氨嚷挫基。说明性杂环基团包括但不限于氮杂环 丙烷基、氮杂环下烷基、2-化咯嘟基、3-化咯嘟基、化咯烷基、氮杂卓基(azepinyl)、l，3-二 氧环戊烷基（1，3-(110^0131171)、211化喃基、佔-化喃基、赃晚基、1，4-二嗯烷基（1，4- dioxanyl)、吗嘟基、[I比挫嘟基、硫代吗嘟基（thiomo;rpholiny 1)、1,2,3,6-四氨[I比晚基、环氧 乙烷基、氧杂环下烷基、四氨巧喃基、四氨化喃基、四氨化晚基、四氨嚷喃基、嚷嗯烷基 (thioxanyl)、二氨吗I噪基、2H-化喃基、4H-化喃基、二嗯烷基、1,3-二氧环戊基、化挫嘟基、 二氨化喃基、二氨嚷吩基(dihydrothienyl)、二氨巧喃基、化挫烷基、咪挫嘟基、咪挫烷基、 quinuelidinyl、哇嗦基等。
[0139] 如本文所用的术语"径基烷基"指被--OH基团取代的烷基基团。
[0140] 如本文所用的术语"径基化ydroxyir或"径基化ydroxy)"指一0H基团。
[0141] 如本文所用的术语"衔接物"指在本公开内容的化合物的头抱菌素主链上的官能 团（例如，胺基团），或衔接物可包括附连至头抱菌素的单独的部分，分子诸如巧光团或巧灭 剂可然后被附连至其。衔接物可包括官能团，诸如，但不限于，胺、簇酸、径基、硫代及其组 合。衔接物可包括化合物，诸如，但不限于，DTPA、抓TA、D0PA、EGTA、NTA及其组合。在一个实 施方案中，衔接物和馨合剂化合物是相同的，但在其他实施方案中它们可W是不同的。
[0142] 在本公开内容的探针的有利的实施方案中，预期，标记物诸如，但不限于，巧光团 可通过-0-、-N-或-S-连接被附连至头抱菌素部分。
[0143] 如本文所用的术语"低级烷基取代的面素"指包含多达并包括八个碳原子的任何 烷基链，其中脂肪族氨原子中的一个被面素代替。此类的实例包括但不限于氯乙基等。
[0144] 如本文所用的术语"蛋光素酶"指催化光发射反应的加氧酶。例如，细菌蛋光素酶 催化黄素单核巧酸和脂肪族醒的氧化，该反应产生光。另一类在海洋节肢动物中发现的蛋 光素酶催化海蛋蛋光素的氧化，且另一类蛋光素酶催化銷翅目蛋光素的氧化。因此，"蛋光 素酶"指催化生物发光反应的酶或光蛋白（photoprotein)。蛋光素酶诸如蛋火虫和海肾 (Renilla)蛋光素酶是充当催化并在生物发光产生反应期间保持不变的酶。蛋光素酶光蛋 白，诸如被非共价键合至蛋光素的水母发光蛋白和嘘?蛋白光蛋白，在生物发光产生反应期 间被蛋光素的释放改变。蛋光素酶是天然存在于生物体中的蛋白或其变体或突变体，诸如 通过诱变产生的具有一个或更多个特性，诸如热稳定性或抑稳定性的变体，即不同于天然 存在的蛋白。蛋光素酶及其修饰的突变体或变体形式是熟知的。例如，提及"海肾蛋光素酶" 意指从属海肾的成员分离的酶或从任何其他来源，诸如从另一珊瑚虫纲(Anthozoa)获得或 已合成制备的等效分子。
[0145] 如本文所用的术语"被可操作地连接"指元件的布置，其中如此描述的组分被配 置，W执行其通常功能。因此，当适当的酶存在时，被可操作地连接至编码序列的给定的启 动子能够实现该编码序列的表达。只要启动子起作用，W引导编码序列表达，启动子不必与 编码序列邻接。因此，例如，居间非翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之 间，且启动子序列可仍被认为是"被可操作地连接"至编码序列。
[0146] 如本文所用的术语"引物"指与待扩增或复制的DNA区段互补的寡核巧酸。通常引 物在PCR中被使用。引物与模板DNA杂交(或"退火"），并被聚合酶酶用作复制/扩增过程的起 点。"互补"意指引物序列可与模板形成稳定的氨键络合物。
[0147] 如本文所用的术语"探针"指修饰的头抱菌素，其具有6,7反式构型并被金属-0-内 酷胺酶选择性裂解，且可具有来源于醇的允许探针选择性区分金属-e-内酷胺酶物类的侧 基。
[0148] 如本文所用的术语"被取代的締基"包括被W下取代的締基基团：例如，一个至= 个取代基，优选地一个至两个取代基，诸如烷基、烷氧基、面代烷氧基、烷基烷氧基、面代烧 氧基烷基、烧酷基、烧酷基氧基、环烷基、环烷氧基、酷基、酷基氨基、酷氧基、氨基、烷基氨 基、烧酷基氨基、氨基酷基、氨基酷氧基、氯基、面素、径基、簇基、簇基烷基、氨基甲酯基、酬 基、硫代酬基、硫醇、烷基硫代、横酷基、横酷氨基、硫代烷氧基、芳基、硝基等。
[0149] 如本文所用的术语"被取代的烷基"可包括被W下取代的烷基基团：例如，一个至 五个取代基，且优选地1个至3个取代基，诸如烷基、烷氧基、氧代、烧酷基、芳基、芳烷基、芳 基氧基、烧酷基氧基、环烷基、酷基、氨基、径氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基氨基、芳烷基 氨基、氯基、面素、径基、簇基、氨基甲酯基、簇基烷基、酬基、硫代酬基、硫醇、烷基硫醇、芳基 硫代、芳烷基硫代、横酷胺、硫代烷氧基；W及硝基。
[0150] 如本文所用的术语"被取代的芳基"包括芳族环，或由不多于=个稠合环（其的至 少一个是芳族的）组成的稠合芳族环系统，并且其中在环碳上的氨原子中的至少一个已被 W下代替：面素、氨基、径基、硝基、硫代、烷基、酬、醒、醋、酷胺、低级脂肪族、被取代的低级 脂肪族或环(芳基、被取代的芳基、脂环族或被取代的环脂环族）。此类的实例包括，但不限 于，径基苯基、氯苯基烷基氨基、二烷基氨基、硫酸根，琉基等。。
[0151] 如本文所用的术语"被取代的脂环族"指拥有少于8个碳或由不多于=个稠合环组 成的稠合环系统的环烧控，并且其中脂肪族氨原子中的至少一个已被W下代替：面素、硝 基、硫代、氨基、径基、酬、醒、醋、酷胺、低级脂肪族、被取代的低级脂肪族，或环(芳基、被取 代的芳基、脂环族或被取代的脂环族）。此类基团的实例包括但不限于1-氯癸基（1- chlorodecalyl)等。
[0152] 如本文所用的术语"被取代的环烷基"包括具有从1个至5个(特别地1个至3个)取 代基的环烷基基团，所述取代基包括但不限于烷基、締基、烷氧基、环烷基、被取代的环烧 基、酷基、酷氨基、酷氧基、氨基、氨基酷基、氨基酷氧基、氧基酷基氨基、氯基、面素、径基、簇 基、簇基烷基、酬基、硫代酬基、硫醇、硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳基氧基、径基 氨基、烷氧基氨基W及硝基。
[0153] 如本文所用的术语"被取代的杂环基"指拥有少于8个碳或由不多于=个稠合环组 成的稠合环系统的环烧控和/或芳基环系统，其中环碳原子中的至少一个被氧、氮或硫代 替，且其中脂肪族氨原子中的至少一个已被W下代替：面素、径基、硫代、硝基、氨基、酬、醒、 醋、酷胺;低级脂肪族、被取代的低级脂肪族，或环(芳基、被取代的芳基、脂环族或被取代的 脂环族）。此类基团的实例包括但不限于2-氯化喃基。
[0154] 如本文单独或与其他术语诸如烷基横酷基或芳基横酷基结合使用的术语"横酷 基"指二价基-S〇2^。在本公开内容的方面，横酷基基团可被连接至被取代的或未被取代的径 基、烷基基团、酸基团、締基基团、烘基基团、芳基基团、环烷基基团、环締基基团、环烘基基 团、杂环基基团、碳水化合物、肤或肤衍生物。
[0155] 如本文所用的术语"被取代的脂肪族"指具有少于10个碳原子的烷基或烧控。术语 "被取代的脂肪族"指拥有少于10个碳的烷基或烧控，其中脂肪族氨原子中的至少一个已被 W下代替：面素、氨基、径基、硝基、硫代、酬、醒、醋、酷胺、低级脂肪族、被取代的低级脂肪 族，或环(芳基、被取代的芳基、脂环族或被取代的脂环族等）。此类基团的实例包括但不限 于1-氯乙基等。
[0156] 如本文单独或组合使用的术语"硫代烷氧基"指其中硫原子(S)被键合至烷氧基的 化学官能团，具有通用化学式-SR24,其中R24为可被取代的烷氧基基团。"硫代烷氧基"可具 有1-6个碳原子即-S-(0)-&-C6烷基基团，其中Ci-Cs烷基具有如W上定义的含义。具有从1 个至6个碳原子的直链或支链硫代烷氧基基团或基，还被称为C1-C6硫代烷氧基的说明性实 例包括硫代甲氧基和硫代乙氧基。
[0157] 如本文单独或组合使用的术语"硫代烷基"指其中硫原子(5)被键合至可被取代的 烷基的化学官能团。硫代烷基基团的实例是硫代甲基、硫代乙基和硫代丙基。硫代烷基可被 取代或未取代的簇酸、芳基、杂环基、幾基或杂环基取代。
