甲基丙烯酸酯的制造方法及新的甲基丙烯酸酯合成酶的制作方法
【专利摘要】作为利用生物催化剂的甲基丙烯酸酯的制造方法，提供含有如下工序的甲基丙烯酸酯的制造方法：在来自以下植物的醇酰基转移酶存在下，使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物为选自由属于木犀属(Osmanthus)的植物、属于葡萄属(Vitis)的植物、属于柑橘属(Citrus)的植物、属于榴莲属(Durio)的植物、属于木兰属(Magnolia)的植物及属于果香菊属(Chamaemelum)的植物组成的组中的植物。
【专利说明】
甲基丙稀酸醋的制造方法及新的甲基丙稀酸醋合成酶
技术领域
[0001] 本发明设及使用了生物催化剂的有机酸醋的制法、特别是甲基丙締酸醋的制法。 更详细而言，设及使用了具有甲基丙締酸醋生成能力的醇酷基转移酶的甲基丙締酸醋的制 造方法，进而设及运些醇酷基转移酶及其利用方法。
【背景技术】
[0002] 甲基丙締酸醋主要用作丙締酸类树脂的原料，作为涂料、粘接剂、树脂改性剂等领 域的共聚单体也有很多需求。作为工业性制法，有若干种方法，已知例如W丙酬及氯化氨为 原料的ACH(丙酬氯醇)法、W异下締及叔下醇为原料的直接氧化法。运些化学方式的制造方 法依赖于化石原料，此外需要大量的能量。
[0003] 近年来，从防止地球溫暖化及环境保护的观点出发，使用生物质原料代替目前的 化石原料作为碳源而制造各种化学制品的技术受到关注。也期待由生物质原料制造甲基丙 締酸醋，但尚未报道使用生物催化剂由生物质原料制造的具体制造例。
[0004] 例如，提出了利用天然存在的微生物，由糖等天然物质生产作为甲基丙締酸的前 体的2-径基异下酸及3-径基异下酸的方法(参照专利文献1、2及非专利文献1)。但是，运些 方法中，使前体脱水生成甲基丙締酸的工序依然依赖于化学方法。
[0005] 另外，虽然已经提出了使用导入有多个酶基因的、非天然存在的重组微生物，由葡 萄糖生成甲基丙締酸的方法，但是运些不过是将已知的酶反应及由此类推的假想酶反应组 合，并未进行实际验证(参照专利文献3~5)。特别是，专利文献5虽然例示了具有一般的醋 生成活性的多种生物催化剂(水解酶、蜡醋合成酶、醇乙酷转移酶），但所例示的生物催化剂 是否具有甲基丙締酸醋合成活性尚不明确。
[0006] 进而，专利文献6公开了在丙締酷辅酶A和醇的存在下，使水解酶起作用来制造丙 締酸醋的方法。该文献中给出了甲基丙締酸醋也可W同样制造的启示。但是，若考虑生物催 化剂的多样性、底物特异性，则其不过公开了通过一部分水解酶能够制造丙締酸醋，而结构 不同的甲基丙締酸醋是否能够同样地通过水解酶制造尚不明确。进而，是否能够通过反应 机理不同的其它种类的生物催化剂来制造也是完全不明确的。另外，通过专利文献6所述的 水解酶合成醋时，可W预想生成的醋直接由于水解活性而被分解，很难认为是有效的制造 方法。
[0007] 另一方面，醇酷基转移酶作为果味(fruity flavor)合成酶而已知。专利文献7鉴 定了特定果实中所含的该酶的基因，提出作为果实味道的各种醋的合成方法。但是，关于甲 基丙締酸醋是否能够通过运些酶来合成则没有报道，因此运点并不明确。
[0008] 如上所述，虽然提出若干方案或者进行了若干研究，但并不存在实际利用酶反应 来制造甲基丙締酸醋的例子，期待建立有效的制造方法。
[0009] 现有技术文献 [0010] 专利文献
[0011] 专利文献1:国际公开第2007/110394号小册子
[0012] 专利文献2:国际公开第2008/145737号小册子
[0013] 专利文献3:国际公开第2009/135074号小册子
[0014] 专利文献4:国际公开第2011/031897号小册子 [0015] 专利文献5:国际公开第2012/135789号小册子
[0016] 专利文献6:国际公开第2007/039415号小册子
[0017] 专利文献7:国际公开第00/32789号小册子
[0018] 专利文献8:日本特开2011-200133号公报
[0019] 专利文献9:日本特开平5-64589号公报
[0020] 专利文献10:日本特开平10-337185号
[0021] 专利文献11:日本特开平10-24867号
[0022] 非专利文献
[0023] 非专利文献l:Green Chemistry，2012，14，1942-1948
[0024] 非专利文献2:Methods in Enzymology，2000,324,73_79
[00巧]非专利文献3:Botanical Journal of the Linnean Society,2009,161，105 - 121
[00%]非专利文献 4:Microbiology ,1999,145,2323-23:34
【发明内容】
[0027] 发明要解决的课题
[0028] 本发明的目的在于，提供一种利用生物催化剂的甲基丙締酸醋的制造方法。另外， 本发明的目的在于，提供具有甲基丙締酸醋合成活性的新的醇酷基转移酶。
[0029] 用于解决课题的手段
[0030] 本发明人发现，来自特定植物的醇酷基转移酶具有甲基丙締酸醋的合成活性，直 至完成了本发明。进而，成功地由植物体的悬浊液获得新的醇酷基转移酶，直至完成了本发 明。即，本发明如下所述。
[0031] [1] -种甲基丙締酸醋的制造方法，其含有如下工序:在来自W下植物的醇酷基转 移酶存在下，使醇或酪类作用于甲基丙締酷辅酶A而合成甲基丙締酸醋，所述植物为选自由 属于唇形目化amiales)的植物、属于葡萄目（Vitales)的植物、属于无患子目（Sapindales) 的植物、属于锦葵目（Malvales)的植物、属于木兰目（Magnoliales)的植物及属于菊目 (Asterales)的植物组成的组中的植物。
[0032] [2] -种甲基丙締酸醋的制造方法，其含有如下工序:在来自W下植物的醇酷基转 移酶存在下，使醇或酪类作用于甲基丙締酷辅酶A而合成甲基丙締酸醋，所述植物为选自由 属于木犀科(Oleaceae)的植物、属于葡萄科(Vitaceae)的植物、属于芸香科(Rutaceae)的 植物、属于锦葵科(Malvaceae)的植物、属于木兰科(Magnol iaceae)的植物及属于菊科 (Asteraceae)的植物组成的组中的植物。
[0033] [3] -种甲基丙締酸醋的制造方法，其含有如下工序:在来自W下植物的醇酷基转 移酶存在下，使醇或酪类作用于甲基丙締酷辅酶A而合成甲基丙締酸醋，所述植物为选自由 属于木犀属(Osman thus)的植物、属于葡萄属(Vitis)的植物、属于相橘属(Citrus)的植物、 属于恼莲属(Durio)的植物、属于木兰属(Ma即olia)的植物及属于果香菊属(化amaemelum) 的植物组成的组中的植物。
[0034] [4]根据[1]~[3]的甲基丙締酸醋的制造方法，其中，植物为从木犀(Osmanthus fragrans)、葡萄（Vitis vinifera)、葡萄抽（Citrus X paradisi)、恼莲（Durio zibethinus)、含笑(Michelia f igo)及罗马洋甘菊(Qiamaemelum nobile)中选择的植物。
[0035] [5] -种甲基丙締酸醋的制造方法，其含有如下工序:在具有W下的（1)~（3)的理 化学性质的醇酷基转移酶存在下，使醇或酪类作用于甲基丙締酷辅酶A而合成甲基丙締酸 醋。
[0036] (1)在醇或酪类的存在下，作用于甲基丙締酷辅酶A而生成甲基丙締酸醋。
