糖基化黄胭脂酮酸和/或胭脂酮酸的糖基转移酶的制作方法
【专利摘要】一种分离的糖基转移酶(GT)多肽，其能够：(Ⅰ)缀合葡萄糖到黄胭脂酮酸(FK)；和/或(II)缀合葡萄糖到胭脂酮酸(KA)以及使用该GT来例如制备胭脂红酸。
【专利说明】
糖基化黄朋脂酬酸和/或朋脂酬酸的糖基转移酶
技术领域
[0001 ]本发明设及一种分离的糖基转移酶(GT)多肤，其能够：（I):缀合葡萄糖到黄姻脂 酬酸（f lavokermesic acid) (FK);和/或（II):缀合葡萄糖到姻脂酬酸化ermesic acid) 化A)和使用该GT来制备例如姻脂红酸。
【背景技术】
[0002] 天然色素姻脂红酸是食品、药品、化妆品和纺织品的最常用的着色剂之一。
[0003] 姻脂红酸是一种着色剂，其可W从姻脂虫（Dactylopius coccus costa)(别名 Coccus cacti L.)的雌性昆虫体提取。运些昆虫生活在例如墨西哥，中美洲和南美洲及加 那利群岛的沙漠地区种植的Nopalea coccinellifera，0puntia fidus indica和仙人掌科 的其他植物上。根据抑，该着色剂可W是从澄色跨越红色到紫色的范围中的颜色，且通常被 称为姻脂虫红或姻脂色。姻脂红着色剂广泛用于食品和饮料。
[0004] 如本领域公知的，Por地yrophora polonica也产生姻脂红酸并且在例如波兰用于 生产姻脂红酸。
[0005] 关于目前的工业相关生产，通过用水或醇从昆虫的干体萃取来收获姻脂红酸。
[0006] 所述昆虫（姻脂虫）在仙人掌上培养，因此，供应可能相对昂贵且受到不期望的变 化和价格波动。
[0007] 为了尝试解决不期望的变化和价格波动的问题-US542442UEuropean Colour, 1995年出版)描述了通过设及不同的中间体的合成路线化学合成姻脂红酸。
[000引如例如W02006/056585A1 (化r.化nsen A/S)所讨论的-在从昆虫水基提取姻脂红 酸期间，一些的昆虫蛋白也从昆虫释放且将包含在有色提取物中，而且已经报道了姻脂虫 蛋白质可能产生一些过敏相关的问题。在W02006/056585A1中，描述了一种从昆虫提取液减 少昆虫蛋白的量的特殊工艺-然而，W02006/056585A1的最终产生的有色组合物/产物仍然 包括一定量的姻脂虫昆虫蛋白质。
[0009] 姻脂红酸的结构示于图1-可W看出运是一个所谓的C-葡萄糖巧（即，其中葡萄糖 通过碳-碳键被接合/缀合到配基(aglucon)。
[0010] 根据本领域-术语"糖巧配基(aglycon)"表示糖巧配基的相应糖基化形式的非碳 水化合物部分。当糖是葡萄糖时，糖巧配基可被称为配基。
[0011] 根据本领域-术语"糖巧(glycoside)"是指运样的化合物，其通过水解产生糖和非 糖(糖巧配基)残基，例如葡萄糖巧可产生葡萄糖，半乳糖巧可产生半乳糖。如图1所示-C-葡 萄糖巧姻脂红酸的水解产生葡萄糖和配基姻脂酬酸化A)。
[0012] 目前尚未详细描述参与姻脂红产生的体内昆虫（姻脂虫）生物合成途径-因此，根 据现有技术，本领域技术人员不知道在姻脂红酸的体内姻脂虫生物合成生产过程中何种化 合物是配基。
[0013] 姻脂虫的分析表明，与姻脂红酸有关的广泛化合物存在于姻脂虫提取物中并且许 多运些化合物原则上均可W在姻脂红酸的体内姻脂虫生物合成生产过程中葡糖化 (glucosylate)。
[0014] 例如，Sl:athopoulou等的文章（Analytics Qiimica Acta 804(2013)264-272)描 述了在姻脂虫的提取物中存在的六种新的蔥酿并且运六种新的蔥酿中的任一种(参见例如 本文的图1)原则上均可W是在姻脂红酸的体内姻脂虫生物合成生产过程中葡糖化的分子。
[0015] 此外，如本领域所公知的，在葡萄糖巧最终产品的体内生物合成生产过程中形成 的主要葡糖化化合物可W是不稳定的中间体化合物，其将不能从姻脂虫分离的提取物中鉴 定，如例如Stathopou 1OU等人的上述讨论的文章所分析的。
[0016] 根据现有技术，可W推测，姻脂红酸的体内姻脂虫生物合成生产过程中的相关主 要葡糖化化合物可W是例如具有与例如黄姻脂酬酸大约相同的碳原子数的不稳定中间体 聚酬化合物。
[0017] 根据本领域-术语"糖基转移酶"（GT)表示能够从活化的核巧酸糖转移糖到糖巧配 基W形成糖巧的糖基转移酶酶。
[0018] 现有技术未明确地描述本文相关的参与姻脂红酸的体内昆虫（姻脂虫)生物合成 途径的糖基转移酶的DNA或氨基酸序列。
[0019] 如本领域中已知的，对于累积低分子量化学物质的昆虫，相关生物合成途径基因 有时不存在于昆虫基因组中。
[0020] 例如，一些昆虫从它们食用的植物摄取糖巧-参见例如Zagrobelny等人的文章 (Cyanogenic glucosides and plant-insect interactions；Phytochemistry.2004Feb； 65(3) :293-306)或者Geuder等人的文章（Journal of 化emical Ecology，Vol.23,No.5， 1997)。此外，有时也在昆虫的微生物活体中发现相关生物合成途径基因，参见例如Genta等 人白勺文章（Potential role for gut microbiota in cell wall digestion and glucoside detoxification in Tenebrio molitor larvae, Journal of Insect Physiolog巧2(2006)593-601)。
[0021] 姻脂虫昆虫食用仙人掌类植物，可能是姻脂虫昆虫(类似其他昆虫)从它们食用的 仙人掌摄取相关糖巧。
[0022] 因此，基于现有技术，本领域技术人员可能不知道姻脂虫的基因组实际上是否包 括运样的基因，所述基因编码参与产生姻脂红酸的体内生物合成途径的糖基转移酶。
[0023] W02004/111254Al^oalis A/S)描述了通过在微生物细胞内使用葡糖基转移酶体 内缀合葡萄糖到香兰素配基而在例如真核细胞酵母细胞和/或原核大肠杆菌细胞中体内产 生香兰素的葡糖化形式。从植物香草豆芙获得天然香兰素。因此，在现有技术中，成功的体 内生产已在具有植物糖巧化合物(诸如例如香兰素葡萄糖巧)的微生物细胞中被描述。
【发明内容】
[0024] 本发明所要解决的问题设及提供可能导致姻脂红酸的生物合成途径中参与的糖 基转移酶(GT)和使用运种糖基转移酶制备例如姻脂红酸。
[0025] 正如本文的工作实施例所讨论的-本发明测序姻脂虫和微生物共生体的整个基因 组和转录组（即包括mRNA的RNA分子组）。
[0026] 分析从基因组和转录组得到的经鉴定的寡核巧酸序列与公知的C-糖基转移酶序 列的相似度，结果为阴性。基因组/转录组的经鉴定的基因序列都未显示与公知的C-糖基转 移酶序列的显著的相似度。
[0027] 如W上所讨论的-基于现有技术，本领域技术人员可能不知道姻脂虫的基因组实 际上是否包括运样的基因，所述基因编码参与产生姻脂红酸的体内生物合成途径的糖基转 移酶。然而，本发明人继续对此进行研究。
[0028] 如本文的工作实施例所讨论的-本发明人鉴定具有相关的GT活性的姻脂虫提取物 (包括存在于姻脂虫中的内共生体的提取物)并且通过相关纯化和检测步骤的组合，本发明 人终于能获得较纯的部分/组分，由此可能获得推定的GT酶候选物的几个部分氨基酸序列。
[0029] 比较运些酶候选物的部分氨基酸序列与转录组的确定的基因序列，并且在进一步 详细的工作之后，确定了编码糖基转移酶酶序列的序列-编码运种分离/克隆的新颖糖基转 移酶的多核巧酸序列WSEQ ID N0:1示出且多肤氨基酸序列WSEQ ID N0:2示出。
[0030] 可W将沈Q ID ^:2的糖基转移酶酶称为''0加612"。
[0031] 我们相信，所描述的分离/克隆的糖基转移酶是第一个描述的昆虫来源的糖基转 移酶。如上所述，分析了姻脂虫转录组的确定的基因序列与相关公众已知的糖基转移酶序 列的相似度，结果为阴性。
[0032] 本发明人发现，该公知的现有技术糖基转移酶序列与显示为SEQ ID N0:2的新颖 糖基转移酶多肤序列具有低于45%的同一性。
[0033] 如在本文的工作实施例所讨论的-本发明人测试了分离/克隆的新颖糖基转移酶 的活性，并发现它能够缀合葡萄糖到糖巧配基黄姻脂酬酸(FK)和姻脂酬酸化A)-见图1。
[0034] 葡糖化产物的分析表明，在可能形成的许多潜在的0-和C-葡萄糖巧产物当中，两 种底物的每一种均仅形成单种糖巧产物。分析结果表明，当使用UDP-葡萄糖作为糖供体底 物时，每一种产物都是通过GT在蔥酿结构的7位上GTC-葡糖化，更精确地是7-a-D-化喃葡糖 基-9，10-二氨-3，6，8-S径基-1-甲基-9，10-二氧杂蔥甲酸(Dell-见图1)和7-a-D-化喃葡 糖基-9,10-二氨-3,5,6,8四径基-1-甲基-9,10-二氧杂蔥甲酸(姻脂红酸-见图1)。
[0035] Gutmann等人的文章（Pure A卵1.化em，2013-07-09)描述了，即使一些C-糖巧已经 从天然来源分离，然而仅在极少数情况下已知负责它们的生物合成的酶，并且用于C-糖巧 生产的生物催化方法尚未建立。
[0036] Baig等人的文章（Angew Chem Int Ed Engl.2006NOV 27;45(46) :7842-6)描述了 一种称为化dGT2的糖基转移酶(GT)并解释说它能够缀合糖到本文可W认为较类似黄姻脂 酬酸(FK)和姻脂酬酸化A)的一些糖巧配基。