[0158] 如本文单独或组合使用的术语"硫代芳基"指其中硫原子(S)被键合至芳基基团的 化学官能团，具有通用化学式-SR23,其中R23为可被取代的芳基。硫代芳基基团和被取代的 硫代芳基基团的说明性实例是苯硫基、氯苯硫酪、对-氯苯硫酪、硫代苄基、4-甲氧基-硫代 苯基、4-硝基-硫代苯基和对-硝基硫代苄基。
[0159] 如本文所用的术语"硫醇"意指-SH。硫醇可被本文公开的取代基，特别地烷基(硫 代烷基）、芳基(硫代芳基）、烷氧基(硫代烷氧基)或簇基取代。硫醇可被W下取代:取代的或 未取代的杂芳基或杂环基，特别地包含1个至4个氮原子的被取代的或未被取代的饱和的3 元至6元杂单环基团（例如化咯烷基、咪挫烷基、赃晚基和赃嗦基)或包含1个至2个氧原子和 1个至3个氮原子的饱和的3元至6元杂单环基团（例如吗嘟基;悉尼酬基(sy化ionyl))，特别 地被取代的吗嘟基或赃晚基。
[0160] 讨论
[0161] 碳青霉締类对大部分0-内酷胺酶高度耐受，并在其C-6位置处具有S构型和在C-5 位置处具有財勾型，如在图1B所示。0-内酷胺环在C-5位置和C-6位置处的运一反式构型提供 了具有针对e-内酷胺酶的良好稳定性的抗生素(Basket等，（1980)J.Antibiot.(Tokyo)33: 878-884)。相比之下，其他内酷胺诸如头抱菌素类，一类最初来源于真菌枝顶抱属 (Acremonium)的、通常已被用作开发用于0-内酷胺酶的探针的支架的0-内酷胺抗生素 (Gao 等，（2003)J.Am.Chem.Soc.125:11146-11147;Zlokarnic等，（1998)Science279:86-88; Xing等，（2005)J.Am.Chem.Soc.127:4158-4159;Kong等，（2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 419:9-16 ;Xie等，（2012) J.Nat. Chem. 4:802-809)通常具有在对应C-7位置处的R构型。
[0162] 本公开内容包括了对金属-e-内酷胺酶，特别地碳青霉締酶的选择性检测有用，从 而区分耐受碳青霉締类的细菌的那些物种与是敏感的细菌菌株的探针的实施方案。基于头 抱菌素的用于检测耐受抗生素的细菌的具有6,7R，財勾型的探针容易被0-内酷胺酶裂解，但 不能区分被金属-e-内酷胺酶和其他e-内酷胺酶的裂解。现已发现，通过e-内酷胺环的6,7 位置由R，財勾型至s，R的修饰允许头抱菌素可被金属-e-内酷胺酶，即，碳青霉締酶裂解，但 基本上不可被其他内酷胺酶裂解。另外，已发现了通过修饰头抱菌素的侧基，选择性可被引 入，其允许本公开内容的探针区分多种类型的金属-e-内酷胺酶，并因此更狭窄地定义细菌 的菌株W及产生的金属-e-碳青霉締酶的类型。因此，本公开内容提供了对鉴定耐受碳青霉 締类的细菌菌株的存在并进一步表征菌株为针对特定类型的酶有用的探针。
[0163] 特别地，本公开内容的探针的实施方案可通过在C-7位置处的取代来修饰，所述修 饰通过改变在合成步骤中使用的醇。本公开内容的实例由此渗入通过氧基-键附连至头抱 菌素的侧基，其大小从简单的甲基部分变化至取代的苯基基团。然而，预期了可选择可允许 金属-e-内酷胺酶的进一步定义的其他侧基。
[0164] 本公开内容的探针对检测生物样品诸如体液，包括血液、唾液、尿液等，在受试者 人或动物中的或者从其分离的组织，或者细菌的培养的群体的悬液或培养物中的细菌金 属-e-内酷胺酶有用。
[0165] 探针可游离在溶液中，或被拴系（tethered)至用于与测试样品接触的固体支撑 物。将探针拴系至此类支撑物的此类方法W及为检测释放的标记部分选择的和/或调整的 检测系统是本领域已知的。
[0166] 因此，本公开内容的修饰的头抱菌素类已被工程化W包括头抱菌素的財勾型至S构 型的转化W使得它对碳青霉締酶特异，即可被碳青霉締酶裂解，但不可被其他内酷胺酶裂 解，或基本上较少程度地可被其他内酷胺酶裂解。
[0167] 如图1A和1B中所示，本公开内容的碳青霉締酶特异的探针还可包括可检测的标记 部分诸如，但不限于，巧光团。可被有利地渗入进本公开内容的探针的适合的巧光团包括， 但不限于，诸如在其3'-位置处被附连至头抱菌素的烷基化的伞形酬(7-径基香豆素）。当在 36化m处激发时，此类附连的标记部分几乎不发巧光。然而，在头抱菌素被碳青霉締酶水解 后，巧光团被释放，导致可检测的巧光发射。可被渗入进本公开内容的探针的其他有利标记 物是蛋光素。特别有利的蛋光素及其衍生物是具有式(45)-2-(6-?基-1,3-苯并嚷挫-2- 基)-4，5-二氨嚷挫-4-簇酸的蛋火虫D-蛋光素，其可例如通过6-径基位置被连接至探针。然 而，预期了，在从探针裂解之后是可检测的任何巧光团可有用地被渗入进本公开内容的探 针。
[0168] 几种巧光探针(各自包含在C-7位置处具有S构型的头抱菌素部分)根据如图4中所 示的方案来合成。头抱菌素中构型的反转通过醇和重氮酬中间体之间的SN2反应来实现，如 已被0〇116的7等（1990) J.Med.化em. 33:2513-2521描述的，其通过引用W其整体并入本文， 该重氮酬中间体在酸性条件下由7-氨基头抱菌酸（1)的对甲氧基苄基(PMB)醋与化N02W定 量产率来制备。醇的R基团可被改变，W产生对确定碳青霉締酶的底物偏好有用的一组探针 变体。在用于生物测定中之前，所有探针通过HPLC来纯化并通过NMR和质谱(MS)在结构上表 征。
[0169] 本公开内容的巧光探针实施方案相对于其他内酷胺酶选择性检测碳青霉締酶的 特异性使用重组e-内酷胺酶进行检查。四种碳青霉締酶，即金属-e-内酷胺酶VIM-27、IMP-1 和 NDM-1 W 及A类 0-内酷胺酶 KPC-3遵循如在 Wang等，（2006)Antimicrob.Agents 化emother. 50: 2762-2771中描述的方案来表达，其通过引用W其整体并入本文。两种非碳 青霉締酶的A类0-内酷胺酶，TEM-lBla和BlaC也被表达，W用作阴性对照。
[0170] 在使用在约1飞摩尔至约200飞摩尔的范围内的酶浓度来在酶处理之前和之后，测 量探针的巧光。如图2、5和6中所示，探针显示了对六种0-内酷胺酶VIM-27JMP-1和NDM-UA 类e-内酷胺酶KPC-3和非碳青霉締酶的A类0-内酷胺酶TEM-lBla和BlaC的不同特异性和灵 敏度。在暴露于任何和所有的酶包括TEM-lBla和BlaC对照之后，如被Xie等（2012) J.化t.化em.4:802-809描述的被采用作为阳性对照的先前报道的用于0-内酷胺酶的非特 异性探针CDC-1，给出阳性巧光增强。然而，当用碳青霉締酶处理时，本公开内容的多种基于 修饰的头抱菌素的探针表现出不同程度的巧光。
[0171 ] 例如，当用碳青霉締酶VIM-27、IMP-1、NDM-1和KPC-3处理时，对于（S)-CC-l、（S)- CC-2和(S )-CC-5，高的巧光信号被记录，但当所述探针用内酷胺酶TEM-lBla和BlaC处理时， 几乎未观察到巧光增强。因此，探针(s)-CC-l、（s)-CC-2和（s)-CC-5可被称为是对碳青霉締 酶特异性的底物，即可特异性地检测碳青霉締酶。相比之下，当用低至1飞摩尔的所有四种 碳青霉締酶处理时，通过提供可检测的巧光，（s)-CC-l和（s)-CC-5显示比（s)-CC-2更大的 灵敏度，表明（s)-CC-l和(s)-CC-5可W是对总体碳青霉締酶特异性的但对其他内酷胺酶不 是特异性的探针。
[0172] 仅对于S种MBL VIM-27、IMP-1 和NDM-1，探针（S)-CC-3和（S)-CC-6显示巧光增强， 表明（s)-CC-3和（s)-CC-6对金属-0-内酷胺酶的一般特异性。然而，探针（s)-CC-6显示比 (s)-CC-3更好的灵敏度，由于对于（s)-CC-6,用低至1.0飞摩尔的酶，巧光增强被清楚地观 察到。当在测定中使用的KPC-3的量上升至200飞摩尔时，两种探针产生巧光信号，如图2C和 2F中所示。
[0173] 如在图2D中所示，巧光探针(s)-CC-4显示对IMP-1的高特异性，且巧光信号W浓度 依赖性方式逐渐增加。随着在约200飞摩尔的量暴露于NDM-1，巧光增加仅是可检测的。结果 指示，头抱菌素的C-7位置由財勾型向S构型的立体化学的反转足W增强相对于其他内酷胺 酶物类对碳青霉締酶是选择性的探针特异性。
[0174] 本公开内容的探针与不同0-内酷胺酶的动力学参数由林-贝氏化ineweaver- Burk)曲线确定并总结于图7A-13F和表1中。