[0037] (2)对甲基丙締酷辅酶A的活性高于对乙酷辅酶A的活性。
[0038] (3)对甲基丙締酷辅酶A的Km值为0.5mMW下。
[0039] [6]-种醇酷基转移酶或该酶的组合物，所述醇酷基转移酶具有W下的（1)~（5) 的理化学性质。
[0040] (1)在醇或酪类的存在下，作用于甲基丙締酷辅酶A而生成甲基丙締酸醋。
[0041] (2)对甲基丙締酷辅酶A的活性高于对乙酷辅酶A的活性。
[0042] (3)对异下酷辅酶A的活性高于对乙酷辅酶A的活性。
[0043] (4)对甲基丙締酷辅酶A的Km值为0.5mMW下。
[0044] (5) W甲基丙締酷辅酶A及正下醇为底物时，最适抑为8~9。
[0045] [7]根据[6]的醇酷基转移酶或该酶的组合物，其来自属于菊目（Asterales)的植 物。
[0046] [引根据[7]的醇酷基转移酶或该酶的组合物，其来自属于菊科(Asteraceae)的植 物。
[0047] [9]根据[8]的醇酷基转移酶或该酶的组合物，其来自属于果香菊属 (Qiamaemelum)的植物。
[0048] [10]根据[9]的醇酷基转移酶或该酶的组合物，其来自罗马洋甘菊(Chamaemelum nobile)。
[0049] [11]-种有机酸醋的制造方法，其使用[6]~[10]中任一项的醇酷基转移酶或该 酶的组合物。
[0050] [12]-种醇酷基转移酶，其来自选自由属于唇形目化amiales)的植物、属于葡萄 目（Vitales)的植物、属于无患子目（Sapindales)的植物、属于锦葵目（Malvales)的植物、 属于木兰目（Magnoliales)的植物及属于菊目（Asterales)的植物组成的组中的植物，且具 有在醇或酪类的存在下作用于甲基丙締酷辅酶A而生成甲基丙締酸醋的能力。
[0051] [13]根据[12]的醇酷基转移酶，其中，上述植物为属于木犀科(Oleaceae)的植物、 属于葡萄科(Vitaceae)的植物、属于芸香科(Ru化ceae)的植物、属于锦葵科(Malvaceae)的 植物、属于木兰科(Magnoliaceae)的植物及属于菊科(Asteraceae)的植物。
[0052] [14]根据[13]的醇酷基转移酶，其中，上述植物为属于木犀属（Osmanthus)的植 物、属于葡萄属(Vitis)的植物、属于相橘属(Citrus)的植物、属于恼莲属(Durio)的植物、 属于木兰属(1曰旨11〇11曰）的植物及属于果香菊属(化曰111曰61]161加1)的植物。
[0053] [15]根据[14]的醇酷基转移酶，其中，上述植物为从木犀(Osmanthus fragrans)、 葡萄（Vitis vinifera)、葡萄抽（Citrus X paradisi)、恼莲（Durio zibethinus)、含笑 (Michelia figo)及罗马洋甘菊(Qiamaemelum nobile)中选择的植物。
[0054] [16]根据[1引的醇酷基转移酶，其具有W下的（1)~(6)的理化学性质。
[0055] (1)在醇或酪类的存在下，作用于甲基丙締酷辅酶A而生成甲基丙締酸醋。
[0056] (2)对甲基丙締酷辅酶A的活性高于对乙酷辅酶A的活性。
[0057] (3)对异下酷辅酶A的活性高于对乙酷辅酶A的活性。
[0058] (4)对丙酷辅酶A的活性高于对乙酷辅酶A的活性。
[0化9 ] (5)对甲基丙締酷辅酶A的Km值为0.5mM W下。
[0060] (6) W甲基丙締酷辅酶A及正下醇为底物时，最适抑为8~9。
[0061] [17]根据[16]的醇酷基转移酶，其来自属于菊科(Asteraceae)的植物。
[0062] [1引根据[17]的醇酷基转移酶，其来自属于果香菊属(化amaemehim)的植物。
[0063] [19]根据[18]的醇酷基转移酶，其来自罗马洋甘菊(Chamaemelum nobile)。
[0064] 发明的效果
[0065] 根据本发明，能够利用生物催化剂进行甲基丙締酸醋的制造。通过将本发明的制 造方法和生物体内代谢组合，还能够实现甲基丙締酸醋的发酵生产。其结果是，与W往的化 学制造工艺相比，能够在极大地降低能量、资源及环境负担的条件下制造甲基丙締酸醋。另 夕h通过利用本发明的新的酶，能够更高效地制造甲基丙締酸醋等有机酸醋。
【附图说明】
[0066] 图1为示出利用DEAE - T0Y0PEA化柱(第2次)进行的纯化(洗脱曲线)的图表。
[0067] 图2为示出利用诞京脂糖柱进行的纯化(洗脱曲线)的图表。
[006引图3为示出利用MonoQ 5/50(iL柱进行的纯化(洗脱曲线）的图表。
[0069] 图4为示出利用Superdex 200 10/300化柱的纯化(洗脱曲线）的图表。
[0070] 图5为示出来自罗马洋甘菊的AAT的最适抑的测定结果的图表。
[0071] 图6为示出来自罗马洋甘菊的AAT的底物浓度和反应速度的关系的图表。（A)表示 甲基丙締酷辅酶A的结果、(B)表示乙酷辅酶A的结果。
【具体实施方式】
[0072] W下参照【附图说明】用于实施本发明的优选方式。需要说明的是。W下所说明的实 施方式是示出本发明的代表性实施方式的一个例子，不可基于此对本发明的范围作狭义解 释。
[0073] 1.利用醇酷基转移酶的甲基丙締酸醋的制造方法
[0074] [甲基丙締酸醋]
[0075] 本发明中，甲基丙締酸醋是指式1所示的化合物。式1中，R表示直链或支链的碳数 为1~20的控基。控基可W是饱和或不饱和的非环式，也可W是饱和或不饱和的环式。优选 直链或支链的碳数为1~10的非取代的烷基、芳烷基或芳基。特别优选甲基、乙基、正丙基、 异丙基、正下基、异下基、仲下基、叔下基、正戊基、异戊基、叔戊基、正己基、异己基、2-己 基、二甲基下基、乙基下基、庚基、辛基、2-乙基己基之类的碳数1~8的烷基、苄基或苯基。
[0076] C 出= C(CH3)C00_R (式 1)
[0077] "甲基丙締酸"（IUPAC名：2-甲基一2-丙締酸)是指具有下述式的化合物，还包括 其的任意的盐或离子化的形态。作为甲基丙締酸的盐，可w列举例如钢盐、钟盐、巧盐及儀 盐等。
[007引 C 出= C(CH3)C00H
[0079] [甲基丙締酷辅酶A]
[0080] 本发明中，甲基丙締酷辅酶A是指W下结构式所示的化合物。已知的是，在生物体 内，甲基丙締酷辅酶A为鄉氨酸的代谢中间体。本发明中使用的甲基丙締酷辅酶A可W是利 用公知的或新的方法制造的甲基丙締酷辅酶A。作为其合成方法，已知通过有机化学方式合 成甲基丙締酸酢和辅酶A的方法(Methods in Enzymology .324,73 -79(2000))或使用酶反 应合成的方法。
[00川[化学式。
[0082]
[0083] 在本发明中，运些之中可W优选使用W异下酷辅酶A为原料、在酷基辅酶A脱氨酶 化C 1.3.99.3)(W下称为ACD)的作用下转变得到的甲基丙締酷辅酶A或在締酷辅酶A水合 酶化C 4.2.1.17)( W下称为ECH)的作用下由3-径基异下酷辅酶A转变得到的甲基丙締酷 辅酶A。进而，本发明中使用的甲基丙締酷辅酶A还可W使用由2-氧代异戊酸经由异下酷辅 酶A而制造的甲基丙締酷辅酶A。即，本发明的方法中，通过使用由异下酷辅酶A或3-径基异 下酷辅酶A制造的甲基丙締酷辅酶A，利用酶所引起的连续反应而使收率提高并抑制杂质， 并且能够在不经由或不副产对生物体毒性强的甲基丙締酸的条件下直接合成甲基丙締酸 醋。通过上述方法，能够实现利用环境负担小的生物体内连续反应(代谢发酵)而制造甲基 丙締酸醋。