[0037] 因此，可W说，初步认为化dGT2可能是能够缀合糖到黄姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬 酸化A)的GT的合格猜测。
[0038] 如本文的工作实施例所讨论的-本发明人克隆了化dGT2并测试其对黄姻脂酬酸 (FK)和/或姻脂酬酸化A)的GT活性并发现化dGT2能够使用UDP-葡萄糖作为糖供体但化dGT2 没有葡糖化任何所测试的假定的糖巧配基-即，关于运些糖巧配基，未识别到GT活性。
[0039] 该化dGT2具有与本文公开的沈Q ID N0:2的15-20%的氨基酸同一性。
[0040] 基于公知的GT序列和未公知的GT序列两者-本发明人进行了不同的详细序列比对 研究。
[0041 ] 基于运些序列比对研究-我们认为SEQ ID NO:2的氨基酸20至约468包含催化结构 域的主要部分。
[0042] 基于运些序列比对研究-我们认为从SEQ ID NO: 2的大约291至约383的氨基酸包 括所谓的活化的核巧酸糖结合位点。
[0043] 基于运些序列比对研究-我们认为从SEQ ID N0:2的约1至约20的氨基酸包括所谓 的信号肤，并且我们认为该信号肤可W在不显著影响本文的酶的相关GT活性的情况下去 除。
[0044] 此外，我们认为，所述活化的核巧酸糖结合位点可W由类似的（例如现有技术已知 的）GT活化的核巧酸糖结合位点序列替代-诸如例如，由Radominska-Pandya A,Bratton SM'Redinbo MR'Miley MJ.Drug Metab Rev.2010Feb;42(l):133-44)和Plant Physiology，November 2008，Vol. 148，pp. 1295-1308描述的活化的核巧酸糖结合位点。
[0045] 因此，本发明的第一个方面设及分离的糖基转移酶多肤，其能够：
[0046] (I)缀合葡萄糖到黄姻脂酬酸(FK);和/或
[0047] (II)缀合葡萄糖到姻脂酬酸化A);
[004引且其中所述糖基转移酶多肤是选自由W下组成的组中的至少一种多肤：
[0049] (a)包含与SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少70%同一性的氨基酸序列的多 肤；
[0化0] (b)包含与SEQ ID N0:2的氨基酸20至468具有至少70%同一性的氨基酸序列的多 肤；
[0化1] (C)由在至少中等严格条件下与（i)SEQ ID N0:1的核巧酸1至1548或的互 补链杂交的多核巧酸编码的多肤;和
[0052] (d)为SEQ ID N0:2的氨基酸1至515的片段，其具有在（I)和/或（II)中指定的糖基 转移酶活性。
[0053] 如本领域技术人员在本发明上下文中理解的-第一方面的术语"糖基转移酶多肤， 其能够"设及的是所述糖基转移酶应该能够实现糖基转移酶（I)和/或（II)活性-但它也可 能或不能实现其它糖基转移酶活性。
[0054] 如本领域技术人员在本发明上下文中理解的-本文的公开内容所描述的新颖糖基 转移酶序列是识别除了姻脂虫之外的例如其他昆虫中的类似糖基转移酶的一种重要工具 并且不限于理论-我们认为，与SEQ ID N0:2具有至少70%同一性的序列将是本文另一相关 糖基转移酶的合理的良好侯选物。
[0055] 本发明的第二方面设及一种分离的多核巧酸，其包含编码第一方面和/或其本文 相关的实施方案的多肤的核巧酸序列。
[0056] 本发明的第=方面设及包含第二方面和/或其本文相关的实施方案的分离的多核 巧酸的核酸构建体，其可操作地连接到引导多肤在表达宿主中产生的一种或多种控制序 列。
[0057] 本发明的第四方面设及一种重组表达载体，其包括第=方面和/或其本文相关的 实施方案的核酸构建体。
[005引本发明的第五个方面设及一种重组宿主细胞，其包含第=方面和/或其本文相关 的实施方案的核酸构建体。
[0059]如W上所讨论的-根据现有技术，本领域技术人员不知道何种化合物是姻脂虫体 内生物合成生产姻脂红酸过程中的主要糖基化化合物。
[0060] 已经显示，姻脂虫包含能够c-糖基化黄姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)的GT。
[0061] 显而易见的是，运个重要的知识足W实现例如生产姻脂红酸的目的而不需要从昆 虫提取，从而能够制备基本上不含有例如不需要的姻脂虫昆虫蛋白质的姻脂红酸有色组合 物/产品。
[0062] 因为本领域技术人员不知道何种化合物在体内姻脂虫生物合成生产姻脂红酸的 过程中被糖基化，实际上本领域技术人员不知道在自然界中是否实际存在能够C-糖基化黄 姻脂酬酸糖巧配基和/或姻脂酬酸糖巧配基的糖基转移酶。
[0063] 我们认为，本文公开的新的糖基转移酶代表首次分离的能够糖基化黄姻脂酬酸糖 巧配基和/或姻脂酬酸的糖基转移酶。
[0064] 因此，基于本文的技术公开内容-我们认为本领域技术人员将能够识别能够糖基 化黄姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)的其他合适的糖基转移酶。
[0065] 本领域技术人员应当理解，试图确定有机体/植物是否包括相关的糖基转移酶的 一种方法可W是使相关的糖巧配基（即FK和/或KA)与有机体/植物(体内和/或体外)接触并 测定所述有机体/植物是否产生相关的FK和/或KA糖巧。
[0066] 如本文所理解的，如果所述有机体/植物产生相关的FK和/或KA糖巧，则所述有机 体/植物将包括相关的糖基转移酶-即能够使黄姻脂酬酸糖基化W产生黄姻脂酬酸糖巧； 和/或能够使姻脂酬酸糖基化W产生姻脂酬酸糖巧的糖基转移酶。
[0067] 如下面所讨论的-根据上面的策略，本发明人发现可W在芦苔(Aloe)植物，十二卷 化awodhia)植物，高梁或稻植物中识别相关糖基转移酶。
[0068] 因此，本发明的第六个方面设及一种用于产生黄姻脂酬酸(FK)糖巧和/或姻脂酬 酸化A)糖巧的方法，其中所述方法包括W下步骤：
[0069] (A):在体外或体内在包含编码糖基转移酶的糖基转移酶基因的重组宿主细胞中 使：
[0070] (al):黄姻脂酬酸(FK)与能够糖基化黄姻脂酬酸的糖基转移酶在产生黄姻脂酬酸 糖巧的合适条件下接触;和/或
[0071] (a2):姻脂酬酸化A)与能够糖基化姻脂酬酸的糖基转移酶在产生姻脂酬酸糖巧的 合适条件下接触。
[0072] 术语"重组宿主细胞"在本文中应根据本领域来理解。如本领域中公知的，重组多 核巧酸(例如DNA)分子是通过基因重组的实验室方法(例如分子克隆)将来自多个源的遗传 物质汇集在一起，创建不能W其他方式在生物有机体中发现的序列而形成的多核巧酸(例 如DNA)分子。如本领域技术人员可W理解的-重组宿主细胞包含重组多核巧酸(例如DNA)分 子，因此，就运一点而论，重组宿主细胞将不会被理解为包括天然野生型细胞-诸如例如天 然野生型姻脂虫细胞。
[0073] 换句话说并如本领域技术人员可W理解的-例如天然野生型姻脂虫细胞同样地不 包含编码糖基转移酶的重组糖基转移酶基因。
[0074] 可优选的是，步骤(A)中的重组宿主细胞是包含编码糖基转移酶的重组糖基转移 酶基因的重组宿主细胞。
[0075] 如本文所讨论的-在工作实施例使黄姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)与SEQ ID N0:2的糖基转移酶在体外接触。运可W看作是本领域技术人员执行运样的体外接触步骤的 常规工作。
[0076] SEQ ID N0:2的糖基转移酶在酵母细胞中重组表达(参见工作实施例)-因此，制成 了包含编码SEQ ID NO:2的糖基转移酶的重组糖基转移酶基因的重组酵母宿主细胞。
[0077] 我们认为，如果黄姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)可W在适当的条件下加入到 发酵培养基中，FK和/或KA化合物可W进入例如培养基中发酵的酵母细胞中-因此，如果例 如酵母细胞是包含编码糖基转移酶的重组糖基转移酶基因的重组酵母宿主细胞，则可W在 FK和/或KA的重组宿主细胞中进行与糖基转移酶的体内接触。
[007引在例如W上所讨论的W02004/111254Al(Poalis A/S)中，在不同的重组宿主细胞 中进行不同的糖巧配基化合物的运种体内接触，而且本领域技术人员将知道如何在相关糖 巧配基(运里是黄姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A))的重组宿主细胞中进行和重组表达的 糖基转移酶的体内接触。
[0079] 如上所讨论的-我们认为本文公开的新的糖基转移酶代表首次公开了分离的能糖 基化黄姻脂酬酸糖巧配基和/或姻脂酬酸糖巧配基的糖基转移酶。
[0080] 据认为，本文所公开的SEQ ID N0:2的新颖糖基转移酶的有关部分序列可W重组 引入到另一个糖基转移酶序列中W便构建能够葡糖化黄姻脂酬酸和/或姻脂酬酸的新的混 合糖基转移酶序列。具有减少的Km或增加的Vmax的运种GT可W证明确保底物的快速葡糖化 的重要性，所述底物当高水平累积时可能显示抑制酵母生长的毒性作用化sben化化jaer 化nsen et 31.陆八〇油6111131:巧70(4):473-482)。同样地，如果需要的话，可^设想可特异 地对前期路径中间体的葡糖化来修饰底物。
[0081] 因此，本发明的另一个方面设及用于构建新颖的分离的混合糖基转移酶多肤的方 法，所述新颖的分离的混合糖基转移酶多肤能够：
[0082] (I):缀合葡萄糖到黄姻脂酬酸(FK);和/或
[0083] (II)缀合葡萄糖到姻脂酬酸化A)，
[0084] 其中所述方法包括W下步骤：