[0175] 表1 「017A1
[017引所有探针表现出高稳定性与范围从0.7至5.9x l0-7s-i的低自发水解速率，如图 14B-14G中所示。动力学参数的比较指示，对于是最常见的金属-0-内酷胺酶并具有全世界 的分布的IMP-l(Oelschlaeger等，（2010)J.Med.Chem.53:3013-3027;Griffin等，（2011) Biochemistry 50 : 9125-91:34)，所有的探针显示最佳动力学效率（kcat/Km = 0.2-2.5 X i06s-im_i)。
[0179] 具有大体积(bulky)叔下基侧基的探针（s)-CC-4显示对于IMP-1的高的特异性和 动力学效率化cat/Km) (2.2 X 105s^M^)，与对其他碳青霉締酶的相比的50至100倍。未检测 到被非碳青霉締酶的内酷胺酶的水解。对于被VIM-27和KPC-3水解，较小的R基团是优选的， 但对于IMP-1和NDM-1是较不优选的。
[0180] 与VIM-27和NDM-U分别为2.6X1〇4s-1m-i和 1.0X1〇4s-1m-i)相比，对于IMP-1 和 KPC-3(分别为1.2X10V1M-哺2.2X1〇5s-1M-i)，探针（s)-CC-5表现出高得多的动力学效 率。未观察到被非碳青霉締酶的内酷胺酶的水解。然而，对于IMP-UNDM-1和VIM-27(分别为 6.6X105s-lM-l、4.0X105s-lM-l和2.8X105s-lM-l)，探针(s)-CC-6显示高的动力学效率，水平 比KPC-3(2.0X10Vl^^l)高从约14倍至约33倍。运些动力学测量值与如图2A-2F中所示的W 重组e-内酷胺酶的特异性/灵敏度结果一致。
[0181] 还证实了运些探针用于检测表达碳青霉締酶的活的细菌的有用性。评价了产生碳 青霉締酶或其他临床流行的e-内酷胺酶的^^一种细菌菌株，包括A类0-内酷胺酶KPC-3和 IMI，B类MBL VIM-27JMP-1和NDM-1，D类0-内酷胺酶0XA-48，W及临床上重要的非碳青霉締 酶CTX-M、SHV-18、TEM-l、BlaC和AmpC。探针（各自10i^M，除非指明）对在从104c.f.u.至 106c.f.u.的范围内不同数目的活的细菌的巧光响应示于图3A-3F中。作为阳性对照，对于 所有的细菌菌株，CDC-1是持续阳性的，表明所有的细菌是0-内酷胺酶活性的。
[0182] 对于表达 VIM-27、IMP-1、NDM-1 和 KPC-3 的细菌（〉= l〇5c.f .U.)，探针（s)-CC-l 和 (s)-CC-5显示高的巧光增强。然而，对于104c.f.u的细菌，仅表达IMP-1的细菌可被探针 (s)-CC-l检测到。仅对于VIM-27JMP-1和NDM-1，探针(s)-CC-3和(s)-CC-6具有强的巧光响 应，与如图2A-2F中所示的从重组酶研究获得的结果一致。相比之下，需要至少1. Ox l〇5c.f.u.至约l.Ox 106c.f.u.细菌，W使用（s)-CC-3和(s)-CC-6探针并在化解育之后可靠 地检测mL细菌。另外，（s)-CC-4显示对于产生IMP的菌株的特异性偏好，具有约1 X 105c.f.u.细菌的检测限值。
[0183] 因此，通过反转头抱菌素在C7位置处的立体化学，已开发了可特异性检测碳青霉 締酶，且特别地由CRE细菌产生的金属-0-内酷胺酶的巧光探针。在C7位置处的取代基团可 进一步调节对碳青霉締酶之间的选择性，W进一步区分碳青霉締酶的类型。因此，（s)-CC-3 和(s)-CC-6显示总体相比于其他内酷胺酶对MBL的特异性和灵敏度。然而，探针(s)-CC-4显 示对IMP-1的高特异性。
[0184] 尽管本公开内容的探针（s)-CC-l至（s)-CC-6使用蓝色巧光团香豆素，预期了，其 他巧光团包括，但不限于，具有较长发射波长的那些可被用作本公开内容的巧光团，W改进 灵敏度，如报道的如报道的（Xie等，（2012)J.Nat.Chem.4:802-809)。预期了本公开内容的 探针，包括巧光团中的变化形式，对耐受碳青霉締类的肠杆菌科(CRE)的快速和准确检测有 用，W用于具有CRE感染的患者的早期诊断和治疗。
[0185] 还预期了，多种可检测的标记部分可被渗入进本公开内容的修饰的头抱菌素探 针，使得多于一种的细菌菌株(各自产生可区分的物类的金属-e-碳青霉締酶)可W同时是 可检测的。最有利地，在碳青霉締类被碳青霉締酶的水解后，此类可检测的部分提供可检测 的信号增加。在本公开内容的探针的一些实施方案中，标记物是巧光标记物。通过标记物至 头抱菌素的附连，存在由激发福射诱发的巧光的巧灭。在其他实施方案中，标记物可W是从 探针释放并进入周围的液体介质的染料，或甚至是放射性标记物。被释放的染料然后可从 未裂解的探针分离，用于检测。
[0186] 因此，本公开内容的一个方面包括了包含可被金属-0-内酷胺酶选择性裂解的可 检测的探针的组合物的实施方案，所述探针包含具有6,7-反式构型的头抱菌素和附连至其 的可检测的标记物。
[0187] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针可具有式I或式II:
[0188；
[0189] 其中，Ri可选自由W下组成的组:烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基 团、巧光团及巧光巧灭剂。
[0190] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，Ri可选自由W下组成的组：甲基、乙 基、异丙基、叔下基、苄基-及甲苯横酷氧基-。
[0191] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物可通过-0-、-N-或-S- 连接被附连至头抱菌素。
[0194] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针可选自由W下组成的组：
[0192] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物是(2-氧代-2护色締- 7-基Kill)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并嚷挫-2-基)-4,5-二氨嚷挫-4-簇酸（IV)并且可具 有结构：
[0193]
[019(
[019；
[019引本公开内容的另一个方面包括了选择性检测金属-e-内酷胺酶活性的方法的实施 方案，所述方法包括使怀疑具有金属-e-内酷胺酶活性的样品与包含可被金属-e-内酷胺酶 选择性裂解的可检测的探针的组合物接触，所述探针包含具有6,7反式构型的头抱菌素部 分和可检测的标记物;允许金属-e-内酷胺酶活性裂解头抱菌素部分的有效时间段，从而从 该头抱菌素部分释放可检测的标记物，藉此生成可检测的信号;并且检测该信号，其中可检 测的信号指示样品包含金属-e-内酷胺酶活性或金属-e-内酷胺酶活性的来源。
[0199]在本公开内容的该方面的一些实施方案中，探针具有式I或式II:
[0200；
123 其中，Ri可选自由W下组成的组:烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基 团、巧光团、蛋光素酶底物及巧光巧灭剂。 2 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，扣选自由W下组成的组：甲基、乙基、 异丙基、叔下基、苄基-及甲苯横酷氧基-。 3 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物可W是染料、巧光标 记物、放射性标记物或巧灭剂。
[0204] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物可通过-0-、-N-或-S- 连接被附连至探针。
[0205] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物是(2-氧代-2H-色締- 7-基Kill)或(4S)-2-(6-氧代-1,3-苯并嚷挫-2-基)-4,5-二氨嚷挫-4-簇酸（IV)并且可具 有结构：
[020d
[0207]在一些实施方案中，探针可选自由W下组成的组：
[0208；
[0210]
[0211]