[0084] [醇.酪类]
[0085] 成为本发明中的甲基丙締酸醋的制造的原料的醇或酪类为W下的式2所示的化合 物。由于醇或酪类的结构与甲基丙締酸醋是对应的，因此其结构的定义与上述式1的R相同， 表示直链或支链的碳数为1~20的控基。控基可W为饱和或不饱和的非环式，也可W为饱和 或不饱和的环式。优选直链或支链的碳数为1~10的非取代的醇、芳烷基醇或酪类，更优选 甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正下醇、异下醇、仲下醇、叔下醇、正戊醇、异戊醇、叔戊醇、正己 醇、异己醇、2-己醇、二甲基下醇、乙基下醇、庚醇、辛醇、2-乙基己醇之类的碳数1~8的烧 基醇、苄基醇或酪。特别优选甲醇、乙醇、正下醇、异下醇、正己醇。
[0086] R-OH (式 2)
[0087] [醇酷基转移酶]
[0088] 本发明的醇酷基转移酶下称为AAT)是具有如下催化作用的酶，所述催化作用 为将酷基辅酶A的酷基转移给醇或酪类而合成醋。据说AAT参与各种水果中的醋的生成。已 知AAT存在于姜目（香蕉）、菩薇目（草替、苹果、梨、桃）、葫芦目（甜瓜）、茶目（雜猴桃）、唇形 目（橄揽）、茄目（番茄）、无患子目（梓樣、芒果)等植物中。
[0089] 本发明中使用的AAT为来自选自由属于唇形目化amiales)、葡萄目（Vitales)、无 患子目（Sapindales)、锦葵目（Malvales)、木兰目（Magnoliales)及菊目（Asterales)各目 的植物组成的组中的植物的AAT，只要具有^甲基丙締醜辅酶A与醇或m类为原料而制造甲 基丙締酸醋的能力，则没有特别限定，对其种类及起源没有限制。
[0090] 用于本发明的AAr^W通过^下方法由上述植物容易地获得。根据需要将组织的 适当部位切断，从而可获得。在该切断部位添加含有甲基丙締醜辅酶A和式2所示的醇或m 类的溶液，振荡并使其反应一定时间。通过利用GC(气相色谱)确认反应液中有无甲基丙締 酸醋，能够对合成活性进行确认。具体而言，例如，将叶、花、花蕾、果肉或果皮切断，在其中 添加含有0.01~lOmM的甲基丙締醜辅酶A及2~50倍摩尔量的正下醇的溶液，在3(TC振荡1 ~10小时。反应结束后，用GC确认有无甲基丙締酸醋，由此可^获得能够用于本发明的AAT。
[0091] 作为用于本发明的AAT的酶源，为属于选自唇形目（Lamiales)、葡萄目（Vitales)、 无患子目（Sapindales)、锦葵目（Maivales)、木兰目（Magnoliales)及菊目（Asterales)组 成的组中的任意目的植物。
[0092] 作为属于唇形目的植物，优选爵床科(Acanthaceae)、紫蔵科（Bignoniaceae)、腺 毛草科（871311(130636)、荷包花科（〔31〇6〇131'130636)、四角果科（〔31'1611131111130636)、苦宦 苔科（Gesneriaceae)、唇形科化amiaceae)、母草科（Linderniaceae)、狐藻科 (Lentibulariaceae)、角胡麻科（Martyniaceae)、木犀科（Oleaceae)、列当科 (Orobanchaceae)、泡桐科（Paulowniaceae)、胡麻科（Pedaliaceae)、透骨草科 (戶11巧11130 636)、车前科（？1311巾3旨；[1130636)、戴缪木科（？10(3 03961'1113巾30 636)、夷地黄科 (5(3]116容61130636)、玄参科（5(31'091111131'130636)、密穗草科（5^化30636)、四粉草科 (Tetrachon虹aceae)、猩猩茶科（Thomandersiaceae)及马鞭草科（Verbenaceae)的植物D
[0093] 作为属于葡萄目的植物，优选葡萄科(Vitaceae)的植物。
[0094] 作为属于无患子目的植物，优选漆树科（Anacardi aceae)、熏倒牛科 (Biebersteiniaceae)、橄揽科（Burseraceae)、番苦木科化irkiaceae)、棟科（Meliaceae)、 白刺科（Nitrariaceae)、芸香科（Rutaceae)、无患子科（Sapindaceae)及苦木科 (S imaroubaceae)的植物 D
[009日]作为属于锦葵目的植物，优选红木科(Bixaceae)、半日花科(Cistaceae)、簇花草 科（〔7巾；[113 0636)、龙脑香科（019巾61'003巧30636)、锦葵科（]\131￥30636)、文定果科 (Muntingiaceae)、沙霉科（Neuradaceae)、旋花树科（Sarcolaenaceae)、球霉树科 (Sphaerosepalaceae)及瑞香科（扣711161363〇636)的植物。
[0096]作为属于木兰目的植物，优选番蒜枝科（Annonaceae)、单室木兰科 (Degeneriaceae) >ifi(Eupomatiaceae) >^*>i￡^f4(Himantandraceae) > (Magnoliaceae)及肉豆蘿科（Myristicacea)的植物 D
[0097]作为属于菊目的植物，优选假海桐科（Alseuosmiaceae)、雪叶科 (Argophyllaceae)、菊科（Asteraceae)、头花草科（Calyceraceae)、枯梗科 (Campanulaceae )、海桐科（Goodeniaceae)、睡莱科（Menyanthaceae)、五膜草科 化611巾3911則旨1113巾30636)、石冬青科化11611；[1130636)、卢梭木科化0113 3630636)及花柱草科 (Stylidiaceae)的植物 D
[0098] 其中，更优选属于木犀科、葡萄科、芸香科、锦葵科、木兰科或菊科的植物。
[0099] 具体而言，作为属于木犀科的植物，优选木犀属(Osmanthus)及橄揽属(Olea)、素 馨属(Jasminum)、连翅属(Forsythia)、下香属(Syringa)、流苏树属(Qiionanthus)、白蜡树 属（Fraxinus)及女贞属化igustrum)的植物；作为属于马鞭草科的植物，优选美女樓属 (Glandularia)的植物;作为属于唇形科的植物，优选鼠尾草属(Salvia)的植物。
[0100] 作为属于葡萄科的植物，优选葡萄属(Vitis)、蛇葡萄属(Ampelopsis)、乌葱替属 (Cayratia)、白粉藤属（Cissus)、葡萄瓷属（Cyphostemma)、火筒树属化eea)、地锦属 。日1'1：11日]10。133113)及崖爬藤属巧日付日31：1旨1]1日）的植物。
[0101 ]作为属于芸香科的植物，优选相橘属（Ci trus )、木橘属（Aegl e )、花椒属 (Zanthoxylum)、九里香属(Murraya)、芸香属（Ru1:a)、臭常山属（Orixa)、茵芋属（Skimmia) 吴荣英属（Euodia)、黄築属"!1日11〇(1日]1(11'〇]1)、波罗尼亚属（8〇1'〇]11日）、山油相属 (Acronychia)、黄皮属（Clausena)、考来木属（Correa)、山小枯属(Glycosmis)及蜜荣英属 (Mel icope)的植物;作为属于无患子科的植物，优选慕枝属化itchi)的植物;作为属于漆树 科的植物，优选化果属(Mangifera)的植物。