[00化](i):将编码具有与SEQ ID N0:2的氨基酸1至515至少70%同一性的氨基酸序列片 段(优选具有与SEQ ID N0:2的氨基酸1至515至少90%同一性的氨基酸序列片段，更优选具 有与SEQ ID N0:2的氨基酸1至515至少99%同一性的氨基酸序列片段）的多核巧酸序列插 入来自糖基转移酶的另一多核巧酸序列W便由此构建新的重组混合多核巧酸序列，其中所 述片段包含至少75个氨基酸(优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸和甚至更优 选至少468个氨基酸）；
[0086] (ii):表达由步骤(i)的新的重组混合多核巧酸序列编码的新的混合多肤；
[0087] (iii):分离步骤(ii)的表达的新的混合多肤；
[0088] (iv):测试步骤(iii)的分离的新的混合多肤是否能够：
[0089] (I):缀合葡萄糖到黄姻脂酬酸(FK);和/或
[0090] (II)缀合葡萄糖到姻脂酬酸化A);和
[0091] ( V )如果步骤(iv)的测试阳性，则已经构建了运样一种新的分离的混合糖基转移 酶多肤，其能够：
[0092] (I):缀合葡萄糖到黄姻脂酬酸(FK);和/或
[0093] (II)缀合葡萄糖到姻脂酬酸化A)。
[0094] 定义
[00%]相关术语的所有定义按照能由技术人员关于相关的技术背景所能理解的。
[0096] 术语"糖巧配基"表示糖巧配基的相应糖基化形式的非碳水化合物部分。当糖是葡 萄糖时，可W将糖巧配基称为配基。此外，当糖是葡萄糖时，术语葡糖化可W代替糖基化使 用。
[0097] 当糖巧配基在径基处糖基化时，通常产生所谓的0-糖巧键-即所谓的0-糖巧(或者 如果糖是葡萄糖，则为0-葡萄糖巧）。
[0098] 当糖巧配基通过碳-碳键糖基化时，其也可W被称为C-糖巧键-即所谓的C-糖巧 (或如果糖是葡萄糖时，则为C-糖巧）。
[0099] 术语"糖巧"是指水解时可W得到糖和非糖(糖巧配基)残基的化合物，例如，葡萄 糖巧可产生葡萄糖，半乳糖巧可产生半乳糖
[0100] 术语"糖基转移酶"是指能够缀合核巧酸激活的糖到化合物(例如，糖巧配基化合 物）的酶。糖可W例如是半乳糖，葡糖胺，N-乙酷氨基葡萄糖(N-acetylglusamine)，木糖，葡 萄糖醒酸，鼠李糖，阿拉伯糖，甘露糖或葡萄糖的D和L异构体。或者，所述糖可W是可用作核 巧酸二憐酸醋的碳水化合物衍生物，诸如，例如肌醇，橄揽糖（olivose)，夹竹桃糖 (rhodinose)等。此外，所述糖可W例如是单糖，二糖或S糖。在低聚和多糖的情况下，糖被 逐一链接，通过例如设及使用一个或多个糖基转移酶。如果糖是葡萄糖，可W将糖基转移酶 称为葡糖转移酶。
[0101] 当糖基转移酶通过C-糖巧键缀合核巧酸激活糖到化合物，可W将其称为C-糖基转 移酶。
[0102] 当糖基转移酶通过0-糖巧键缀合糖到糖巧配基，可W将其称为0-糖基转移酶。
[0103] 术语"杂交"设及多核巧酸在至少中等严格条件与（i)SEQ ID NO: 1的核巧酸1至 1548或的互补链杂交，设及核巧酸序列在中等至非常严格的条件下与对应于SEQ ID NO: 1所示的的核巧酸序列或其互补链的标记核酸探针杂交。使用例如X射线胶片可W检 测在运些条件下与核酸探针杂交的分子。
[0104] 本文有关杂交严格条件是本领域技术人员通常会理解有关的严格条件-即，对于 中等严格条件，技术人员会理解的条件是中等严格条件。技术人员知道有关的杂交严格条 件-见例如（J. Sambrook ,E .F. FYitsch ,and T .Maniatus , 1989 'Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor,New York)。
[0105] 根据本领域-对于长度为至少100个核巧酸的长探针，将非常低至非常高的严格条 件定义为在42°C下在5X SS阳，0.3 % SDS，20化g/ml剪切和变性的娃精DNA中预杂交和杂交， W及25%甲酯胺对应非常低和低严格性，35%甲酯胺对应中和中-高严格性或50%甲酯胺 对应高和非常高严格性，之后进行标准南部(Southern)印迹程序12至24小时最佳。
[0106] 对于长度为至少100个核巧酸的长探针，所述载体材料最终洗涂=次，每次用2X SSC 0.2% SDS洗涂15分钟，优选至少在45°C (非常低严格性），更优选至少在50°C (低严格 性），更优选至少在55°C (中等严格性），更优选至少在60°C(中-高严格性），甚至更优选至少 在65°C (高严格性），并且最优选至少在70°C(非常高严格性）。
[0107] 术语"体外"（拉下语:在玻璃中）设及一种使用有机体成分进行的研究，该有机体 成分已经从其通常的生物环境分离W便允许进行比使用整个有机体时更详细或更方便的 分析。通常将运些实验称为"试管实验"。与此相反，体内研究是用处于正常完整状态的活的 有机体进行的研究。
[0108] 术语"体内在活体内"的拉下语)设及一种使用整体，活的有机体的实验，其与 部分或死的有机体，或体外（"在玻璃内"，例如，在试管或培养皿中）受控环境截然相反。
[0109] 术语"分离的多核巧酸"在本文中本质上设及的是多核巧酸从其天然环境分离-换 言之，该多核巧酸制备物基本上不含与其天然相关的其它多核巧酸物质。编码本文描述的 分离/克隆的新糖基转移酶的多核巧酸序列示于SEQ ID NO: 1并且它从昆虫姻脂虫分离。因 此，如技术人员所理解的-术语分离的多核巧酸当在姻脂虫的基因组中天然存在时不包括 SEQ ID NO: 1的多核巧酸。术语"分离的多核巧酸"本质上设及的是该分离的多核巧酸是适 合于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，分离的多核巧酸，W重量计，含有至 多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚 至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然相关的其它多核 巧酸物质。术语"分离的多核巧酸"在本文中可W替代地被称为"克隆的多核巧酸"。
[0110] 术语"分离的多肤"在本文中本质上设及的是一种多肤从其天然环境中分离。如 SEQ ID N0:2所示的新的糖基转移酶多肤从昆虫姻脂虫分离。因此，如技术人员所理解的- 术语"分离的多肤"当其在姻脂虫的基因组中天然存在时不包括SEQ ID N0:2的糖基转移酶 多肤。术语"分离的多肤"是指运样的多肤制备物，所述多肤制备物W重量计，含有至多 10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，至多3%，甚至更优选 至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然相关的其它多肤物质。术 语"与其天然相关的其它多肤物质"可W设及如SEQ ID N0:2所示的新的糖基转移酶多肤可 W看成与姻脂虫中与其天然相关的其它多肤物质有关。在某些情况下-可W优选的是，"分 离的多肤"指的是至少20%纯，优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80% 纯，最优选至少90 %纯，并且甚至最优选至少95 %纯的多肤，如通过SDS-PAGE测定的。
[0111] 本文所用的术语"核酸构建体"是指一种核酸分子，无论是单链或双链，其从天然 存在的基因分离或者被修饰W含有在某种程度上不会W其他方式存在于自然界中的核酸 片段。当核酸构建体包含本发明的编码序列表达所需的控制序列时，术语核酸构建体与术 语"表达盒"同义。如本领域所公知的，控制序列包括对于编码本发明的多肤的多核巧酸的 表达必要或有利的所有组分。每个控制序列可W是天然的或对于编码多肤的核巧酸序列是 不相关的。运种控制序列包括但不限于，前导序列，聚腺巧酸化序列，前肤序列，启动子，信 号肤序列和转录终止子。最低限度，所述控制序列包括启动子，W及转录和翻译终止信号。 所述控制序列可提供有接头W便引入特异性限制位点从而促进控制序列与编码多肤的核 巧酸序列的编码区的连接。
[0112] 术语"重组表达载体"设及包含本发明的多核巧酸，启动子，及转录和翻译终止信 号的重组表达载体。上述的各种核酸和控制序列可W结合在一起W产生重组表达载体，其 可包括一个或多个方便的限制性位点W允许在运些位点插入或替代编码多肤的核巧酸序 列。
[0113] 术语"重组宿主细胞"在本文中应根据本领域来理解。如本领域中公知的，重组多 核巧酸(例如DNA)分子是通过基因重组的实验室方法(例如分子克隆)将来自多个源的遗传 物质汇集在一起，创建不能W其他方式在生物有机体中发现的序列而形成的多核巧酸(例 如DNA)分子。如本领域技术人员可W理解的-重组宿主细胞包含重组多核巧酸(例如DM)分 子，因此，重组宿主细胞将不会被理解为包括天然野生型细胞-诸如例如天然野生型姻脂虫 细胞。
[0114] 术语"序列同一性"设及两个氨基酸序列之间或两个核巧酸序列之间的相关性。
[0115] 对于本发明而言，使用如EMBOSS程序包化MBOSSi^e European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,lYends Genet.16:276-277)(优选版 本3.0.0或更高版本）的Needle程序所执行的Needleman-Wunsch算法（Needlemanand Wunsch，1970, J.Mol.Biol. 48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度。使用 的可选参数是:缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5，W及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)替 代矩阵。标记为"最长同一性"（使用-nobrief选项获得)的针(Needle)的输出用作百分比同 一性，并计算如下：