[0212] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，样品可W是细菌培养物。
[0213] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，样品可从动物受试者或人受试者分 离。
[0214] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，样品可W是从来自人受试者或动物受 试者的样品产生的细菌培养物。
[0215] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，样品可包含克雷伯杆菌属物种或埃希 氏杆菌属物种中的至少一种。
[0216] 在本公开内容的该方面的一些实施方案中，可检测的标记物可W是蛋光素酶底 物，并且所述方法还可包括使反应混合物与蛋光素酶接触，从而在释放的蛋光素酶底物的 存在下生成可检测的生物发光信号。
[0217] 应注意，比率、浓度、量和其他数值数据可范围格式在本文中表示。应该理解， 为方便和简洁，使用运样的范围格式，并且因此，应该W灵活的方式解释为不仅包括明确列 举作为范围的界限的数值，而且还包括在该范围内包括的所有单独的数值或子范围，如同 每个数值和子范围被明确地列举。为了说明，"约0.1%至约5%"的浓度范围应被解释为不 仅包括约0.1 wt %至约5wt %的明确列举的浓度，而且还包括在指示的范围内的单独的浓度 (例如，1%、2%、3%、和 4%)W 及子范围（例如，0.5%、1.1%、2.2%、3.3%、和4.4%)。术语 。约"可包括被修饰的数值的±1%、±2%、±3%、±4%、±5%、±6%、±7%、±8%、±9% 或±10%或更多。另外，短语"约V至V"包括"约V至约V"。
[0218] 应强调，本公开内容的W上描述的实施方案仅仅是实现的可能的实例，并且仅为 了对本公开内容的原理的清楚理解而提出。可对本公开内容的W上描述的实施方案进行许 多变化和修改，而基本上不偏离本公开内容的精神和原则。所有此类修改和变化都意图在 本文中被包括在本公开内容的范围内。
[0219] 提出W下实施例，W便对本领域普通技术人员提供如何进行本文公开并要求保护 的方法和使用探针的完整的公开内容和描述。已经做出努力W确保关于数字(例如量、溫度 等)的准确性，但应该考虑某些误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份数，溫度是W °C，并且压力是在大气压或接近大气压。标准溫度和压力定义为20°C和1个大气压。 实施例
[0。0] 实施例1
[0221] 碳青霉締酶和非碳青霉締酶的内酷胺酶的克隆：用于将全长0-内酷胺酶克隆进 pBAD/Myc-His载体（Invitrogen)的引物，如表2中所示。
[0222] 表2:用于克隆0-内酷胺酶的引物 「02231
L〇224」基因组DNA或质粒DM从各自过表足特定酶的细菌菌株（肺炎克雷伯杆菌或大肠杆 菌)纯化作为用于PCR的模板。利用对于各自酶的F(正向）引物、R(反向）引物和模板DNA(其 序列示于图16和表2中）使用Pf X 50DNA聚合酶和制造商的方案（Invitrogen)来进行PCR。 纯化的PCR产物用Ncol和Sail限制性内切酶消化并使用T4DNA连接酶（Invitrogen)克隆进 pBAD/Myc-His载体。连接的质粒DNA被转化进细菌化21或ToplO细胞中。插入的DNA序列通过 测序分析来证实。
[0。引实施例2
[0。6] 酶从细菌细胞的纯化:所有的酶如Dohedy等，（1990)J .Med.化em. 33: 2513-2521 中描述的来纯化，其通过引用W其整体并入本文。简言之，包含6x His的(6-内酷胺酶（在 化21或Top 10细菌中的pBAD/Myc-Hi S载体)在30 °C通过0.2 %阿拉伯糖诱导超过化进行过表 达，直到在60化m处的光密度(0化00)达到0.8。蛋白然后用制造商的方案使用脚G脚ST邸.RTM 蛋白提取试剂（Novagen)和Ni-NTA琼脂糖珠（Qiagen)来纯化（洗涂缓冲液1:在pH 7.4， 0.01M PBS、150mM NaCl;用于3-次洗涂的洗涂缓冲液2:在pH 7.4 0.01M PBS中的20mM咪 挫;洗脱缓冲液，在抑7.4 0.01M PBS中的250mM咪挫）。在纯化之后，洗脱的蛋白使用PD-10 柱(GE healthcare)纯化。纯度通过12%十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE， 如在图15中所示)来确定且然后浓度通过化a壯ord测定试剂盒(BioRad)来确定。
[0。7] 实施例3
[022引实验部分：所有的化学品购自商业来源（例如Aldrich、Alfa Aesar和TCI America)，且不经进一步纯化地使用。分析性化C用巧光指示器(254nm)用0.25mm硅胶60F板 来进行。板用紫外光来可视化。HPLC在配备有GP50梯度累和内联二极管阵列UV-Vis检测器 的Dionex册LC系统（DionexCo;rporation)上来进行。反相C18(曲enomenax,5lim,4.6x 250mm或Dionex，5皿，21.2X 250mm)柱与包含0.1%S氣乙酸的MeCN/出0梯度流动相血/ min或12血/min的流一起使用，用于分析或纯化。1h和1化NMR谱在Varian 400MHz磁共振谱 仪上来获取。对于iH醒R谱的数据报告如下:化学位移被报告为相对于氯仿-d(S7.26，S)的 S，W百万分率(ppm)为单位;多重性报告如下:S(单峰）、d(双峰）、t(S重峰）、q(四重峰）、dd (双二重峰）、m(多重峰)或br(加宽）；偶合常数被报告为W化dzWz)计的J值;对于给定共 振的质子数目（n)被指示nH，且基于频谱集成值。动力学实验在M1000酶标仪（TECAN, research triangle park,NC)中来进行。
[0。9] 实施例4
[0230] 4-甲氧基苄基3-(氯甲基)-7-重氮基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2- 締-2-簇酸醋化合物2的制备：
[0231]
[0232] 化合物2根据先前公开的程序来制备（Doherty等，（1990) J.Med.化em. 33 :2513- 2521，通过引用W其整体并入本文）。将在水中的化N〇2(0.35g，5mmol)的混合物(20mL)添加 至在20血C出Cb中的ACLE(2.Og，5mmol)的溶液。将所得的两相混合物冷却至0°C，然后伴随 剧烈揽拌在30min内逐滴添力日2N出SO冰溶液(3.8mL)。将反应在0°C连续地揽拌1小时。随后， 将有机层分离，且用C此Cb洗涂两次水层。将有机层合并，用盐水洗涂，经MgS〇4干燥，并过 滤，W获得2的黄色溶液。将该溶液在下一步中立即使用。 脚引实施例5
[0234] (6R，7S)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基）-7-烷氧基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环
[4.2.0] 辛-2-締-2-簇酸醋(3)的制备.在0°C，将多种醇（约10当量至约100当量)添加至化 合物2在C此Cb中的溶液。对甲苯横酸（1当量）随后在20min伴随揽拌成批地添加（气体逸 出）。然后除去冰浴并且在室溫继续揽拌反应过夜。反应通过化C监测。在反应完成之后，浓 缩反应混合物并用乙酸乙醋稀释，且随后用饱和的化肥化水溶液、水和盐水萃取。有机层经 无水MgS化干燥，并在真空中浓缩。剩余物最后在快速柱上用己烧/EtOAc(4:l)色谱分析，W 获得所期望的化合物3。通过使用醇类甲醇、乙醇、异丙醇、叔下醇、节醇和甲苯横酷酸合成 的化合物3的实例分别是化合物3-1至3-6:
[0235；
123 (6R，7S)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基）-7-甲氧基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环 2