[0102]作为属于锦葵科的植物，优选恼莲属（Durio)、可可属（Theobroma)、荷麻属 (Abutilon)、秋葵属（Abelmoschus)、棉属（Gossypium)、孔雀葵属（Pavonia)、木穫属 化ibis州S)、黄花捻属(Sida)及锦葵属(Malva)的植物。
[01 03 ]作为属于木兰科的植物，优选木兰属(Magno 1 i a)的植物。
[0104]作为属于菊科的植物，优选属于果香菊属(化amaemelum)、著属(4。]1；[11日日）、紫锥 菊属巧chinacea)、母菊属(Matricaria)、菊葛属（Tanacetum)、蒲公英属（Taraxa州m)、葛属 (Artemisia)、蜂斗菜属（Petasites)、蜡菊属巧elichrysum)、檀香艾属（Santolina)、菜劑 属（切11日抑）、水飞劑属（5;[171311111)、金盏花属（〔日1日]1(1111日）、菊宦属（(：;[。1101'；[11111)、红花属 (&;rthamus)及菊属（化巧santhemum)的植物。
[0105] 其中，特别优选属于木犀属、葡萄属、相橘属、恼莲属、木兰属或果香菊属的植物。
[0106] 进而，具体而言，作为属于木犀属的植物，优选木犀(银木犀、金木犀、淡黄木犀、白 木犀）（Osmanthus fragrans)、格树（Osmanthus heterophyllus)、厚边木犀（Osmanthus marginatus)、齿叶木犀（Osmanthus Xf〇；rtunei)及岛蜗木犀（Osmanthus insularis);作为 属于橄揽属的植物，优选油橄揽(Olea europaea);作为属于鼠尾草属的植物，优选一串红 (Salvia splendens)、作为属于美女樓属的植物，优选美女樓(Glandularia X hybrida)。
[0107] 作为属于葡萄属的植物，优选葡萄（Vitis vinifera、Vitis labrusca)、夏葡萄 (Vitis aestivalis)、山葡萄(Vitis coignetiae)及桑叶葡萄(Vitis ficifolia)。
[0108] 作为属于相橘属的植物，优选巧樣(Citrus limon)、酢橘(Citrus sudachi)、臭澄 (Citrus sphaerocarpa)、葡萄抽（Citrus x paradisi )、抽子（Citrus junos)、莱姆 (Citrus aurantifolia)、溫州蜜相（Citrusunshiu)及澄（Citrus sinensis)的植物；作为 属于木橘属的植物，优选木橘(Aegle marmelos)的植物;作为属于慕枝属的植物，优选慕枝 (Litchi chinensis)的植物;作为属于化果属的植物，优选芒果(Mangifera indica)。
[0109] 作为属于恼莲属的植物，优选恼莲（Durio zibethinus、Du;rio testudinarius、 Durio kutejensis、Durio oxley曰nus、Durio gr曰veolens、Durio dulcis)的植物；作为属 于可可属的植物，优选可可(Theobroma cacao)。
[0110] 作为属于木兰属的植物，优选含笑（Magnolia figo)、台湾含笑（Magnolia compressa)、黄玉兰（Magnolia champaca)、紫玉兰（Magnolia liliif lora)、日本辛夷 (Magnolia kobus)、厚朴（Magnolia obovata及Magnolia laevifolia) 〇
[0111] 作为属于果香菊属的植物，优选罗马洋甘菊(化amaemelum nobile及化amaemelum fuscatum)。
[0112] 其中，特别优选木犀、葡萄、葡萄抽、恼莲、含笑或罗马洋甘菊。
[0113] 需要说明的是，在直接使用植物作为酶源而进行合成反应时，在W碳数为1~2的 醇为底物时，特别是使用属于葡萄属或恼莲属的植物是更为优选的（参照后述实施例的"表 n〇
[0114] 本发明中，植物的分类是按照APG植物分类体系第3版(Botanical Journal of the Linnean Society,2009,161,105121)进行的。
[0115] 本发明中，将AAT供于反应时，只要显示出上述催化剂活性则对其使用形态没有特 别限定，也可W直接使用含有AAT的生物组织或其处理物。作为运样的生物组织，可W使用 植物体整体、植物器官（例如果实、叶、花瓣、茎、种子等）、植物组织（例如果实表皮、果肉 等）。作为生物组织的处理物，可W列举从生物组织中提取的AAT的粗酶液或纯化酶等。
[0116] 对纯化AAT的方法没有特别限定，优选通过W下方法进行分离。将上述植物的具有 AAT活性的组织破碎后，悬浮于化is-肥1缓冲液、憐酸缓冲液等缓冲液中。对该粗酶液，单 独使用酶的纯化中常用的（1)基于沉淀的分级、（2)各种色谱、（3)基于透析、超滤等的低分 子物质的除去方法等，或将运些方法适当组合而用。
[0117] 纯化AAT的具体优选方式如下。将生物组织用液氮等冻结并磨碎后，用5倍量的含 有DTT(二硫苏糖醇)及甘油等的化is-HCl缓冲液提取。然后，将粗酶提取液供于离子交换 色谱，将其非吸附部分回收，从而获得酶提取液。对几种调制粗酶提取液的方法进行了研 究，结果明确了 ：根据该方法，能够排除植物中所含的多酪的影响，稳定且高效地获得酶提 取液。另外还明确了：利用硫酸锭等进行沉淀的分级方式会诱发酶活性的丧失。
[0118] 对于获得的酶提取液，通过使用离子交换色谱、凝胶过滤柱等，能够高效地纯化酶 蛋白。
[0119] 基于所纯化的AAT蛋白，通过基因工程手法能够获得基因信息。通过公知方法对该 基因信息进行分离或全合成，将其导入常见的宿主载体系统，通过用该载体系统转化的微 生物表达候选蛋白，能够用于本发明的甲基丙締酸醋的制造。
[0120] [适合制造甲基丙締酸醋的AAT的酶学性质]
[0121] 本发明的AAT在醇或酪类的存在下作用于甲基丙締酷辅酶A而催化生成甲基丙締 酸醋的反应。AAT优选在W甲基丙締酷辅酶A为底物时具有高反应性的AAT。具体而言，优选 对甲基丙締酷辅酶A的活性高于对乙酷辅酶A的活性、且对甲基丙締酷辅酶A的Km值为0.5mM W下的AAT。根据具有运样的性质的AAT，能够选择性良好地生产甲基丙締酸醋。
[0122] (1)底物特异性
[0123] 作为本发明中优选的AAT，在W对甲基丙締酷辅酶A的反应性为基准时，至少对乙 酷辅酶A的反应性低即可。更具体而言，将W正下醇为底物时对甲基丙締酷辅酶A的反应性 设为100%时，本发明的优选的AAT优选对乙酷辅酶A的反应性为同等W下，更优选为50% W 下，进而优选为40% W下。或将W正己醇为底物时对甲基丙締酷辅酶A的反应性设为100% 时，优选对乙酷辅酶A的反应性为同等W下、更优选为70 % W下，进而优选为50 % W下。
[0124] (2)对甲基丙締酷辅酶A的亲和性
[0125] 本发明的AAT优选对甲基丙締酷辅酶A的亲和性高。对底物的亲和性可W通过米氏 常数化m)来进行评价。对甲基丙締酷辅酶A的Km为按照后述实施例测定、计算而获得的值。
[0126] 作为本发明优选的AAT的对甲基丙締酷辅酶A的Km值，为对乙酷辅酶A的Km值W下 即可，优选为0.5mMW下，更优选为0.2mMW下，进而优选为0.1 mMW下，特别优选为0.05mMW 下。通过亲和性高，即使作为原料的甲基丙締酷辅酶A的浓度低的情况下，也能够进行上述 催化反应，能够更高效地制造甲基丙締酸醋。
[0127] [AAT活性表达用重组微生物]