[0116] (相同的残基X 100)/(比对的长度-比对中缺口的总数）。
[0117] 对于本发明而言，使用如EMBOSS程序包化MBOSSi^e European Molecular Biology Open Software Suite,I?ice et al.,2000,见上文）（优选版本3.0.0或更高版本） 的化edle程序所执行的化edleman-Wunsch算法（Needleman and Wunsch, 1970,见上文）确 定两个核巧酸序列之间的序列同一性程度。使用的可选参数是:缺口罚分10,缺口延伸罚分 0.5，W及抓NAFU化(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本）替代矩阵。标记为"最长同一性"（使用- nobr i ef选项获得)的针(Needl e)的输出用作百分比同一'性，并计算如下：
[0118] (相同的脱氧核糖核巧酸X 100)/(比对的长度-比对中缺口的总数）。
[0119] 本发明的实施方案描述如下，仅通过实施例的方式。
【附图说明】
[0120] 图1:本文描述的为SEQ ID N0:2的分离/克隆的新的糖基转移酶的相关糖基转移 酶活性的示意图表示-如图中所示，发现能够缀合葡萄糖到糖巧配基黄姻脂酬酸(FK)和姻 脂酬酸化A)。
[0121] 图2:采用OsCGT和訊UGT85B1产生黄姻脂酬酸和姻脂酬酸的葡萄糖巧。在包含UDP- 葡萄糖和黄姻脂酬酸(FK)或姻脂酬酸化A)的试验中形成的葡糖化产物的LC-MS分析。来自 由FK (A)或KA (C)培养的大肠杆菌菌株X j b (阴性对照）的粗裂解物。来自由FK (B)或KA (D)培 养的表达OsCGT的X化细胞的粗裂解物。来自由FK化)或KA(F)培养的表达SbUGT85Bl的X化细 胞的粗裂解物。单独的FK(G)和KA化)底物。表示了总离子色谱图（TIC)和对于111八313^- H]-，m/z 329[M-H]-，m/z 475[M-H]-，m/z 491[M-H]-的提取离子色谱，对应于FK，KA，FK-单 葡萄糖巧，W及KA-单葡萄糖巧。峰保留时间W分钟表示。
【具体实施方式】
[01。]如本文所述的新的分离的糖基转移酶多肤
[0123] 当本文提及本文所述的分离的糖基转移酶多肤时，是指本发明和/或其本文相关 的实施方案的第一方面的分离的糖基转移酶多肤。
[0124] 术语"分离的多肤"在本文中本质上设及的是所述多肤从其天然环境中分离。如 SEQ ID N0:2所示的新的糖基转移酶多肤从昆虫姻脂虫分离。因此，如技术人员所理解的- 术语"分离的多肤"当其在姻脂虫的基因组中天然存在时不包括SEQ ID N0:2的糖基转移酶 多肤。
[0125] 优选地，本文描述的分离的糖基转移酶多肤是指运样的多肤制备物，所述多肤制 备物W重量计，含有至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多 4%，至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1 %，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然 相关的其它多肤物质。
[0126] 如本领域技术人员所理解的，术语"与其天然相关的其它多肤物质"可W设及如 SEQ ID NO:2所示的新的糖基转移酶多肤可W看成与姻脂虫中与其天然相关的其它多肤物 质有关。
[0127] 在某些情况下-可W优选的是，本文描述的分离的糖基转移酶多肤指的是至少 20 %纯，优选至少40 %纯，更优选至少60 %纯，甚至更优选至少80 %纯，最优选至少90 %纯， 并且甚至最优选至少95 %纯的多肤，如通过SDS-PAGE测定的。
[0128] 基于例如本文所公开的序列信息-运是本领域技术人员获得如本文所述的分离的 糖基转移酶多肤的常规工作。
[0129] 运可W例如根据本领域已知的程序在合适的重组宿主细胞中通过重组表达来完 成。
[0130] 因此，并不认为有必要在本文中详细地描述运种标准的已知的重组表达程序。
[0131] 优选地，如本文所描述的分离的糖基转移酶多肤能够：
[0132] (I):缀合葡萄糖到黄姻脂酬酸师）；和
[0133] (II):缀合葡萄糖到姻脂酬酸化A)。
[0134] 优选的实施方案设及的是其中第一方面的糖基转移酶多肤是：
[01巧](a)包含与SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少80%同一性的氨基酸序列的多 肤;更优选
[0136] (a)包含与SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少90%同一性的氨基酸序列的多 肤;甚至更优选
[0137] (a)包含与SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少95%同一性的氨基酸序列的多 肤;并且最优选
[0138] (a)包含与SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少98%同一性的氨基酸序列的多 肤。
[0139] 可W优选的是，第一方面的糖基转移酶多肤是包含具有SEQ ID N0:2的氨基酸1至 515的氨基酸序列的多肤。
[0140] 优选的实施方案设及的是其中第一方面的糖基转移酶多肤是：
[0141] (b)包含与SEQ ID N0:2的氨基酸20至468具有至少80%同一性的氨基酸序列的多 肤;更优选
[0142] (b)包含与SEQ ID N0:2的氨基酸20至468具有至少90%同一性的氨基酸序列的多 肤;甚至更优选
[0143] (b)包含与SEQ ID N0:2的氨基酸20至468具有至少95%同一性的氨基酸序列的多 肤;和最优选
[0144] (b)包含与SEQ ID N0:2的氨基酸20至468具有至少98%同一性的氨基酸序列的多 肤。
[0145] 可W优选的是，第一方面的糖基转移酶多肤是包含具有SEQ ID N0:2的氨基酸20 至468的氨基酸序列的多肤。
[0146] 优选的实施方案设及的是其中第一方面的糖基转移酶多肤是：
[0147] (C)由在至少中等严格条件下与（i)SEQ ID N0:1的核巧酸1至1548或的互 补链杂交的多核巧酸编码的多肤;更优选
[014引（C)由在至少高严格条件下与（i)SEQ ID N0:1的核巧酸1至1548或的互补 链杂交的多核巧酸编码的多肤;甚至更优选
[0149] (C)由在至少非常严格条件下与（i)SEQ ID N0:1的核巧酸1至1548或的互 补链杂交的多核巧酸编码的多肤。
[0150] 本领域技术人员制备本文所述的分离的糖基转移酶多肤的变体是常规工作-即例 如SEQ ID NO:2的例如一个或多个氨基酸已被修饰/改变的变体。
[0151] 进一步地-如本领域技术人员所公知的，如果运种变体变化并不过于激烈，运种酶 保持其相关的GT活性将是可行的。
[0152] 优选的实施方案设及的是其中第一方面的糖基转移酶多肤是：
[0153] (a)包含SEQ ID N0:2的氨基酸1至515的氨基酸序列的多肤或其变体，其中所述变 体包含在SEQ ID N0:2的一个或多个(几个)位置的改变，并且其中所述变体包含小于50个 的改变，更优选小于40个的改变，甚至更优选小于20个的改变和最优选小于10个的改变。
[0154] 在一个优选的实施方案中，术语"在SEQ ID N0:2的一个或多个(几个)位置的改 变"指的是在SEQ ID NO:2中的1至10个改变。
[0155] 根据现有技术-术语"变体"在本文是指具有相关的GT活性且包括在一个或多个 (几个)位置的改变，即，替代、插入和/或缺失的肤。替代是指用不同的氨基酸替换占据位置 的氨基酸;缺失是指除去占据位置的氨基酸；W及插入是指邻近占据位置的氨基酸添加1-3 个氨基酸。
[0156] 所述氨基酸可W是天然或非天然氨基酸-例如，用例如D-丙氨酸的例如特别的D- 异构体(或D-型）替代理论上是可能的。
[0157] 在一个优选的实施方案中，第一方面的糖基转移酶多肤是膜结合或不溶于水的 GT。
[0側]包括编码如本文所述的糖基转移酶多肤的核巧酸序列的分离的多核巧酸
[0159] 如上所讨论的-本发明的第二个方面设及包含编码第一方面和/或其本文相关的 实施方案的多肤的核巧酸序列的分离的多核巧酸。
[0160] 术语"分离的多核巧酸"在本文中可W替代地称为"克隆的多核巧酸"。
[0161] 如上所讨论的-术语"分离的多核巧酸"本质上设及的是多核巧酸从其天然环境分 离-换言之，该多核巧酸制备物基本上不含与其天然相关的其它多核巧酸物质。编码本文描 述的分离/克隆的新的糖基转移酶的多核巧酸序列示于SEQ ID NO: 1并且它从昆虫姻脂虫 分离。因此，如技术人员所理解的-术语分离的多核巧酸当在姻脂虫的基因组中天然存在时 不包括SEQ ID NO: 1的多核巧酸。
[0162] 术语"分离的多核巧酸"本质上设及的是该分离的多核巧酸是适合于在遗传工程 蛋白质生产体系中使用的形式。