[4.2.0] 辛-2-締-2-簇酸醋（3-l):产率 = 38%。lHNMR(400MHz，CDCl3)S7.37(d，J = 8.細z， 3 2H)、6.89(d，J = 8.7Hz，2H)、5.30(d，J=11.8Hz，lH)、5.22(d，J=11.8Hz，lH)、4.69(d，J = 1.細z，lH)、4.52(d，J=l.細z，lH)、4.42(d，J=11.9Hz，lH)、4.31(d，J=11.7Hz，lH)、3.81 (s，3H)，3.65(d，J=18. lHz，lH)、3.56-3.49(m，3H)，3.40(d，J=18.1Hz，1H)〇i3c 匪R (101MHz，CDCl3)Sl61.32、161.25、160.15、130.96、127.09、126.92、122.48、114.20、90.18、 68.52、58.50、56.41、55.52、43.62、28.69。
[0237]
[023引 （6R，7S)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基）-7-乙氧基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环
[4.2.0 ]辛-2-締-2-簇酸醋（3-2):产率=20 %。1h NMR( 400MHz，CDC13) S7.37 (d，J = 8.4Hz， 2H)、6.89(d，J = 8.細z，2H)、5.30(d，J= 11.8Hz，1H),5.21 (d，J= 11.8Hz，lH)、4.67(d，J = 1.8Hz，lH)、4.55(dd，J=1.8,0.4Hz，lH)、4.41(d，J = 11.8Hz，lH)、4.31(d，J=11.8Hz，lH)、 3.81(s，3H)、3.77-3.68(m，2H)、3.64(d，J = 18.0Hz，lH)、3.40(d，J=18.0Hz，lH)，1.29- 1.23(m，4H)〇Uc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl61.56、161.35、160.14、130.98、127.17、126.95、 122.31、114.19、89.02、68.51、67.27、57.12、55.52、43.65、28.71、15.：M。
[0239]
[0240] (6R，7S)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基）-7-异丙氧基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环 [4.2.0 ]辛-2-締-2-簇酸醋（3-3):产率=23 %。1h NMR( 400MHz，CDC13) S7.34 (d，J = 8.細Z， 2H)、6.87(d J = 8.細z，2H)、5.26(dJ = 5.細z，lH)、5.20(dJ = 4.4Hz，lH)、4.73(dJ = 1.7Hz，lH)、4.68(d，J=l.細z，lH)、4.40(d，J= 11.8Hz，1H)、4.33(d，J= 11.8Hz，1H) ,3.77 (s，3H)、3.60(d，J=18.1Hz，lH)、3.42(d，J = 22.2Hz，lH)，1.21(dd，J=17.6,6.1Hz，6H)〇Uc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl67.94、160.92、158.69、130.95、130.90、126.84、124.72、122.25、 114.23、114.19、87.81、74.69、68.55、61.17、59.24、55.51、43.29、28.67、22.58。
[0241]
1234 (6R，7S)-4-甲氧基苄基7-(叔下氧基)-3-(氯甲基)-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环 2
[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋（3-4):产率=33%。4醒1?(4001化，〔0(：13)87.36((1，1 = 2.1化， 2H)、6.89(d，J = 3.9Hz，2H)、5.30(d，J=11.8Hz，lH)、5.20(d，J=11.8Hz，lH)、4.74(d，J = 3 1.9Hz，lH)、4.68(d，J=1.9Hz，lH)、4.42(d，J=11.8Hz，lH)、4.33(d，J=18.2Hz，lH)、3.78 4 (s，3H)、3.61(d，J=18.1Hz，lH)、3.42(d，J = 23.2Hz，lH)、1.25(s，9HKUc 醒R(l〇lMHz， CDC13)S168.01、162.66、158.68、130.97、130.91、126.84、124.70、122.02、114.24、83.09、 76.69、68.57、61.19、55.52、43.30、28.70、28.10。
[0243]
[0244] (6R，7S)-4-甲氧基苄基7-(节氧基）-3-(氯甲基)-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环
[4.2.0]辛-2-締-2-簇酸醋（3-5):产率=18%。4醒1?(4001化，〔0(：13)87.82((1，1 = 8.4化， 2H)、7.41-7.31(m，5H)、6.88(d，J = 8.8Hz，2H)、5.22(dd，J = ：M.3，ll.細z，2H)、5.11(d，J = 1.8Hz，lH)、4.74(d，J=l.細z，lH)、4.67(s，lH)、4.36(dd，J = 27.1，11.9Hz，2H)、3.79(s, 3H)、3.59(d，J=18.1Hz，lH)、3.38(d，J=18.1Hz，lHKUc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl60.85、 160.19、156.85、146.53、131.82、131.00、130.54、128.76'128.55、127.80'127.20、126.73、 126.67、125.12、114.25、83.70、68.63、65.45、57.31、55.53、28.52、22.04。
[0245]
123456 (6R，7S)-4-甲氧基苄基3-(氯甲基)-8-氧代-7-(甲苯横酷氧基)-5-硫杂-1-氮杂 双环[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋（3-6):产率=20%。111醒1?(4001化，〔0(：13)87.83((1，1 = 8.2Hz，lH)、7.36(dd，J = 22.4,8.3Hz，3H)、7.02(d，J = 8.1Hz，lH)、6.89(d，J = 8.細z，2H)、 6.74(dJ = 8.4Hz，lH)、5.23(ddJ = 35.8，11.7Hz，2H)、5.11(ddJ = 1.8，1.2Hz，lH)、4.79- 4.73(m，lH)、4.37(dd，J = ：M.3、11.9Hz，2H)、3.81(s，3H)、3.61(d，J=18.1Hz，lH)、3.40(d， J=18.1Hz，lH)、2.47(s，3H)cUc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl71.44、160.84、160.16、156.87、 146.56、131.78、130.97、130.56、128.81、128.50、126.66、125.21、114.14、83.68、68.58、 64.97、57.25、55.49、43.19、28.46、22.01。 2 实施例6 3 (6R，7S)-4-甲氧基苄基7-烷氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2护色締-7-基)氧基）甲 基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-締-2-簇酸醋（6)的制备:化合物6根据化adley等， 4 (1999)Int.J.Antimic;rob.Agents 11 :93-100及Papp-Wallace等，（2011) Antimicrob.Agents化emother. 55:4943-4960来合成，其通过引用[^其整体并入本文。将 舰化钢(1.0当量)添加至3(1.0当量)在丙酬中的溶液。