[0128] 进而，在将AAT供于反应时，还可W将上述AAT的基因分离并导入例如常见的宿主 载体系统，而利用用该载体系统转化的微生物。作为宿主，若为细菌，可W列举大肠杆菌、红 球菌属（I^iodococcus)、假单胞菌属（Pseudomonas)、棒状杆菌属（Corynebacterium)、芽抱 杆菌属（8日。;[11113)、链球菌属（5付日91:0(30(3州3)、链霉菌属（5付日91:01117。日3)等，若为酵母，可 W列举酵母菌属（Saccharomyces)、念珠菌属（Candida)、裂殖酵母属 (化izosaccha;romyces)、毕赤酵母属（Pichia)，若为丝状真菌，可W列举曲霉菌属 (Aspe巧i 1 lus)等。其中，特别是利用大肠杆菌简便且效率也高，故而优选。
[0129] 已经公开了若干种运些植物的AAT基因。可W基于该信息制作DNA探针，例如制作 用于PCR的引物并进行PCR，从而分离该基因。另外，还可W通过常规方法对AAT基因的碱基 序列进行全合成。关于运些基因信息为己知的AAT是否具有甲基丙締酸醋的合成活性，可W 通过上述方法同样地确认。另一方面，对于基因信息尚不明确的AAT，可W纯化AAT，基于其 蛋白质通过基因工程手法获得基因信息。
[0130] 本发明中，作为优选的AAT基因，只要是来自选自由属于唇形目化amiales)、葡萄 目（Vitales)、无患子目（Sapindales)、锦葵目（Maivales)、木兰目（Magnoliales)及菊目 (Asterales)的各目的植物组成的组中的植物、且其翻译产物具有生成甲基丙締酸醋的能 力，贝峨有特别限定，可W从上述AAT酶源中适当选择。
[0131] 需要说明的是，在本发明中，AAT基因还含有编码如下蛋白的基因，所述蛋白含有 在野生型的氨基酸序列中置换、缺失或附加1个或数个氨基酸的氨基酸序列，且具有由甲基 丙締酷辅酶A和醇生成甲基丙締酸醋的活性。
[0132] 运里，"数个"是指1~40个、优选1~20个、更优选10个W下。为了在基因中导入变 异，可W通过Kunkel法、Gapped dupler法等公知手法，使用利用位点特异性突变诱导法的 变异导入用试剂盒、例如如化OiangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stra1:agene公 司）、GeneTailorTM Site -Directed Mutagenesis System( Invitrogen公司）、TaKaRa Site -Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan -Super Express Km等：宝生物公 司）等。或者，也可W人工合成具有含有变异的序列的整个基因。
[0133] 本发明中，DNA的碱基序列的确认可W通过利用惯用的方法进行序列确定来进行。 例如，还可W基于桑格(Sanger)法使用适当的DNA测序仪对序列进行确认。
[0134] 另外，本发明中，AAT基因还含有编码如下蛋白的基因，所述蛋白与由野生型的氨 基酸序列构成的蛋白显示90% W上、优选95% W上、更优选99.5% W上、进而优选99.9% W 上的同源性，且具有由甲基丙締酷辅酶A和醇生成甲基丙締酸醋的活性。
[0135] 进而，本发明中，AAT基因还包括如下基因，所述基因与具有和野生型的碱基序列 互补的碱基序列的多聚核巧酸在严格条件下杂交，且编码具有由甲基丙締酷辅酶A和醇生 成甲基丙締酸醋的活性的蛋白。作为上述严格条件，可W列举例如:将固定有DNA的尼龙膜 在含有6 X SSC( 1 X SSC为在1升水中溶解氯化纳8.76g、巧樣酸钢4.41g而成的溶液）、1 % SDS、100μg/ml鱼精DNA、0.1%牛血清白蛋白、0.1%聚乙締基化咯烧酬、0.1%尸山〇11的溶液 中于65°C与探针一起保溫20小时而进行杂交的条件，但并非仅限于此。本领域技术人员可 W在运样的缓冲液的盐浓度、溫度等条件的基础上考虑其它的探针浓度、探针长度、反应时 间等各项条件来设定杂交的条件。作为杂交后的洗涂条件，可W列举例如"2XSSC、0.1% SDS、42°Cr'、"lXSSC、0.1%SDS、37°Cr'，作为更严格的条件，可W列举例如"1XSSC、0.1% SDS、65 XT'、％. 5 X SSC、0.1 % SDS、50 XT' 等条件。
[0136] 关于杂交法的详细步骤，可W参照Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))、Current Protocols in Molecular BiologyQohn Wiley&Sons(1987 -1997))等。
[0137] 进而，本发明中，AAT基因还包括如下基因，所述基因由使用BLAST等(例如默认值， 即初始设定的参数)计算时与野生型的碱基序列具有80% W上、更优选90% W上、最优选 95% W上的同源性的碱基序列构成，且编码具有由甲基丙締酷辅酶A和醇生成甲基丙締酸 醋的活性的蛋白质。另外，上述AAT基因的密码子可W根据转化中使用的微生物宿主的密码 子使用频率进行转变。
[0138] 运里，序列的"同源性"是指:在为碱基序列时，按照欲比较的2个碱基序列的碱基 尽量多地达到一致的方式将两个碱基序列对齐，将一致的碱基数除W全部碱基数而得的值 W百分率表示。进行上述对齐时，根据需要，在进行比较的2个序列的一者或两者中适当插 入间隔。运样的序列的对齐化可W使用例如BLAST、FASTA、&USTALW等公知的程序来进行。 在插入间隔时，上述全部碱基数为将1个间隔作为1个碱基计数时的碱基数。运样计数获得 的全部碱基数在进行比较的2个序列间不同的情况下，同源性（％ )通过用一致的碱基数除 W较长的序列的全部碱基数而算出。关于氨基酸序列的同源性也同样。
[0139] 在甲基丙締酸醋合成反应中，可W直接使用对上述重组微生物进行培养而获得的 培养液，或者使用通过离屯、分离等收集菌体的操作从该培养液获得的菌体或其处理物等。 作为菌体处理物，可W列举用丙酬、甲苯等处理过的菌体、冷冻干燥菌体、菌体破碎物、将菌 体破碎而获得的无细胞提取物、从运些之中提取酶而获得的粗酶或纯化酶等。
[0140] 导入了AAT基因的微生物中，还可W根据需要导入ACD基因、ECH基因、BCKAD(2-氧 代异戊酸脱氨酶)基因等，由异下酷辅酶A、3-^基异下酷辅酶A或2-氧代异戊酸等的前体 而合成甲基丙締酸醋。
[0141] "前体"是指能够衍生为甲基丙締酷辅酶A的化合物，表示异下酷辅酶A或3-径基 异下酷辅酶A、进而能够衍生为运巧巾化合物的物质。
[0142] 能够衍生为巧巾化合物的物质可列举出例如2-氧代异戊酸、异下酸、3-径基异下 酸、乙酸、丙酬酸、乳酸、乙酷乙酸、下酸、丙酸、苹果酸、富马酸、巧樣酸及班巧酸等酸，鄉氨 酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸及谷氨酸等氨基酸类，葡萄糖、果糖及木糖等糖类等。
[0143] 为了由运些前体生成甲基丙締酸醋，还可W直接利用宿主微生物本来具有的各种 代谢系统。还可W根据需要进行基因的导入或敲除。
[0144] 2.甲基丙締酸醋的合成工序
[0145] 甲基丙締酸醋的制造可W按照W下的方法进行。在溶剂中添加甲基丙締酷辅酶A 及式2表示的醇或酪类，使其溶解或悬浮。然后，使AAT与该溶液或悬浊液接触，在控制溫度 等条件的同时使甲基丙締酷辅酶A与醇或酪类反应。通过上述反应，将甲基丙締酷辅酶A的 甲基丙締酷基转移给式2的醇或酪类而生成甲基丙締酸醋。