[0163] 因此，分离的多核巧酸，W重量计，含有至多10%，优选至多8%，更优选至多6 %， 更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1 %，并 且甚至最优选至多0.5%的与其天然相关的其它多核巧酸物质。
[0164] 基于例如本文所公开的序列信息-运是本领域技术人员获得如本文所述的分离的 多核巧酸的常规工作。
[0165] 运可W例如根据本领域已知的程序在合适的重组宿主细胞中通过重组表达来完 成。
[0166] 因此，并不认为有必要在本文中详细地描述运种标准的已知的重组表达程序。
[0167] 包含如本文所述的分离的多核巧酸的核酸构建体
[0168] 如上所讨论的-本发明的第=方面设及包含第二方面和/或其本文相关的实施方 案的分离的多核巧酸的核酸构建体，其可操作地连接到引导多肤在表达宿主中产生的一种 或多种控制序列。
[0169] 根据现有技术-本文所用的术语"核酸构建体"是指一种核酸分子，无论是单链或 双链，其从天然存在的基因分离或者被修饰W含有在某种程度上不会W其他方式存在于自 然界中的核酸片段。
[0170] 当核酸构建体包含本发明的编码序列表达所需的控制序列时，术语核酸构建体与 术语"表达盒"同义。如本领域所公知的，控制序列包括对于编码本发明的多肤的多核巧酸 的表达必要或有利的所有组分。
[0171] 基于例如本文所公开的序列信息-运是本领域技术人员制备相关的核酸构建体的 常规工作-例如，基于现有技术，本领域技术人员知道用于编码本发明的多肤的多核巧酸的 表达的各种不同的合适的控制序列。
[0172] 因此，并不认为有必要在本文中详细地描述运种标准的已知的技术原理。 陶]包含如本文所述的核酸构建体的重组表达载体
[0174] 如上所讨论的-本发明的第四方面设及一种重组表达载体，其包括第=方面和/或 其本文相关的实施方案的核酸构建体。
[0175] 根据现有技术-术语"重组表达载体"设及包含本发明的多核巧酸，启动子，及转录 和翻译终止信号的重组表达载体。上述的各种核酸和控制序列可W结合在一起W产生重组 表达载体，其可包括一个或多个方便的限制性位点W允许在运些位点插入或替代编码多肤 的核巧酸序列。
[0176] 基于例如本文所公开的序列信息-运是本领域技术人员制备相关的重组表达载体 的常规工作-例如，基于现有技术，本领域技术人员知道各种不同的启动子，及转录和翻译 终止信号。
[0177] 因此，并不认为有必要在本文中详细地描述运种标准的已知的技术原理。
[017引包含如本文所述的核酸构建体的重组宿主细胞
[0179] 如上所讨论的-本发明的第五个方面设及一种重组宿主细胞，其包含第=方面和/ 或其本文相关的实施方案的核酸构建体。
[0180] 术语"重组宿主细胞"在本文中应根据现有技术来理解。如本领域中公知的，重组 多核巧酸(例如DNA)分子是通过基因重组的实验室方法(例如分子克隆)将来自多个源的遗 传物质汇集在一起，创建不能W其他方式在生物有机体中发现的序列而形成的多核巧酸 (例如DNA)分子。如本领域技术人员可W理解的-重组宿主细胞包含重组多核巧酸（例如 DNA)分子，因此，就运一点而论，重组宿主细胞将不会被理解为包括天然野生型细胞-诸如 例如天然野生型姻脂虫细胞。
[0181] 基于例如本文所公开的序列信息-运是本领域技术人员制备相关的重组宿主细胞 的常规工作-例如，基于现有技术，本领域技术人员知道许多不同的合适的重组宿主细胞， 其多年来已被用作例如用于不同的目的多肤的表达的重组宿主细胞。
[0182] 重组宿主细胞可W是任何合适的细胞，例如任何真核细胞[例如哺乳动物细胞(如 例如中国仓鼠卵巢(C册)细胞)或植物细胞]或任何原核细胞。
[0183] 特别优选的是，其中重组宿主细胞是产黄姻脂酬酸/姻脂酬酸或其他相关的化合 物的植物细胞，例如大黄类植物细胞。
[0184] 优选地，重组宿主细胞是选自由丝状真菌细胞和微生物细胞组成的组的细胞。
[0185] 丝状真菌包括细分真菌口和卵菌口的所有丝状形式（如化wksworth等人所定义 的，1995,见上文）。丝状真菌W由几下质，纤维素，葡聚糖，壳聚糖，甘露聚糖和其它复杂多 糖组成的营养菌丝体为特征。营养生长是通过菌丝伸长而碳分解代谢是绝对需氧的。与此 相反，酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的营养生长是通过单细胞菌体的出 芽而碳分解代谢可W是发酵性的。
[0186] 可W优选地，丝状真菌细胞是物种支顶抱属，曲霉属真菌，镶抱属，腐质霉属，毛霉 属，毁丝霉属，脉抱属，青霉属，梭抱壳属，弯颈霉属和木霉属或它们的有性型或异名的细 胞，但不限于运些。
[0187] 优选的曲霉属真菌细胞是黑曲霉或米曲霉。
[0188] 本文优选的微生物细胞是选自酵母细胞和原核细胞组成的组的微生物细胞。
[0189] 优选的酵母细胞是选自子囊菌纲，担子菌纲和半知菌纲组成的组的酵母细胞。优 选地，酵母细胞选自由子囊菌纲组成的组。
[0190] 优选的子囊菌纲酵母菌细胞选自由阿舒囊霉属(Ashbya)，Bo付yoascus，德己利氏 酵母属，汉逊酵母属（Hansenula)，克鲁维酵母菌属（Kluveromyces)，油脂酵母属 (Xipomyces)，酵母属（Saccharomyces spp)例如，酿酒酵母，毕赤酵母属(Pichia spp.)，裂 殖酵母（Schizosaccha;romycesspp)组成的组。
[0191] 优选的酵母细胞是选自由酵母属（Saccharomyces spp)例如，酿酒酵母和毕赤酵 母属(Pichia spp.)组成的组的酵母细胞。
[0192] 优选的原核细胞选自由芽抱杆菌属，链霉菌属，棒状杆菌属，假单胞菌属，乳酸菌 和大肠杆菌细胞组成的组。
[0193] 优选的芽抱杆菌属细胞是枯草芽抱杆菌（B. subtil is)，解淀粉芽抱杆菌 (B.amyloliquefaciens)或地衣芽抱杆菌(B. licheniformis)。
[0194] 优选的链霉菌属细胞是西唐氏链霉菌（S.setonii)或天蓝色链霉菌 (S.coelicolor)。
[01M]优选的棒状杆菌细胞是谷氨酸棒杆菌(C.glutamic皿)。
[0196] 优选的假单胞菌细胞是恶臭假单胞菌(P. putida)或巧光假单胞菌(P. putida)。
[0197] 一种生产黄姻脂酬酸(FK)糖巧和/或姻脂酬酸(KA)糖巧的方法
[0198] 如上所讨论的-本发明的第六个方面设及一种用于产生黄姻脂酬酸(FK)糖巧和/ 或姻脂酬酸化A)糖巧的方法，其中所述方法包括W下步骤：
[0199] (A):在体外或体内在包含编码糖基转移酶的糖基转移酶基因的重组宿主细胞中 使：
[0200] (al):黄姻脂酬酸(FK)与能够糖基化黄姻脂酬酸的糖基转移酶在产生黄姻脂酬酸 糖巧的合适条件下接触;和/或
[0201] (a2):姻脂酬酸化A)与能够糖基化姻脂酬酸的糖基转移酶在产生姻脂酬酸糖巧的 合适条件下接触。
[0202] 优选地，步骤(A)中的重组宿主细胞是包含编码糖基转移酶的重组糖基转移酶基 因的重组宿主细胞。
[0203] 优选地，步骤(a2)中的糖基转移酶是一种葡糖基转移酶而且由此，在步骤(a2)中 产生姻脂酬酸葡萄糖巧，优选其中产生的姻脂酬酸糖巧是姻脂红酸(本文的图1示出姻脂红 酸的结构）。
[0204] 优选地，步骤(al)中的糖基转移酶是一种葡糖基转移酶而且由此，在步骤(al)中 产生黄姻脂酬酸葡萄糖巧，优选其中产生的黄姻脂酬酸糖巧是化合物化IK本文的图1示出 化合物化II的结构）。
[0205] 当步骤(al)中所产生的化合物是化II时，可W优选的是使用本Dell作为中间体来 制备姻脂红酸。
[0206] 运可W通过化学合成进行并且本领域技术人员知道如何根据他的普通一般知识 做到运一点。
[0207] 另外，运也可W通过例如使用合适的加氧酶酶促地进行。合适的加氧酶的一个实 例是单加氧酶的细胞色素P450超家族(正式缩写为CYP)酶。其它实例是黄素单加氧酶或不 同类型的双加氧酶，然而该名单不应被认为是排除其它类的酶的参与。
[0208] 如本领域中已知的-由细胞色素 P450催化的最常见的反应是单加氧酶反应，例如， 插入一个氧原子到底物中。
[0209] 如本领域技术人员在本发明上下文中理解的-如本文所讨论的第六方面的方法的 步骤(a)的术语黄姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)糖巧配基应被理解为如图1所示的FK 和/或KA具体化合物W及运些具体的化合物的具有较小的取代基的等效类似物(例如FK甲 醋）。
[0210] 如由本领域技术人员所理解的-如果FK甲醋用作第六方面的方法的步骤(a)中的 糖巧配基，那么经过糖基化步骤将生成FK甲醋糖巧，其通过常规除去甲基将产生化II-相应 地，关于本文中所讨论的第六方面的方法，FK甲醋可被视为等同于FK糖巧配基。
[0211] 在第六方面的方法的步骤(a)中指定，使用了能够糖基化FK和/或KA的糖基转移 酶-因此可W理解，GT必须能够运样做。
[0212] 可W优选地纯化步骤(A)中产生的糖巧-即，在步骤(al)和/或在步骤(a2)中。
[0213] 因此，可W优选的是，第六方面的方法包括具有下列步骤的进一步的步骤(B):
[0214] (B):纯化步骤(al)和/或步骤(a2)中产生的糖巧，由此得到一种组合物，其中组合 物中至少5%w/w(优选至少10%w/w，更优选至少50%w/w和最优选至少80%w/w)的化合物 是所产生的黄姻脂酬酸糖巧和/或姻脂酬酸糖巧。
[0215] 本领域技术人员知道如何纯化运类糖巧化合物并且其可W根据本领域进行。
[0216]纯化步骤(B)可W是特别优选的，当：
[0217]-在步骤姐）中产生的糖巧是姻脂红酸时；