将所得的混合物在室溫揽拌一小时， 并然后在减压下去除溶剂。添加水并用乙酸乙醋萃取S次。然后将合并的有机层用化2S2O3 5 水溶液和盐水洗涂，经MgS化干燥。将粗产物在下一步直接使用。在室溫，将W上产物（1.0当 量）、1(2(：03(3.0当量)和7-径基香豆素(2.0当量)在乙腊中的混合物揽拌2.5小时。溶剂随后 在减压下被去除，且剩余物被溶解于水中并用乙酸乙醋萃取。将合并的有机层用化2S2O3水 6 溶液和盐水洗涂，经MgS化干燥。使用在短硅胶柱上的快速层析去除无机杂质和过量的7-径 基香豆素的大部分。将所得的包含两种异构体的化合物4溶解于C此Cb中，并且然后在0°C， W数批添加3-氯过氧苯甲酸(m-CPBA，68%，1.0当量）。在0°C揽拌30min之后（用化C监测）， 将反应混合物用C此Cb稀释，并随后用化2S2O3(水溶液）、化H(X)3(水溶液）和盐水洗涂。经 MgS化干燥，随后用在短硅胶柱上的快速层析纯化，W获得化合物5。将S氣乙酸酢（TFAA) (5.0当量)逐滴添加至在0°C在无水丙酬中的化合物5(1.0当量)和化K5.0当量）的混合物。 将所得的混合物在0°C揽拌一小时，并然后在减压下去除溶剂和挥发性试剂。将剩余物溶解 于化肥化（水溶液）中并用乙酸乙醋萃取。在硅胶柱上的快速层析纯化之后，获得作为固体 的标题化合物6。化合物6的实施方案(化合物6-1至6-6)分别分别通过使用醇类甲醇、乙醇、 异丙醇、叔下醇、节醇和甲苯横酷酸合成：
[024(
[0250] (6R，7S)-4-甲氧基苄基7-甲氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色締 -7-基)氧基）甲 基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋（6-1):产率=33%。111醒1?(4001化， CDCl3)S7.61(d J = 9.甜z，lH)、7.32(dJ = 8.2Hz，3H)、6.82(dJ = 8.7Hz，2H)、6.75(dd，J = 8.6,2.4Hz，lH)、6.70(d，J = 2.3Hz，lH)、6.24(d，J = 9.甜z，lH)、5.24(s，2H)，4.81(q，J = 12.4Hz，2H)、4.68(d，J=1.7Hz，lH)、4.52(d，J=1.7Hz，lH)、3.75(s，3H)、3.63(d，J = 18.3Hz，2H)、3.52(s，3H)、3.46(d，J=18.3Hz，2H)</3c NMR(101MHz，CDCl3)Sl61.34、 160.15、155.88、143.50、131.00、129.19、126.94、122.72、114.20、113.81、113.34、112.79、 102.09、90.32、68.47、67.29、58.47、56.29、55.51、27.82。
[0251]
(6R，7S)-4-甲氧基苄基7-乙氧基-8-氧代-3-( ((2-氧代-2H-色締 -7-基）氧基）甲 基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋（6-2):产率=30%。111醒1?(4001化， CDCl3)S7.63(d，J = 9.6Hz，lH)、7.34(dd，J = 8.6,3.1Hz，3H)、6.84(d，J = 8.7Hz，2H)、6.76 (dd J = 8.6,2.甜z，lH)、6.72(dJ = 2.3Hz，lH)、6.27(dJ = 9.甜z，lH)、5.25(dJ=l.細z， 2H)、4.82(q，J=12.5Hz，2H)、4.67(d，J=l.細z，lH)、4.56(d，J=l.細z，lH)、3.77(s，3H)、 3.76-3.62(m，2H)、3.62(d，J=18.3Hz，lH)、3.46(d，J=18.3Hz，lH)、1.26(t，J = 7.0Hz， 3H)〇Uc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl71.30、161.71、161.62、161.23、160.17、155.91、143.45、 131.04、129.15、126.92、122.53、114.21、113.87、113.35、112.77、102.16、89.19、68.48、 67.32、67.25、60.65、57.03、55.51、27.83、15.34。
[0 巧 3]
[0254] (6R，7S)-4-甲氧基苄基7-异丙氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色締 -7-基)氧基） 甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋(6-3):产率 = 29%。lHNMR(400MHz， CDCl3)S7.64(d，J = 9.5Hz，lH)、7.43-7.27(m，3H)、6.86(dd，J=10.8,5.4Hz，2H)、6.80- 6.69(m，2H)、6.28(dd，J = 9.5,2.6Hz，lH)、5.26(dt，J=16.6,8.4Hz，2H)、4.96-4.79(m, 2H)、4.74(dd J = 25.3，1.8Hz，lH)、4.58(dd J = 21.2，1.8Hz，lH)、3.78(s，3H)，3.64(d J = 7.3Hz，lH)、3.58(d J= 17.2Hz，1H)、3.46(dJ= 18.3Hz，lH)、1.24(dd J= 18.7,6.1Hz, 6H)〇i3c 醒R(101MHz，CDCl3)Sl67.89、162.69、161.47，160.14、155.66、144.40、131.08、 131.01、129.33、127.08、126.87、123.25、114.27、114.23、113.48、113.38、113.29、102.15、 87.76、74.92、68.58、67.31、58.40、55.52、27.84、22.63、22.52。
[0 巧5]
[0256] (6r，7s)-4-甲氧基苄基7-(叔下氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2护色締 -7-基）氧 基）甲基）-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋（6-4):产率=33 % NMR (400MHz，CDCl3)S7.62(d，J = 9.5Hz，lH)、7.34(t，J = 8.0Hz，3H)、6.84(d，J = 8.5Hz，2H)、 6.79-6.71(m，2H)、6.26(d，J=9.5Hz，lH)、5.28-5.19(m，2H)、4.85-4.75(m，2H)、4.65(d，J = 1.4Hz，lH)、4.55(d，J=1.4Hz，lH)、3.77(s，3H)、3.61(d，J=18.1Hz，lH)、3.46(dd，J = 9.4,8.8Hz，2H)、1.26(s，9H)〇Uc 醒R(101MHz，CDCl3)Sl71.37、167.94、162.76、161.74、 161.18、161.09、160.17、158.79、155.89、143.45、131.02、129.19、127.34、126.89、126.57、 125.21'122.18、114.22、113.86、113.38、112.74、102.15、83.25、68.57、67.12'61.35、 59.11、55.51、28.09、21.29。
[0 巧 7]