[0146] 含有甲基丙締酷辅酶A及式2表示的醇或酪类的溶液，通常用缓冲液等水性介质来 调制。运里，为了使反应顺利进行，可W用渗透压调节剂等对摩尔渗透压浓度和/或离子强 度进行控制。作为渗透压调节剂，只要是出于调节为相对于细胞内部等的溶液的渗透压为 等渗或高渗的目的而添加的水溶性物质即可，例如为盐或糖类，优选为盐。作为盐，优选为 金属盐，更优选为碱金属盐，进一步优选为碱金属面化物，可W列举例如氯化钢、氯化钟。作 为糖类，优选为单糖类或寡糖类，更优选为单糖类或二糖类，可W列举例如葡萄糖、薦糖、甘 露醇等。渗透压调节剂优选WlmMW上的浓度进行添加，特别优选调节为与所使用的生物细 胞内的溶液相比为等渗或高渗。
[0147] 另外，出于将生成的甲基丙締酸醋分离的目的，还可W预先添加有机溶剂，W2相 体系进行反应。作为有机溶剂，可W单独使用例如直链状、支链状或环状的、饱和或不饱和 的脂肪族控、饱和或不饱和的芳香族控等，或将它们的巧巾W上混合使用。具体而言，可W列 举例如控系溶剂(例如戊烧、己烧、环己烧、苯、甲苯、二甲苯等）、面化控系溶剂(例如二氯甲 烧、氯仿等）、酸系溶剂(例如乙酸、丙酸、异丙酸、下酸、叔下基甲基酸、二甲氧基乙烧等）、醋 系溶剂(例如甲酸甲醋、乙酸甲醋、乙酸乙醋、乙酸下醋、丙酸甲醋)等。通过预先添加运些有 机溶剂，生成的甲基丙締酸醋进入有机相，有时反应能够高效进行。
[0148] 反应液中的甲基丙締酷辅酶A及式2表示的醇或酪类的摩尔比、浓度是任意的，没 有特别限定。另外，AAT的使用量或反应条件可W根据使用的原料适当确定。通常，关于各原 料的浓度，为甲基丙締酷辅酶A时，设定在0.0000001~10质量％的范围，醇或酪类则按照相 对于所使用的甲基丙締酷辅酶A为0.1~1000倍摩尔、优选为0.5~500倍摩尔的浓度进行添 加。
[0149] 此外的反应溫度或反应时间等各种条件可W根据所使用的原料、酶的活性等适当 确定，没有特别限定，通常5~80°C使其反应1小时~1周即可。优选在10~70°C反应1~120 小时，更优选1小时W上，进而优选3小时W上。关于反应液的pH，只要反应高效地进行就没 有特别限定，例如为pH4~10的范围，优选5.0~9.0。溫度、时间及反应液的抑等优选选择反 应可完成的条件。
[0150] 作为合适条件，在pH5.5~9.0的条件下按照使甲基丙締酷辅酶A的浓度直接或间 接地达到0.000001~1质量％的范围方式来调制，醇或酪类的浓度则按照相对于所使用的 甲基丙締酷辅酶A达到1~500倍摩尔的方式来调整。然后，将溫度调制到20~40°C的范围使 其反应1小时W上。对于运些原料(底物），还可W连续地进行供给W使其达到上述范围，通 过运种方式能够提高产物的累积浓度。
[0151] 在减压下或通气条件下实施本反应也是有效的。运是由于在上述条件下，可W连 续地将生成的甲基丙締酸醋分离，其结果是，有时反应能够高效进行。
[0152] 在使用W异下酷辅酶A为原料通过ACD的作用转变成的甲基丙締酷辅酶A或由3- 径基异下酷辅酶A通过ECH的作用转变成的甲基丙締酷辅酶A来制造甲基丙締酸醋时，也优 选调整至上述条件的范围而实施。需要说明的是，通过ACD或ECH合成甲基丙締酷辅酶A的反 应可W根据公知的方法来实施（例如，作为ACD的反应条件，可W是Microbiology (1999)， 145,2323-2334记载的条件）。进而，通过与其他生物反应组合，能够实现甲基丙締酸醋在 生物体内的连续反应(发酵生产）。
[0153] 3.甲基丙締酸醋的回收
[0154] 培养基中或反应液中生成的甲基丙締酸醋及其生成量可W使用高效液相色谱及 LC-MS等常规方法来检测、测定。另外，挥发到培养容器或反应容器的气相部(顶空部)的甲 基丙締酸醋及其生成量可W使用气相色谱等常规方法检测、测定。
[0155] 甲基丙締酸醋从反应液中的分离可W根据需要将过滤、离屯、分离、真空浓缩、离子 交换或吸附色谱、溶剂提取、蒸馈及结晶等公知的操作适当组合而进行。另外，获得的甲基 丙締酸醋可W通过常规方法聚合，毫不逊色地用于W往的用途。
[0156] 如此获得的甲基丙締酸醋及其聚合物能够极大地降低对能量、资源及环境的负 担，与W石油制品为起始原料的W往的化学制造品相比，作为一种环境负担低的材料具有 非常大的社会价值。
[0157] 4.新的AAT及使用其进行的有机酸醋的制造
[0158] W下，对作为本发明的一个方面的新的AAT及使用其进行的有机酸醋的制造进行 详细说明。
[0159] 本发明的AAT是在醇或酪类的存在下作用于酷基辅酶A而催化生成有机酸醋的反 应的酶。
[0160] 本发明中的酶组合物只要含有具有甲基丙締酸醋的合成活性的AAT即可，没有特 另顺定，可W列举含有AAT的生物组织或其处理物、由生物组织提取的AAT粗酶液或纯化酶 等。进而，可W例示出培养上述基因重组生物而获得的培养液、由该培养液获得的菌体或其 处理物、由运些提取酶而获得的粗酶或纯化酶等。
[0161] (1)底物特异性
[0162] 作为本发明的AAT，对作为底物的甲基丙締酷辅酶A、丙酷辅酶A及异下酷辅酶A具 有高反应性。即，对甲基丙締酷辅酶A、丙酷辅酶A及异下酷辅酶A的活性高于对乙酷辅酶A的 活性。更具体而言，将W正下醇为底物时对甲基丙締酷辅酶A的反应性设为100%时，本发明 的AAT对丙酷辅酶A及异下酷辅酶A的反应性为同等程度，且对乙酷辅酶A的反应性为其W 下、更优选为50% W下、进而优选为40% W下。进而，相对于运巧巾底物（甲基丙締酷辅酶A、 丙酷辅酶A及异下酷辅酶A)，对下酷辅酶A及己酷辅酶A的反应性与乙酷辅酶A同样地低，为 50% W下。
[0163] (2)对甲基丙締酷辅酶A的亲和性
[0164] 本发明的AAT对甲基丙締酷辅酶A的亲和性高。对底物的亲和性可W通过米氏常数 化m)来进行评价。对甲基丙締酷辅酶A的Km为按照后述实施例测定、计算而获得的值。
[0165] 作为本发明的AAT的对甲基丙締酷辅酶A的Km值，为对乙酷辅酶A的Km值W下，优选 为0.5mMW下，更优选为0.2mMW下，进而优选为0.1 mMW下，特别优选为0.05mM W下。通过亲 和性高，即使作为原料的甲基丙締酷辅酶A的浓度低的情况下，也能够进行上述催化反应， 能够更高效地制造甲基丙締酸醋。
[0166] (3)最适反应抑
[0167]本发明的AAT在各抑下的反应性可W在抑6~10.5的比较宽的范围内确认到。作为 该反应的最适pH，在7~9的范围内。更具体而言，在8~9附近，特别是在使用抑8.5的 径基甲基氨基甲烧)一盐酸缓冲液时显示最高的活性。
[016引（4)来源
[0169] 本发明的AAT可W从选自上述的属于唇形目的植物、属于葡萄目的植物、属于无患 子目的植物、属于锦葵目的植物、属于木兰目的植物及属于菊目的植物组成的组中的植物 中分离。优选来自属于菊科的植物。进而优选来自属于果香菊属的植物。特别优选来自罗马 洋甘菊。
[0170] 如上所述，具有优异特性的本发明的AAT作为碳数3~4的饱和或不饱和的有机酸 醋的合成酶极为有用。即，根据本发明的AAT，即使原料中存在作为杂质的乙酷辅酶A时，也 能够选择性地生成目标有机酸醋。因此，该酶在预期存在杂质或担屯、存在杂质的用途(利用 生物质原料等进行醋的发酵生产等）中具有优异效果。
[0171] 实施例
[0172] W下通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明的范围不受运些实施例的范围 限定。