[021引-在步骤(al)中产生的糖巧是化合物Dell时;和/或
[0219] -在步骤(al)中产生的糖巧是化合物化II并且它用作中间体W制备姻脂红酸时。
[0220] 如本文所讨论-在工作实施例中，使黄姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)与SEQ ID N0:2的糖基转移酶体外接触。运可W被看作是本领域技术人员执行运样的体外接触步骤的 常规工作。
[0221] SEQ ID N0:2的糖基转移酶在酵母细胞中重组表达(参见本文的工作实施例)-因 此，在本文的一个工作实施例中，制成了运样的重组酵母宿主细胞，其包含编码SEQ ID NO: 2的糖基转移酶的重组糖基转移酶基因。
[0222] 我们认为，如果黄姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)可W在适当的条件下加入到 发酵培养基中，FK和/或KA化合物可W进入例如培养基中发酵的酵母细胞中-因此，如果例 如酵母细胞是包含编码糖基转移酶的重组糖基转移酶基因的重组酵母宿主细胞，则可W在 FK和/或KA的重组宿主细胞中进行与糖基转移酶的体内接触。
[0223] 在一个优选的实施方案中，步骤(A)中的接触是在体内且重组宿主细胞是酵母细 胞，优选其中所述酵母细胞选自由酵母属(例如酿酒酵母)和毕赤酵母属组成的组。
[0224] W上描述了优选的重组宿主细胞-运些优选的重组宿主细胞也可W是与本发明的 第六方面的方法相关的优选的重组宿主细胞。
[0225] 在本文中-可W说，确定合适的重组宿主细胞W执行第六方面的方法的体内接触 步骤(A)在本领域技术人员的普通知识范围内并且不认为有必要在此详细地描述。
[02%]上面讨论了优选的重组宿主细胞可W例如是微生物细胞或丝状真菌细胞-运些细 胞可W是与第六方面的方法相关的优选的重组宿主细胞。
[0227] 可能能够制备运样的重组宿主细胞(例如重组宿主微生物细胞），其包含编码参与 生物合成途径导致黄姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)的产物的基因，并且运样的重组宿 主细胞可在本文中优选。
[0228] 因此，可W优选的是步骤(A)中的接触是在运样的重组宿主细胞中的体内接触，所 述重组宿主细胞包含编码糖基转移酶的重组糖基转移酶基因和编码参与生物合成途径导 致黄姻脂酬酸(FK)和/或姻脂酬酸化A)的产物的基因。
[0229] 如在本文的工作实施例中讨论的-SEQ ID N0:2的GT在体内和在水中是膜结合的 或疏水/不溶。当生产细胞或包含膜结合GT的细胞部分从产品（例如，姻脂红酸)分离时，GT 可W基本上不存在于更可溶产物/亲水产物所存在的部分中。运对于获得最终产物(例如姻 脂红酸产物/组合物)是有利的，所述最终产物基本上完全不含有重组GT。
[0230] 因为通过GT糖基化的底物可W是疏水的糖巧配基，该糖巧配基将预期在膜中和生 产细胞的其它疏水部分部分地累积。通过使用膜结合GT，获得在例如膜中存在的疏水化合 物的更有效的糖基化。
[0231] 因此，在一个优选的实施方案中，在第六方面的方法中使用的糖基转移酶是膜结 合或不溶于水的GT。
[0232] 在一个优选的实施方案中-第六方面的方法的步骤(A)中的糖基转移酶是第一个 方面和/或其本文相关的实施方案的糖基转移酶。
[0233] 如本文所讨论的-工作实施例4的所确定的数据/结果显示，本文有关的GT酶可W 在例如局梁和水稚中识别。
[0234] 在本文中，高梁多肤序列(Genba址登录ID号:AAF17077.1)显示为沈Q ID N0:4。
[0235] 在本文中，水稻多肤序列(Genba址登录ID号:CAQ77160.1)显示为沈Q ID N0:5。
[0236] 可能相关的是，第六方面的方法的步骤(A)中的糖基转移酶是运样的糖基转移酶， 其包含具有与SEQ ID NO:4的氨基酸1至492至少70% (优选至少80%，更优选至少90%，甚 至更优选至少98%)的同一性的氨基酸序列。
[0237] 可能相关的是，第六方面的方法的步骤(A)中的糖基转移酶是运样的糖基转移酶， 其包含具有与SEQ ID NO: 5的氨基酸1至471至少70% (优选至少80%，更优选至少90%，甚 至更优选至少98%)的同一性的氨基酸序列。
[023引实施例
[0239] 实施例1-姻脂虫GT的克隆及其FK和KA活性的测试
[0240] 材料和方法
[0241] DNA 和 mRNA 的纯化
[0242] 鲜冻姻脂虫(从兰萨罗特获得）。鲜冻波斯姻珠阶(Po巧hyrophora polonica)从波 兰获得。将冷冻昆虫在液氮下磨成粉末并纯化DNA/RNA:根据供应商的试验方案，使用 歴easy Blood&Tissue试剂盒（Qiagen)纯化DNA。根据供应商的试验方案，使用RNeasy小型 试剂盒(Qiagen)纯化RNA。
[0243] 使用逆转录酶反应的多-dT引发，根据供应商的试验方案，使用RT2简易第一链试 剂盒化asy First Strand Kit)(Qiagen)将真核生物mRNA制成cDNA。
[0244] DNA 和 RNA 的测序：
[0245] 使用10化p配对末端Illumina技术，根据Illumina的试验方案，W约60-100X的覆 盖范围在测序的BGI (中国深圳)对DNA和cDNA进行了测序，输出结果为化S化数据格式。
[0246] DNA和RNA/cDNA序列的分析：
[0247] 将所获得的DM和RM/cDM的Fastq序列导入到基因组工作台（Genomic Workbench)版本5.4(化C-bio,奥尔胡斯，丹麦)并使用从头组装算法组装成重叠群。将输出 文件导出为FASTA格式。
[024引然后将RNA/cDNA FASTA文件导入到I0GMA v.l0(Genostar，法国格勒诺布尔）并使 用"基于隐马尔科夫矩阵的原核生物基因发现者（hidden Markov-Matrix-based prokaryote邑ene-finder)''鉴定推定的基因。
[0249] 相对于GenBank(NCBI)使用化AST(基础局部比对序列工具）注释推定的基因， GenBank(NCBI)也使用该核巧酸序列作为翻译的蛋白质序列。也通过与蛋白质家族的PFAM 数据库进行相似性比较来注释该推定的基因。
[0250] 从姻脂虫制备蛋白质组分
[0251] 在含有0.3g的聚乙締化咯烧酬的120mL隔离缓冲液[350mM薦糖，20mM Tricine(pH 7.9)，10mM NaCl，5mM DTT，lmM PMSF)中均化3克新鲜的姻脂虫昆虫。将匀浆通过尼龙布(22 皿筛目）过滤，并离屯、(4°C下10分钟，10，OOOxg)。将上清液离屯、（1小时，105，OOOxg，4°C)，得 到可溶性和膜结合蛋白组分。将可溶性蛋白组分浓缩至ImL，并使用Ami con ul1:rafugation-3K设备(Millipore)用20mM T;ricine(pH 7.9)，5mM DTT缓冲液交换。通过 使用貂画笔在60mL的20mM Tricine(pH 7.9)，5mM DTT中重悬浮来洗涂膜结合蛋白颗粒S 次，然后重新离屯、。膜结合蛋白沉淀最后再悬浮于1血的20mM Tricine(抑7.9)，5mM DTT中。 分析可溶性蛋白组分和膜结合蛋白组分的糖基化活性。
[0252] 从姻脂虫膜蛋白纯化黄姻脂酬酸/姻脂酬酸特异性GT活性
[0253] 通过加入1% (v/v)T;riton X-100(还原形式），并在冷浴中缓慢揽拌1.5小时来溶 解从3g鲜姻脂虫昆虫分离的膜结合蛋白组分。离屯、Triton X-100处理过的溶液（1小时， 105,000xg，4°C)，W及分离上清液并施加到用2mL Q-琼脂糖hst flow(陆armacia)填充的 柱中。用4mL缓冲液A[20mM hicine(抑为7.9)，0. l%(v/v)T;riton X-100(还原形式），50mM 船(：1]洗涂该柱并使用从10〇1111-50〇1111，（^5〇1111增量）的不连续的船(：1梯度^2〇1111化^1116 (pH 7.9)，0.1% (v/v)T;riton X-100(还原形式））洗脱蛋白质。收集0.5mL级分，脱盐，用 SDS-PAGE分析并使用所描述的放射性标记的葡糖化酶测定法监测葡糖化活性。含有富集的 黄姻脂酬酸/姻脂酬酸特异性GT活性的级分进行肤质量指纹图谱分析。
[0254] 酶测定和糖巧产品检测
[02巧]在含有20mMTricine(pH7.9)，3.3皿UDP[14C]葡萄糖和20uL蛋白提取物(膜结 合的或可溶蛋白质）的60uL的测定混合物中进行黄姻脂酬酸和姻脂酬酸的葡糖化。反应在 30°C下溫育0.5小时，并通过添力日180化甲醇终止。样品在4°C下Wl6,000xg离屯、5分钟并将 上清液点在化C板(硅胶60F254板;Merck)上。测定产物在二氯甲烧：甲醇：甲酸(7:2:2，按体 积计）中溶解。使用ST0RM840化osphorImager可视化放射性标记的产物（Molecular Dynamics,http://www.moleculardynamics.com)。
[0巧6] 在酿酒酵母中表达密码子优化的化UGT2，DcUGT4和化UG巧