[0258] (6R，7S)-4-甲氧基苄基7-(节氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2护色締 -7-基)氧基） 甲基)-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸醋(6-5):产率 = 23%。lHNMR(400MHz， CDCl3)S7.62(d，J = 9.5Hz，lH)、7.36(d，J = 0.5Hz，4H)、7.：34(s，lH)，7.33(d，J = 3.2Hz， lH)、6.85(d，J = 8.7Hz，3H)、6.80-6.64(m，3H)、6.27(d，J = 9.5Hz，lH)、5.26(d，J=1.5Hz， 2H)、4.87(t J = 3.細z，lH)、4.83(dJ = 4.1Hz，lH)、4.80(dJ = 3.1Hz，lH)、4.79-4.76(m, IH)、4.64(d，J= 1.細z，lH)、4.59(d，J=1.8Hz，1H)、3.77(s，3H)、3.58(d，J= 18.2Hz，1H)、 3.42(d，J=18.3Hz，lH)〇Uc NMR(101MHz，CDCl3)Sl61.59、161.50、161.22、161.16、160.18、 155.91'143.42、136.23、131.05、129.14、128.94、128.79、128.60、126.92、122.93、114.26、 114.22、113.88、113.36、112.74、102.17、88.52、83.92、73.55、68.49、67.28、57.12、55.51、 27.75。
[0 巧9]
[0260] (6R，7S)-4-甲氧基苄基8-氧代-3-(((2-氧代-2护色締-7-基）氧基）甲基）-7-(甲 苯横酷氧基）-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-締-2-簇酸醋（6-6):产率=12%醒R (400MHz，CDCl3)S8.01(s，lH)、7.84(d J = 8.5Hz，2H)、7.63(d J = 9.6Hz，lH)、7.42-7.27 (m，5H)、6.85(d，J = 8.7Hz，2H)、6.76(dd，J = 8.6,2.5Hz，lH)、6.72(d，J = 2.4Hz，lH)、6.28 (d J = 9.甜z，lH)、5.28-5.17(m，2H)，5.12(dJ=l.細z，lH)、4.86(qJ=12.7Hz，2H)、4.78 (d，J= 1.7Hz，IH)、4.62(s，IH)、3.78(s，3H)、3.62(d，J= 18.3Hz，lH)、3.46(d，J= 18.3Hz, lH)、2.47(s，3H)。
[0261] 实施例7
[O%2] 最终的巧光探针的制备:将化合物6添加至C出CI2: TFA: TIPS:此0 = 30:65:2.5:2.5 的溶液(4mL)，并且在0°C揽拌混合物30min(用HPLC监测）。在C18柱上RP-HPLC纯化，获得所 期望的最终探针。
[0%3]
[0264](邮，78)-7-甲氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2护色締 -7-基）氧基）甲基）-5-硫杂-1- 氮杂双环[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸（（3)-〇：-1).产率=77%。4醒1?(4001化，(16-0150)57.97 (d J = 9.細z，lH)、7.62(dJ = 8.細z，lH)、7.01(dJ = 2.2Hz，lH)、6.95(dd，J = 8.6,2.4Hz， lH)、6.28(d，J = 9.5Hz，lH)、5.01(d，J=1.6Hz，lH)、4.86(dd，J = 26.5，11.9Hz，2H)、4.75 (d，J=1.7Hz，lH)、3.70(d，J=18.1Hz，lH)、3.55(d，J=18.1Hz，lH)，3.43(s，3H)〇Uc 醒R (101MHz，d6-DMS0)5163.45、161.94、161.80、160.89、155.93、144.93、132.96、130.26、 128.14、121.16、113.46、102.18、89.60、67.80、57.99、55.90、27.65。]?5:对于(：1姐15順曰〇75+ ([M-扣+ )计算值:412.37;发现值化ound) :412.06。
[02 化]
[0266] (63,75)-7-乙氧基-8-氧代-3-(((2-氧代-2护色締 -7-基)氧基）甲基)-5-硫杂-1- 氮杂双环[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸（（3)-〇：-2).产率=80%。4醒1?(4001化，(16-0150)57.98 (d J = 9.細z，lH)、7.63(dJ = 8.細z，lH)、7.01(dJ = 2.4Hz，lH)、6.96(dd，J = 8.6,2.4Hz， 1H)、6.29(d，J = 9.5Hz，lH)、4.95(d，J=l.細z，lH)、4.85(d，J= 15.7Hz，2H)、4.77(d，J = 1.4Hz，lH)、3.74-3.65(m，2H)，3.62(d，J = 7.0Hz，lH)、3.55(d，J=18.1Hz，lH)、1.16(t，J = 7. OHz，3H) eMS:对于Cl姐i6N〇7S-( [M-扣-)计算值:402.41;发现值:402.00。
[0%7]
[0268] (6R，7S) -7-异丙氧基-8-氧代-3-( ((2-氧代-2H-色締-7-基)氧基）甲基)-5-硫杂- 1 -氮杂双环[4.2.0 ]辛-2-締-2-簇酸（（S) -CC-3).产率=83 %。1h 醒R(400MHz，ds-DMSO) S 7.98(d，J = 9.2Hz，lH)、7.62(d，J = 8.7Hz，lH)、7.01(d，J = 2.4Hz，lH)、6.95(dd，J = 8.6， 2.甜z，lH)、6.29(d，J = 9.5Hz，lH)、4.89(d，J=11.9Hz，lH)、4.84(d，J=1.7Hz，lH)、4.81 (d J=11.9Hz，lH)、4.77(d，J=1.7Hz，lH)、3.82(dd，J=12.2,6.1Hz，lH)、3.70(d，J = 18.0Hz，lH)、3.54(d，J=18.1Hz，lH)、1.15(dd，J = 9.3,6.1Hz，6H)〇Uc Mffi(l〇lMHz，d6- DMS0)S163.48、162.50、161.81、160.90、155.94、144.95、130.26、128.23、121.00、113.48、 102.19、87.32、74.02、67.80、58.05、40.81、40.60、40.39、40.18、39.97、39.77、39.56、 27.67、22.97、22.89。]?5:对于〔2地18側75-([]\1-扣-)计算值:416.43;发现值:416.03。
[0269]
[0270] (6R，7S)-7-(叔下氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2护色締 -7-基)氧基）甲基)-5-硫 杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸（（3)-〇：-4).产率=75%。4醒1?(4001化，(16-0150) 57.98(d J = 9.2Hz，lH)、7.62(d J = 8.7Hz, 1H)、7.01 (dj = 2.4Hz，1H)、6.95(dd，iH NMR (400MHz，DMS0)S7.98(d，J = 9.Wz，lH)、7.62(d，J = 8.7Hz，lH)、7.01(d，J = 2.3Hz，lH)、 6.98-6.92(m，lH)、6.29(d，J = 9.甜z，lH)、4.89(d，J=12.0Hz，lH)、4.83(d，J=1.7Hz，lH)、 4.80(s，lH)，4.76(d J=l.細z，lH)、3.68(dJ= 18.0Hz，lH)、3.53(d J= 18.0Hz，1H)、1.19 (s，9H)〇Uc 匪R(101MHz，d6-DMS0)Sl63.53、163.14、161.81、160.91、155.93、144.96、 130.26、121.16'113.50、102.19'82.72、76.56'67.79、59.09'28.16、27.61 oMS:对于 C21 出 oN〇7S_ ([ M-扣-)计算值:430.46;发现值:430.00。
[0271]