[0173] [实施例1:利用木犀进行的甲基丙締酸下醋的合成]
[0174] 将Ig切碎的金木犀(Osmanthus fragrans)叶量取到20ml容积的GC顶空用瓶（23 X 75mm、National Scientif ic制）中。加入1ml底物溶液（50mM Tris -HC1 (P服.5)、正下醇 40mM、甲基丙締酷基辅酶A 0.125mM)并密闭，于30°C反应12小时。反应结束后，加入lOiil作 为内标的1 OmM 2-己酬后，通过SPME(固相微萃取)法用GC-MS对产物进行分析。SPME中使 用Carboxen/PDMS(75um、化sed Silica、西格玛奥德里奇公司制），在30°C吸附10分钟。
[0175] GC-MS分析条件
[0176] 柱：TC-70(内径0.25mmX60m、0.25皿、GL Sciences公司）
[0177] 柱溫：50°C ? 5min一7.5°C/min一20(TC ? lOmin
[0178] 载气:氮
[0179] 流量：1.13ml/min
[0180] 进样（Inject) :250°C
[0181] 另外，使用O.lmM甲基丙締酸下醋溶液(50mM化is-HCl、p册.5)来确认利用金木 犀叶进行的甲基丙締酸醋的水解反应。反应在30°C进行12小时。
[0182] 甲基丙締酸醋的量是通过内标法制作标准曲线而算出的。通过相同的容量及容器 调制各浓度的标准溶液，加入lOyl作为内标的lOmM 2-己酬，然后通过SPME法及GC-MS进 行分析(n = 3)。产物的确认通过将保留时间及质谱图与标品进行比较而进行。另外，同时进 行了空白试验(无底物），确认没有甲基丙締酸下醋生成。将结果示于表1。确认通过金木犀 生成0.7iiM的甲基丙締酸下醋。
[0183] [表 1]
[0184]
[0185] 将金木犀叶的甲基丙締酸下醋的分解活性示于表2。确认甲基丙締酸下醋显著减 少，暗示来自金木犀的AAT的作用下的甲基丙締酸醋产生速度超过该植物组织中含有的醋 分解酶等引起的甲基丙締酸醋分解速度。
[0186] [表 2]
[0187]
L〇188」[实施例2:利用葡萄进行的甲基丙筛酸甲醋的合成]
[0189] 将Ig的带着皮一起切碎的葡萄（红提:Vitis vinifera)果实量取到瓶中。加入 0.5ml底物溶液(50mM Tris-肥1 (P册.5)、甲醇40mM、甲基丙締酷基辅酶AlOmM)，密闭后，在 30°C反应12小时。与实施例1同样实施分析，确认生成0.祉M的甲基丙締酸甲醋(表1)。
[0190] 另外，使用O.lmM甲基丙締酸甲醋溶液(50mM化is-HCl、p册.5)确认甲基丙締酸醋 的水解反应。反应在30°C进行3小时。将结果示于表2。
[0191] [实施例3:利用葡萄进行的甲基丙締酸下醋的合成]
[0192] 使用正下醇来代替甲醇，除此W外与实施例2同样实施。其结果是，确认生成9.OiiM 的甲基丙締酸下醋。也与实施例2同样地确认了甲基丙締酸醋的水解反应。
[0193] [实施例4:利用葡萄抽进行的甲基丙締酸己醋的合成]
[0194] 将2g摘出的葡萄抽(Citrus X paradisi)果实的果飄量取到瓶中。加入0.5ml底物 溶液（50mM lYis-肥1(抑8.5)、正己醇4〇11^、甲基丙締酷基辅酶41〇11^)，密闭后，在30°(：反 应12小时。与实施例1同样实施分析，确认生成0.3咖的甲基丙締酸己醋。
[0195] [实施例5:利用恼莲进行的甲基丙締酸乙醋的合成]
[0196] 将Ig切碎的恼莲(Durio zibethinus)果实量取到瓶中。加入0.5ml底物溶液(50mM 化is-HCl(抑8.5)、乙醇40mM、甲基丙締酷基辅酶A 0.125mM)，密闭，在30°C反应3小时。与 实施例1同样实施分析，确认生成6.7iiM的甲基丙締酸乙醋。
[0197] 另外，使用O.lmM甲基丙締酸乙醋溶液(50mM化is-HCl、p册.5)确认甲基丙締酸 醋的水解反应。反应在30°C进行3小时。将结果示于表2。
[0198] [实施例6:利用恼莲进行的甲基丙締酸下醋的合成]
[0199] 使用正下醇代替乙醇，除此W外与实施例5同样实施。其结果是，确认生成14iiM的 甲基丙締酸下醋。也与实施例5同样地确认了甲基丙締酸醋的水解反应。
[0200] [实施例7:利用含笑进行的甲基丙締酸下醋的合成]
[0201] 分别将Ig及0.5g的切碎的含笑(Magnolia figo)的叶及花芽量取到瓶中。加入1ml 底物溶液(50mM化is-肥l(抑8.5)、正下醇40mM、甲基丙締酷基辅酶A0.125mM)，密闭，在 30°C反应12小时。与实施例1同样实施分析，确认分别生成4.4iiM及0.4iiM的甲基丙締酸下 醋。
[0202] 另外，使用O.OlmM甲基丙締酸下醋溶液巧OmM化is-肥l、p册.5)确认了甲基丙締 酸醋的水解反应。反应在30°C进行12小时。将结果示于表2。
[0203] [实施例8:利用罗马洋甘菊进行的甲基丙締酸下醋的合成]
[0204] 将0.5g切碎的罗马洋甘菊(Chamaemelum nobi le)叶量取到瓶中。加入0.5ml底物 溶液(50mM化is-HCl (P册.5)、正下醇40mM、甲基丙締酷基辅酶A 0.125mM)，密闭，在30°C 反应12小时。与实施例1同样实施分析，确认生成6.7iiM的甲基丙締酸下醋。
[02化]另外，使用0.111^甲基丙締酸下醋溶液(5〇11^化13-肥1、抑8.5)确认甲基丙締酸 醋的水解反应。反应在30°C进行3小时。将结果示于表2。
[0206] [实施例9:来自罗马洋甘菊的AAT的纯化]
[0207] 只要没有特别声明，则酶的纯化在4 下的溫度进行。各级分的AAT活性的测定 是W正下醇及甲基丙締酷辅酶A为底物、使用GC进行分析的。
[0208] (1)粗酶液的调制
[0209] 将罗马洋甘菊(Qiamaemelum nobile)叶38g在液氮中粉末化。将粉末悬浮于190ml 的提取用缓冲液（10%甘油、5mM二硫苏糖醇化TT)、5%聚乙締基化咯烧酬、250mMTris-HCl (PH7.5))，通过4层纱布而过滤。将滤液在15,000g下离屯、分离15分钟，获得粗酶溶液。
[0210] (2)AAT棘性现憶法
[0211] 在2ml容积的螺口瓶(National Scientific制自动进样瓶）中调制50化1反应液 (50mM Tris-肥1(抑8.0)、40mM正下醇、0.12mM甲基丙締酷辅酶A)。加入W下的（3)~(6)各 阶段的纯化酶，密闭，在30°C反应1小时。
[0212] 反应后加入50iil作为内标的lOmM 2-己酬，用20化1辛烧进行溶剂提取。将如1的 通过离屯、分离而得的分离液注入GC，测定通过酶反应而生成的甲基丙締酸下醋。甲基丙締 酸醋的量是通过内标法制作标准曲线而算出的。
[0^3] GC分析条件
[0214] 柱:DB-WAX(内径0.25mmX60m、0.5皿、安捷伦科技有限公司）
[0215] 柱溫：115°C ? 5min一4(TC/min一20(TC ? 2min 载气:氮
[0217]检测:FID
[0別引进样（Inject)溫度：230°C
[0219] 检测(Detect)溫度:250°C
[0220] (3)利用DEAE - T0Y0PEA化柱的纯化(2次）
[0221] 将粗酶溶液供于用含有10%甘油及2mM DTT的250mM化is-HCl(p册.0)缓冲液平 衡后的DEAE-T0Y0PEA化柱(20ml)。按照常规回收级分，相对于含有10%甘油及2mM DTT的 20mMTr i S -肥1 (P册.0)缓冲液（W下称为缓冲液B)进行透析。