[0257] 用于酵母表达的DcUGT2和来自姻脂虫转录组的被称为化UGT4和DcUGT5的两个其 他假定的GT序列的合成密码子优化的版本购自GenScript，具有侧翼Gateway重组at1:L位 点。该合成的片段用作具有特异性的引物W产生相应的C-末端Str邱n标签的版本的PCR模 板。使用LR clonasell酶混合物将六个基因构建体（标记的和未标记的片段）克隆到 Gateway目的质粒pYES2.Invitrogen)中。该六个pYES-DESl'SS质粒构建体单独转 化成Invscl酵母菌株（Invitrogen)并通过PCR验证阳性转化体。根据pYES-DEST52Gateway 载体(Invitrogen)的说明进行异源蛋白质生产。使用抗链球菌抗体由免疫印迹法验证异源 StrepII标签的蛋白的生产。如（D . Pompon ,B . Louerat, A . Bronine ,P . Urban , Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments.Methods Enzymol. 272( 1996)51-64)所描述的从经验证的酵母转化体制备膜结合蛋白组分。272 (1996)51-64)并筛选对黄姻脂酬酸/姻脂酬酸的葡糖化活性。在本文中，酵母优化的序列示 于沈Q ID NO:3。
[0 巧引 LC-MS-MS
[0259] 用下列HPLC系统在Agilent Q-T0F上进行LC/MS:
[0260] 柱Kinetix 2.6阳B-C18 100Aa00X4.60mm，Phenomenex)。溶剂A(900mL去离子 水，100ml甲醇和50ml甲酸）。溶剂B(700mL甲醇，300ml去离子水和50mL甲酸）。 惦61] 流速0.8ml/分钟。35 °C。
[0%2] 梯度洗脱。0-1分钟100%A。线性梯度至83 %A 3分钟。线性梯度至63 %A6分钟，线 性梯度至45%A 9分钟，线性梯度至27%A 12分钟，线性梯度至10%A 15分钟，线性梯度至 3%A 17分钟，线性梯度至2%A 19分钟，线性梯度至0%A 20分钟，0%A 22分钟，线性梯度 至100 % A 25分钟。
[0263] 保留时间分别为姻脂红酸7.6分钟，DC II 7.8分钟，黄姻脂酬酸13.7分钟和姻脂 酬酸13.9分钟。
[0264] 结果：
[0265] 在均化的姻脂虫昆虫中，使用C14-UDP-葡萄糖作为底物，检测糖基化黄姻脂酬酸/ 姻脂酬酸的能力。活性被证明是膜结合的并纯化活性，W及将纯化的蛋白质提交给蛋白质 组学分析。结果表明，酶的活性来自于具有对应于我们的候选基因化UGT2的序列的多肤。
[0266] 如W上所讨论的-在本文中将为SEQ ID NO: 2的本文相关的糖基转移酶酶称为 "DcUGT2"。
[0267] 化UGT2的氨基酸序列显示与任何已知的糖基转移酶的少于45 %的同源性。
[026引认识到克隆野生型序列到酵母并未提供相关酶活性，我们将DCUGT2的核巧酸序列 重新设计成编码相同的多核巧酸但使用为酿酒酵母优化的核巧酸密码子的序列，该过程称 为密码子优化(在本文中，酿酒酵母优化的序列如SEQ ID No.3所示）。接着克隆化UGT2的密 码子优化的序列并在酵母中表达。异源酵母菌株包含能够葡糖化姻脂酬酸和黄姻脂酬酸的 膜结合酶活性。
[0269] 在从富集有针对黄姻脂酬酸/姻脂酬酸的GT活性的姻脂虫蛋白组分获得肤质量指 纹数据后，我们匹配肤质量到转录组数据集并确定了 S个假定的UGT(DcUGT2，DcUGT4和 DcUG^)。
[0270] S个候选物在酵母中的异源表达显示，只有运些UGT之一，即DcUGT2负责姻脂虫蛋 白组分中的所观察到的针对黄姻脂酬酸/姻脂酬酸的葡糖化活性。
[0271] 生成的C-14放射性标记的葡萄糖巧的复合多糖酶(visco巧me)处理，表明其是耐 水解的，进一步暗示化UGT2是C-GT，负责产生DCII和姻脂红酸。
[0272] LC-MS-MS显示产物的信息，其具有与化II和姻脂红酸分别相同的保留时间、频谱、 分子量和分子降解模式。
[0273] ^
[0274] 实施例1的结果表明，分离/克隆为SEQ ID N0:2的可W在本文中称为"DCUGT2"的 本文相关的糖基转移酶酶不是一件容易的事。
[0275] 例如，分析了姻脂虫昆虫的基因组和转录组的经鉴定的基因序列与本文相关公知 C-糖基转移酶序列的相似度，在基因组/转录组的经鉴定的基因序列在此都未表现出与公 知的本文相关C-糖基转移酶序列的显著相似度的意义上，结果是阴性的。
[0276] 然而，即使生物信息学的序列相似性分析，可W说指示了姻脂虫的基因组不会包 含编码本文相关糖基转移酶的基因-然而本发明人继续对此进行研究，并且本发明人鉴定 了具有本文相关的GT活性的姻脂虫提取物(包括在姻脂虫中存在的内共生体的提取物)并 且通过本文相关的纯化和检测步骤的组合，本发明人终于能够得到较纯的组分/组合物，由 此能够获得可能的GT酶候选物的若干部分氨基酸序列。
[0277] 本发明人测试了描述SEQ ID NO: 2的分离/克隆的新的糖基转移酶的活性并且发 现其能够缀合葡萄糖到糖巧配基黄姻脂酬酸(FK)和姻脂酬酸化A)-参见图1。
[027引实施例2测试现有技术已知的化dGT2的KA GT活性
[0279] 如上所讨论的-在Gaig等人的文章中描述了 UrdGT2(Angew Chem Int Ed Engl.200 6N0V 27;45(46):7842-6)。
[0280] 如上所讨论的-本文描述了化dGT2能够糖基化不同的糖巧配基分子，运些不同的 糖巧配基分子可W被认为结构上类似于本文相关的姻脂酬酸化A)和黄姻脂酬酸(FK)糖巧 配基。
[0281] 克隆用于大肠杆菌表达的化dGT2的密码子优化的合成版本并且在大肠杆菌中重 组表达。获得了含有重组化dGT2的粗可溶性蛋白提取物-即包括化dGT2的提取物。
[0282] 使用UDP-葡萄糖或TDP-葡萄糖作为糖供体和FA/KA作为糖巧配基底物在体外分析 化dGT2GT活性。未检测到对运些糖巧配基的活性-即，关于运些糖巧配基，未识别到本文相 关的GT活性。
[0283] 然而，可W确认的是，重组化dGT2是活跃的，如通过大肠杆菌粗提物中的不明化合 物的葡糖化衍生而来的C14-放射标记的葡萄糖巧的体外形成所证明的。
[0284] 实施例3芦苔植物和十二卷属植物中的GT活性
[0285] 从芦苔分离和测试GT活性
[0286] 1)洗去植物的±壤颗粒并分离成:A)根，B)绿叶组织和C)来自叶的凝胶物质
[0287] 2)在液氮中立即冷冻5g组织并且在冷研鉢中用巧磨成细粉。
[02则 3)将含有无抓TA(Roche)的完全蛋白酶抑制剂，0.1%(w/v)硫酸鱼精蛋白和0.5g PVPP的20mL的冷的提取缓冲液[20mM Tricine-HCiaOmM 化Cl，5mM DTT，lmM PMSF，pH 7.9]加入到粉末中并满旋。
[0289] 4)将匀浆在4°C下缓慢揽拌10分钟，然后Wl2,000xg在4°C下离屯、5分钟。
[0290] 5)将上清液分离并在恒定揽拌下在4°(：下将1血的在2〇1111化^1116-肥1，抑7.9中 的2% (w/v)硫酸鱼精蛋白滴加2分钟。
[0291] 6)将上清液通过2片尼龙网过滤。然后将过滤的上清液Wl2,000xg在4°C下离屯、5 分钟。
[0292] 7)将上清液分离并Wll0,000xg在4°C下超高速离屯、化。
[0293] 8)分离可溶性蛋白组分(上清液)并使用Amicon超离屯、过滤装置-3K(Millipore) 用含有5mMDTT的20mMTricine-肥lpH7.9缓冲液交换5次
[0巧4] 9)在含UDP-葡萄糖（1.25mM终浓度）或FK(50咖终浓度），KA( 50础终浓度）或MeO- FK/ET0-FK (50皿/50皿终浓度）的60化的总反应体积中在30°C下培养20化可溶性蛋白提取 物2小时，并在65化pm下振摇。
[02巧]10)用180uL冷的甲醇终止酶反应并通过0.45曲1过滤器过滤并进行HPLC-MS分析。 [0296]
[0297]
[0298] 表1.使用来自芦苔的酶提取物在体外葡糖化试验中形成的糖巧。
[0299] 测试来自=种芦苔组织的粗可溶性酶提取物，绿叶物质（叶），来自叶的凝胶物质 (凝胶）和根对黄姻脂酬酸(FK)，姻脂酬酸化A)，黄姻脂酬酸的甲醋(MeOFK)和黄姻脂酬酸 化tOFK)的乙醋的葡糖化活性。数值对应于在体外形成的新的葡萄糖巧的HPLC-MS分离之后 的保留时间(分钟）（表1)。
[0300] m/z值475和491为相同的m/z值，如分别从溶解在相似的溶液中的Dell和CA获得 的。两个m/z值均为162(葡萄糖巧中的葡萄糖的m/z值），高于FK和KA的m/z值，表明来自反应 缓冲液中的UDP-葡萄糖的葡萄糖部分已通过提取液中的GT转移到糖巧配基。m/z[M-H]值 489和503也为162,高于分别用MeOFK和化0FK获得的m/z值，表明葡萄糖单位已经由存在于 提取物中的GT添加到MeOFK和EtOFK。
[0301 ] 来自琉璃殿化aworthia limifolia)的GT活性的分离和测试
[0302] 程序如同关于芦苔所描述的，但是分析的植物组织如下:A)绿色叶片组织，B)来自 叶的凝胶物质，C)基部组织(根和茎之间的粉红色部分)和D)根组织。
[0303] 测试来自四种琉璃殿组织的粗可溶性酶提取物，绿叶物质（叶），来自叶的凝胶物 质（凝胶及根和茎之间的粉红色组织(基部)和根对黄姻脂酬酸(FK)，姻脂酬酸化A)，黄 姻脂酬酸的甲醋(MeOFK)和黄姻脂酬酸巧tOFK)的乙醋的葡糖化活性。数值对应于在体外形 成的新的葡萄糖巧的HPLC-MS分离之后的保留时间(分钟）（表2)。
[0304]
[0305] 表2.使用来自琉璃殿的酶提取物在体外葡糖化试验中形成的葡萄糖巧