[0272] (6R，7S)-7-(节氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色締-7-基)氧基）甲基)-5-硫杂- 1 -氮杂双环[4.2.0 ]辛-2-締-2-簇酸（（S) -CC-5).产率=72 %。1h NMR(400MHz，ds-DMSO) S 7.98(d J = 9.4Hz，lH)、7.63(d J = 8.4Hz，lH)、7.36(dd J=12.8,4.2Hz，4H)、7.01(s，lH), 6.95(d，J = 8.9Hz，lH)、6.29(d，J = 9.5Hz，lH)、4.94(s，lH)，4.91(s，lH)、4.87(d，J = 1.7Hz，lH)、4.82(d，J = 11.9Hz，lH)、4.73(d，J=11.4Hz，lH)、4.63(d，J=11.5Hz，lH)、3.60 (ddJ = 52.7，18.1Hz，2H)d13c 匪R(101MHz，CD3〇D)S162.23、146.95、144.47、143.24、 129.39、128.46、128.31、128.24、126.45、124.31、113.02、112.59、101.55、88.27、72.94、 67.09、56.94、26.94dMS:对于 C2 化 8NO7S- ([ M-H]-)计算值:464.48;发现值:464.17。
[0273]
[0274] (6R，7S)-8-氧代-3-( ((2-氧代-2H-色締 -7-基)氧基）甲基)-7-(甲苯横酷氧基)- 5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-締 -2-簇酸（（S)-CC-6).产率=70%。4醒1?(4001化，(16- DMS0)S7.98(d，J = 9.甜z，lH)、7.88(d，J = 8.4Hz，2H)、7.62(d，J = 8.細z，lH)、7.52(d，J = 8.4Hz，2H)、7.00(d，J = 2.4Hz，lH)、6.94(dd，J = 8.6,2.4Hz，lH)、6.29(d，J = 9.5Hz，lH)、 5.62(d，J=1.5Hz，lH)、5.06(d，J=1.7Hz，lH)、4.90(dd，J = 36.4，12.3Hz，2H)、3.60(dd，J =41.3，18. IHz，3H)、2.43(s，3H) dMS :对于C2祖isN〇9S2-( [M-H]-)计算值：528.54;发现值： 527.88。
[0275]
[0276] (6R，7S)-7-(叔下氧基)-8-氧代-3-(((2-氧代-2H-色締-7-基)氧基）甲基)-5-硫 杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-締-2-簇酸5-氧化物（（s)-CC-7)1h NMR(400MHz，CD30D)S7.87 (d，J = 9.6Hz，lH)、7.54(d，J = 8.4Hz，lH)、6.95(dd，J = 11.6,3. lHz，2H)、6.25(d，J = 9.5Hz，lH)，5.44-4.98(m，2H)，4.61(d，J = 50.3Hz，2H)、4.15(d，J=16.5Hz，lH)、4.06(d，J =18.細z，lH)、3.90(d，J= 16.0Hz，1H)、3.74-3.59(m，lH)、1.31 (s，lH) oMS:对于C21H20NO8S ([M-H]-)计算值:446.46;发现值:445.98。 脚7] 实施例8
[027引
[0279] 1h 醒R(400MHz，DMS0)S8.09(d，J = 9.1Hz，lH)、7.98(s，lH)、7.86(d，J = 7.8Hz， 2H)、7.51(d，J = 8.1Hz，2H)、7.32(dd，J = 9.2，l.細z，lH)、5.41(s，lH)、4.96(dd，J = 25.3， 11.細z，2H)、4.84(s，lH),3.52(d，J=17.4Hz，lH)、3.35(d，J=17.0Hz，4H)、2.42(s，3H)〇Uc 醒R(101MHz，CD3〇D)S172.08、166.42、162.95、158.54、157.99、157.77、147.87、146.62、 137.69、131.99、130.37、128.19、127.43、126.52、124.76、117.30、105.14、84.02、78.20、 67.01、57.19、48.50、48.29、48.08、47.87、47.65、47.44、47.23、34.79、26.87、20.66〇MS:对 于 C2 姐 21 化 〇9S4( [M+H] +)计算值：648.02;发现值：648.40。
[0280] 实施例9
[0281]
[0282] 1h 醒R(400MHz，DMS0)S8.04(d，J = 9.1Hz，lH)、7.79(d，J = 2.3Hz，lH)、7.20(dd，J = 9.1，2.甜z，lH)、5.47-5.36(m，lH)、4.88-4.82(m，2H)、4.77(dJ = 1.0Hz，lH)、3.88-3.80 (m，lH)、3.80-3.75(m，lH)、3.73(s，lH)、3.68(d，J = 8.3Hz，lH)、3.58(d，J=18.1Hz，2H)、 1.15(dd，J = 8.7，6. IHz，6H) dMS :对于C22出 1化O7S3([M+H] +)计算值：536.05;发现值：536.40。
【主权项】
1. 一种组合物，所述组合物包含可被金属-β-内酰胺酶选择性裂解的探针，所述探针包 含具有6,7_反式构型的头孢菌素和附连至其的可检测的标记物。2. 如权利要求1所述的组合物，其中所述探针具有式I或式II:其中，R:选自由以下组成的组:烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基团、荧光 团及荧光猝灭剂。3. 如权利要求1所述的组合物，其中Ri选自由以下组成的组：甲基、乙基、异丙基、叔丁 基、苄基-及甲苯磺酰氧基_。4. 如权利要求1所述的组合物，其中所述可检测的标记物通过-0-、_N-或-S-连接被附 连至所述头孢菌素。5. 如权利要求1所述的组合物，其中所述可检测的标记物是具有以下结构的（2-氧代-2H-色烯-7-基）（111)或（43)-2-(6-氧代-1，3-苯并噻唑-2-基）-4,5-二氢噻唑-4-羧酸 (IV)：6. 如权利要求1所述的组合物，其中所述探针选自由以下组成的组：7. -种选择性检测金属-β-内酰胺酶活性的方法，所述方法包括使怀疑具有金属-β-内 酰胺酶活性的样品与包含可被金属-β_内酰胺酶选择性裂解的探针的组合物接触，所述探 针包含具有6，7_反式构型的头孢菌素部分和可检测的标记物；允许金属-β-内酰胺酶活性 裂解所述头孢菌素部分的有效时间段，从而从所述头孢菌素部分释放所述可检测的标记 物，藉此生成可检测的信号；并且检测所述信号，其中可检测的信号指示所述样品包含金 属-β_内酰胺酶活性或金属-β_内酰胺酶活性的来源。8. 如权利要求7所述的方法，其中所述探针具有式I或式II:其中Ri选自由以下组成的组:烷基、被取代的烷基、芳族基团、被取代的芳族基团、荧光 团及荧光猝灭剂。9. 如权利要求8所述的方法，其中心选自由以下组成的组：甲基、乙基、异丙基、叔丁基、 苄基-及甲苯磺酰氧基-。10. 如权利要求7所述的方法，其中所述可检测的标记物是染料、荧光标记物、放射性标 记物、萤光素酶底物或猝灭剂。11. 如权利要求7所述的方法，其中所述可检测的标记物通过-0-、-N-或-S-连接被附连 至所述探针。12. 如权利要求7所述的方法，其中所述可检测的标记物是具有以下结构的（2-氧代-2H-色烯-7-基）（111)或（43)-2-(6-氧代-1，3-苯并噻唑-2-基）-4,5-二氢噻唑-4-羧酸 (IV)：13. 如权利要求7所述的方法，其中所述探针选自由以下组成的组：14. 如权利要求7所述的方法，其中所述样品是细菌培养物。15. 如权利要求7所述的方法，其中所述样品已从动物受试者或人受试者分离。16. 如权利要求14所述的方法，其中所述样品是由来自人受试者或动物受试者的样品 产生的细菌培养物。17. 如权利要求所述的方法，其中所述样品包含克雷伯杆菌属物种(Klebsiella sp.) 或埃希氏杆菌属物种(Escherichia sp.)中的至少一种。18. 如权利要求12所述的方法，其中所述可检测的标记物是萤光素酶底物，并且所述方 法还包括使反应混合物与萤光素酶接触，从而在释放的萤光素酶底物的存在下生成可检测 的生物发光信号。
【文档编号】C07D501/14GK106061949SQ201580004972
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年1月15日
【发明人】饶江洪, 史海斌
【申请人】小利兰·斯坦福大学理事会