[0222] 进而，将透析级分再次供于用缓冲液B平衡后的DEAE-T0Y0PEA化柱（10ml)。用缓 冲液B充分洗涂后，使缓冲液B的氯化钢的浓度从0M直线上升到0.3M，进行浓度梯度洗脱。需 要说明的是，将每5.5ml洗脱液作为一个级分。将洗脱曲线示于图1。将获得的AAT活性级分 回收，相对于缓冲液B进行透析。图中，"AAT活性"（白色圆点）是将化分钟内提供化mo 1的醋 的酶量设为1U。另外，"蛋白质浓度"（黑色圆点)是使用W牛血清白蛋白作为标准品的Bio- Rad protein assay Kit(Bio_Rad，USA) 来测定的。
[0223] (4)利用诞京脂糖柱的纯化
[0224] 将所获得的透析后的AAT活性级分供于用缓冲液B平衡后的Q琼脂糖柱（10ml)。用 缓冲液B充分洗涂后，使缓冲液B的氯化钢的浓度从0M直线上升到0.3M，进行浓度梯度洗脱。 需要说明的是，将每5.5ml洗脱液作为一个级分。将洗脱曲线示于图2。将获得的AAT活性级 分回收，相对于含有2mM DTT的20mMTriS-HC1 (抑8.0)缓冲液（W下称为缓冲液C)进行透 析。
[0225] (5)利用MonoQ 5/50化柱的纯化
[0226] 将通过诞京脂糖柱获得的透析后的AAT活性级分供于用缓冲液C平衡后的MonoQ 5/ 50化柱（ImL)。使缓冲液C的氯化钢的浓度从0M直线上升到0.5M，进行浓度梯度洗脱。将洗脱 曲线示于图3。将获得的AAT活性级分回收，用Amicon叫tra-0.5mL离屯、式过滤器进行浓 缩。需要说明的是，利用该柱进行的纯化是使用AKTA Explorer 10S(通用医疗集团（GE Healthcare))、在流速0.5ml/分钟的条件下将每5.5ml作为一个级分。
[0227] (6)利用Superdex 200 10/300化柱的纯化
[0。引将通过MonoQ 5/50化柱获得的AAT活性浓缩级分供于用含有0.3M氯化钢的缓冲液 C平衡后的Superdex 200 10/300化柱。利用该柱进行的纯化是使用AKTA E邱lorer 10S、在 流速0.5ml/分钟的条件下将每0.5ml作为一个级分。将洗脱曲线示于图4。将获得的AAT活性 级分回收，相对于缓冲液B进行透析。
[0229] (7)各纯化阶段总结
[0230] 将各纯化阶段的酶组合物的收量、活性示于表3。通过总计5次的柱分离，获得活性 纯化至209倍、为201恤/mg的AAT。
[023。[表引
[0232]
[02削[实施例10:来自罗马洋甘菊的AAT的底物特异性]
[0234] 使用利用实施例9记载的MonoQ 5/50化柱获得的纯化级分，评价AAT的底物特异 性。
[0235] 在2ml容积的螺口瓶中，调制反应液（50mM化iS-肥1 (P册.5)、40mM醇、0.12mM酷 基辅酶A)，加入纯化级分，使其达到50化1。密闭，在30°C反应1小时。
[0236] 反应后，加入50]il作为内标的lOmM 2 -己酬，用20化1辛烧或己烧进行溶剂提取。 将祉1的通过离屯、分离而得的分离液注入GC，测定通过酶反应而生成的醋。醋的量是通过内 标法制作标准曲线而算出的。关于利用GC测定的条件，除了使柱溫(参照表4)根据每个测定 对象醋适当变更W外，与实施例9同样。由于利用该柱时，与正下醇的峰分离不充分，因此丙 酸正下醋的定量按照实施例1记载的GC-MS分析条件(其中，溫度条件变更为80°C1分钟^ 1 〇°C /分钟^200°C 5分钟)通过绝对标准曲线法而实施。
[0237] [表 4]
[023引
[0239] 将结果示于表5。将甲基丙締酸下醋的比活性设为100%，W相对活性值来表示。
[0240] [表 5]
[0241]
[0242] *N.D.=检测不到、N.T.=未实施
[0243] [实施例11:来自罗马洋甘菊的AAT的最适抑]
[0244] 使用利用实施例9记载的MonoQ 5/50G〇i获得的纯化级分，评价最适抑。
[0245] 使用乙酸缓冲液、PIPES(赃嗦一 1，4-双(2-乙横酸））缓冲液、TriS (立径甲基氨 基甲烧）一盐酸缓冲液或甘氨酸一氨氧化钢缓冲液，调制组成为40mM正下醇及0.12mM甲基 丙締酷辅酶A的反应液。任一缓冲液中，缓冲液浓度均设为50mM。在各反应液中加入纯化级 分50化1，密闭，在30°C反应1小时。
[0246] 反应后，通过与实施例9同样的GC分析，测定通过酶反应而生成的甲基丙締酸下 醋。将结果示于图5。图中，圆形记号表示乙酸缓冲液的结果、四角形记号表示PIPES缓冲液 的结果、=角型记号表示=(=径基甲基氨基甲烧）一盐酸缓冲液的结果、菱形记号表示甘 氨酸一氨氧化钢缓冲液的结果。最适pH为8~9。
[0247] [实施例12:来自罗马洋甘菊的AAT的Km]
[0248] 使用利用实施例9记载的MonoQ 5/50化柱获得的纯化级分，测定对甲基丙締酷辅 酶A及乙酷辅酶A的Km值。在50mM化iS-HC1 (P册.5)缓冲液中加入纯化级分、40mM正己醇及 各浓度的甲基丙締酷辅酶A或乙酷辅酶A，调制50化1的反应液，密闭，在30°C反应2小时。
[0249] 反应后，通过与实施例10同样的GC分析，测定通过酶反应而生成的醋。将结果示于 图6。将速率常数化m)代入Michaelis-Menten式，使用皿LINKS公司制的KaleidaGra曲软件 进行计算。其结果是，计算出对甲基丙締酷辅酶A的Km值为0.041mM、对乙酷辅酶A的Km值为 0.711mM。
【主权项】
1. 一种甲基丙烯酸酯的制造方法，其含有如下工序:在来自以下植物的醇酰基转移酶 存在下，使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物是选自由属于 木犀属(Osmanthus)的植物、属于葡萄属(Vitis)的植物、属于柑橘属(Citrus)的植物、属于 植莲属(Durio)的植物、属于木兰属(Magnolia)的植物及属于果香菊属(Chamaemelum)的植 物组成的组中的植物。2. 一种甲基丙烯酸酯的制造方法，其含有如下工序:在来自下述植物的醇酰基转移酶 存在下，使醇或酚类作用于甲基丙烯酰辅酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物是选自金木 犀、葡萄、葡萄柚、榴莲、含笑及罗马洋甘菊组成的组中的植物。 3 · -种来自属于果香菊属（Chamaemelum)的植物的醇酰基转移酶或该酶的组合物，具 有以下的（1)~(5)的理化学性质， (1) 在醇或酚类的存在下，作用于甲基丙烯酰辅酶A而生成甲基丙烯酸酯， (2) 对甲基丙烯酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性， (3) 对异丁酰辅酶A的活性高于对乙酰辅酶A的活性， (4) 对甲基丙烯酰辅酶A的Km值为0.05mM以下， (5) 以甲基丙烯酰辅酶A及正丁醇为底物时，最适pH为8~9。4. 一种有机酸酯的制造方法，其使用权利要求3所述的醇酰基转移酶或该酶的组合物。
【文档编号】C12P7/62GK106062204SQ201580010994
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年3月5日
【发明人】浅野泰久, 佐藤荣治, 汤不二夫, 水无涉
【申请人】三菱丽阳株式会社