[0306] m/z值475和491为相同的m/z值，如分别从溶解在相似的溶液中的Dell和CA获得 的。两个m/z值均为162(葡萄糖巧中的葡萄糖的m/z值），高于FK和KA的m/z值，表明来自反应 缓冲液中的UDP-葡萄糖的葡萄糖部分已通过提取液中的GT转移到糖巧配基。m/z[M-H]值 489和503也为162,高于分别用MeOFK和化0FK获得的m/z值，表明葡萄糖单位已经由存在于 提取物中的GT添加到MeOFK和EtOFK。
[0307]
[0308] ^施例的结果表明，可W在芦苔植物和十二卷植物中识别到本文相关的糖基转 移酶(GT)酶。
[0309] 换言之，芦苔植物和十二卷植物包含能够糖基化黄姻脂酬酸W便产生黄姻脂酬酸 糖巧;和/或能够糖基化姻脂酬酸W产生姻脂酬酸糖巧的糖基转移酶。
[0310]实施例4高梁和水稻中的GT活性
[0311] 如本领域已知的-高梁和水稻包括糖基转移酶。
[0312] 如本领域中已知的-一些高梁和水稻糖基转移酶可W糖基化低分子量的糖巧配基 化合物。
[0313] 在现有技术中描述的来自高梁和水稻的糖基化转移酶与本文所公开的SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有显著小于70%的同一性。
[0314] 本领域不知道高梁和/或水稻的糖基转移酶是否是本文相关的糖基转移酶-即，能 够糖基化黄姻脂酬酸W便产生黄姻脂酬酸糖巧和/或能够糖基化姻脂酬酸W产生姻脂酬酸 糖巧的糖基转移酶。
[0315] 来自高梁（Sor曲um bicolor)的具有Genbank ID号AF199453.U核巧酸序列）/ AAF17077.U多肤序列）的已知的糖基转移酶SbUGT85Bl，和来自水稻(0巧za sativa)的具 有Genbank ID号FM179712.U核巧酸序列）/CAQ77160.1(多肤序列）的已知的糖基转移酶 OsCGT，在大肠杆菌菌株Xjb中表达并如Kannangara et al. (2011)和Augustin et al. (2012)所描述地制备粗大肠杆菌蛋白提取物并测试其对底物姻脂酬酸和黄姻脂酬酸的葡 糖化活性。
[0316]图2显示在包含表达SbUGT85Bl或OsCGT的大肠杆菌菌株)(化的粗裂解物，UDP-葡萄 糖和黄姻脂酬酸(FK)或姻脂酬酸化A)的测定中形成的葡糖化产物的LC-MS分析。
[0317] 对于两种糖基转移酶识别到KA糖巧(491m/z[M-H]-CA的m/z[M-H]值），对于OsCGT 识别到FK糖巧（473m/z[M-扣，DcII的m/z[M-扣值）。
[0；31引缉逆
[0319] 本实施例的结果表明，可W在高梁和水稻中识别到本文相关的糖基转移酶(GT) 酶。
[0320] 换言之，高梁和水稻包含能够糖基化黄姻脂酬酸W产生黄姻脂酬酸糖巧;和/或能 够糖基化姻脂酬酸W产生姻脂酬酸糖巧的糖基转移酶。
[0321] 实施例5内源性GT基因或GT活性的应用
[0322] 如本领域所已知的，能够糖基化低分子量的糖基转移酶存在于许多不同的有机体 中。使有机体的细胞的糖基转移酶接触低分子量化合物的方法是将引导低分子量化合物的 生物合成的一种或多种基因引入，从而使细胞糖基化低分子量化合物。低分子量化合物可 W是例如黄姻脂酬酸或姻脂酬酸或运些分子的修饰版本。
[0323] 将引导黄姻脂酬酸或姻脂酬酸的生物合成的一种或多种基因或运些分子的修饰 版本引入包含糖基转移酶的有机体例如烟草植物，本氏烟(Nicotiana benthamiana)中。
[0324] 当根据D'Aoust等人描述的方法在例如植物组织中瞬时表达所述（多种）基因时， 产生了（多种)低分子量化合物。根据Gelvin(2003)中描述的方法制备和选择稳定表达所述 (多种)基因的细胞。
[0325] 在包含稳定表达和/或瞬时表达(多种)基因的细胞中，低分子量化合物与内源糖 基转移酶接触，产生黄姻脂酬酸，姻脂酬酸或运些分子的修饰版本的一种或多种糖巧的形 成。
[0326] 糖巧的存在由实施例3中描述的提取和分析方法证实。
[0327] 通过由Raima Id和Sigle;r(1994)描述的提取方法制备用于LC/MS的样品。
[032引缉逆
[0329] ^施例的结果表明，当将引导糖巧配基的生物合成的（多种）基因引入有机体 时，存在于重组有机体的细胞中的内源糖基转移酶可用于转换黄姻脂酬酸，姻脂酬酸或运 些分子的修饰版本成糖巧。
[0330] 换句话说，将引导黄姻脂酬酸，姻脂酬酸，运些分子的修饰版本，或相关的低分子 量化合物的生物合成的一种或多种基因引入是使所述低分子量化合物与糖基转移酶接触 的方法，从而是产生黄姻脂酬酸，姻脂酬酸或运些化合物的修饰版本的糖巧的方法。
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[0349] 18:Rauwald and Sigler(Phytochemical Analysis 5(1994):266-270)
【主权项】
1. 一种分离的糖基转移酶多肽，其能够： (I) 缀合核苷酸激活的葡萄糖到黄胭脂酮酸(FK);和/或 (II) 缀合核苷酸激活的葡萄糖到胭脂酮酸(KA); 且其中所述糖基转移酶多肽是选自由以下组成的组中的至少一种多肽： (a) 包含与SEQ ID N0:2的氨基酸1至515具有至少70%同一性的氨基酸序列的多肽； (b) 包含与SEQ ID NO:2的氨基酸20至468具有至少70%同一性的氨基酸序列的多肽； (c) 由在至少中等严格条件下与（i)SEQ ID ΝΟ:1的核苷酸1至1548或的互补链 杂交的多核苷酸所编码的多肽;和 (d) SEQ ID NO:2的氨基酸1至515的片段，其具有在（I)和/或（II)中指定的糖基转移酶 活性。2. 根据权利要求1所述的分离的糖基转移酶多肽，其中权利要求1所述的分离的糖基转 移酶多肽能够： (I) 缀合葡萄糖到黄胭脂酮酸(FK);和/或 (II) 缀合葡萄糖到胭脂酮酸(KA)。3. 根据前述权利要求中的任一项所述的分离的糖基转移酶多肽，其中权利要求1所述 的分离的糖基转移酶多肽是： (a)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至515具有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽。4. 根据前述权利要求中的任一项所述的分离的糖基转移酶多肽，其中权利要求1所述 的分离的糖基转移酶多肽是： (a)包含与SEQ ID NO:2的氨基酸1至515具有至少95%同一性的氨基酸序列的多肽。5. -种分离的多核苷酸，其包含编码前述权利要求中的任一项所述的多肽的核苷酸序 列。6. -种包含权利要求5所述的分离的多核苷酸的核酸构建体，其可操作地连接到引导 所述多肽在表达宿主中产生的一种或多种控制序列。7. -种重组表达载体，其包括权利要求6所述的核酸构建体。8. -种重组宿主细胞，其包含权利要求7所述的核酸构建体。9. 根据权利要求8所述的重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞是选自由丝状真菌细 胞和微生物细胞组成的组的细胞，优选地其中所述微生物细胞是酵母细胞，优选地，其中所 述酵母细胞选自由由酵母属（Saccharomyces spp)(例如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))和毕赤酵母属(Pichia spp)组成的组。10. -种用于产生黄胭脂酮酸(FK)糖苷和/或胭脂酮酸(KA)糖苷的方法，其中所述方法 包括以下步骤： (A):在体外或体内在包含编码糖基转移酶的糖基转移酶基因的重组宿主细胞中使： (al):黄胭脂酮酸(FK)与能够糖基化黄胭脂酮酸的糖基转移酶在产生黄胭脂酮酸糖苷 的合适条件下接触;和/或 (a2):胭脂酮酸(KA)与能够糖基化胭脂酮酸的糖基转移酶在产生胭脂酮酸糖苷的合适 条件下接触。11. 根据权利要求10所述的方法，其中， -步骤(al)中的糖基转移酶是一种葡糖基转移酶而且由此，在步骤(al)中产生黄胭脂 酮酸葡萄糖苷，并且其中所产生的黄胭脂酮酸糖苷是化合物Dell;和/或 -步骤(a2)中的糖基转移酶是一种葡糖基转移酶而且由此，在步骤(a2)中产生胭脂酮 酸葡萄糖苷，并且所产生的胭脂酮酸糖苷是胭脂红酸。12. 根据权利要求10至11中的任一项所述的方法，其中，步骤(A)中的重组宿主细胞是 包含编码糖基转移酶的重组糖基转移酶基因的重组宿主细胞并且其中所述方法包括进一 步的步骤(B)，其具有以下步骤： (B):纯化步骤(al)和/或步骤(a2)中产生的糖苷，由此得到一种组合物，其中所述组合 物中至少50%w/w的化合物是所产生的黄胭脂酮酸糖苷和/或胭脂酮酸糖苷。13. 根据权利要求10至12中的任一项所述的方法，其中，权利要求1的步骤(A)中的接触 是体内的，并且所述重组宿主细胞是酵母细胞，优选地，其中所述酵母细胞选自由由酵母属 (例如酿酒酵母)和毕赤酵母属组成的组。14. 根据权利要求10至13中的任一项所述的方法，其中，所述糖基化转移酶是膜结合 的。15. 根据权利要求10至14中的任一项所述的方法，其中，权利要求10的方法的步骤(A) 中的糖基化转移酶是权利要求1至4中的任一项所述的糖基化转移酶。
【文档编号】C12N9/10GK106062186SQ201480075893
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2014年12月18日
【发明人】鲁比尼·马亚·坎南加拉, 马斯·本内森, 比约恩·马德森, 金姆·宾德鲁普, 乌尔夫·特拉内, 拉斯穆斯·约翰·诺曼德·弗兰森, 乌费·哈斯布罗·莫滕森, 比厄·林贝尔·默勒, 芬恩·蒂格·奥凯尔斯
【申请人】哥本哈根大学, 丹麦技术大学