肾细胞癌的预后判定方法

肾细胞癌的预后判定方法
【专利摘要】本发明提供一种迅速、简便且高精度的癌预后判定方法。一种肾细胞癌患者的预后判定方法，包括以下工序：(1)将由受检者的肾脏组织制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐进行处理的工序；(2)将该被亚硫酸氢盐处理了的DNA通过PCR进行扩增的工序；(3)将得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序；(4)获得在该色谱中得到的检测信号的保留时间的工序；(5)工序(4)的结果比成为基准的保留时间早的情况下，将受检者的肾细胞癌判定为预后不良的工序。
【专利说明】
肾细胞癌的预后判定方法
技术领域
[0001] 本发明设及利用了甲基化DNA的检测的肾细胞癌的预后判定方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，人们清楚地意识到DNA的异常甲基化深度参与癌症化而受到关注。作为癌 细胞的特征性的表观遗传异常，已知有部分基因启动子区域中的CpG岛的异常的DNA甲基 化。CpG岛是介由憐酸二醋键(P)的胞喀晚(C)-鸟嚷岭(G)的二碱基序列高频出现的区域，大 多存在于基因上游的启动子区域。CpG岛的异常DNA甲基化通过抑癌基因的失活等来参与癌 变。在大肠癌、胃癌等中，已经报道了与临床病理学因素相关的CpG岛的DNA甲基化亢进(非 专利文献1~4)，运种类型的癌被称为CpG岛甲基化表型(CIMP)阳性癌。
[0003] 作为已经确立的甲基化DNA的解析方法，有利用了亚硫酸氨盐（重亚硫酸盐、酸式 亚硫酸盐、bisulfite)反应的方法。该方法是在甲基化DNA的解析中最通用的方法。当用亚 硫酸氨盐对单链DNA进行处理时，胞喀晚经经过横化、水解脱氨化、脱横化而被变换为尿喀 晚。另一方面，被甲基化的胞喀晚由于最初发生的横化的反应速度极为缓慢，因此，在实际 进行的亚硫酸氨盐处理的反应时间中，仍保持为甲基化胞喀晚。因此，如果使用亚硫酸氨盐 处理了的DNA进行PCR^olymerase化ain Reaction),则甲基化胞喀晚仍为胞喀晚，但未甲 基化胞喀晚从尿喀晚被置换为胸腺喀晚而被扩增。利用该PCR扩增产物的序列中产生的胞 喀晚与胸腺喀晚的碱基的差异，对甲基化状态进行解析。将其作为基本原理通用的方法是 专利文献1、非专利文献5中记载的Meth5dation-Specific PCR(MSP)法、W及非专利文献6、 7中记载的Combined Bisulfite Restriction Analysis(COBRA)法。
[0004] MSP法是如下方法，即，在DNA的亚硫酸氨盐处理后，依次进行使用了甲基化序列特 异性引物和未甲基化序列特异性引物的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，通过两个引物所致的扩 增产物的有无来判定对象区域的DNA甲基化状态。COBRA法是如下方法，即，在DNA的亚硫酸 氨盐处理后，依次进行使用了甲基化DNA和未甲基化DNA所共同的引物的PCR扩增、使用了识 别甲基化DNA和未甲基化DNA中序列不同的位置的限制性内切酶的处理、琼脂糖凝胶电泳， 通过限制性内切酶处理片段的有无来判定对象区域的DNA甲基化状态。两种方法从在无需 特殊装置下能够进行甲基化DNA的定量解析的方面来看均是目前广泛使用的甲基化DNA解 析方法，但是存在对于解析中利用电泳法运点需要花费劳动和时间的课题。
[0005] 另一方面，在生物化学、医学等领域的核酸、蛋白质、多糖类等生物体高分子的分 离分析中，作为能够简便且短时间精度良好地检测的方法，通用的是离子交换色谱。使用离 子交换色谱对核酸的PCR扩增产物进行分离的情况下，一般而言，使用利用核酸分子中所含 的憐酸的负电荷进行分离的阴离子交换色谱。填充有具有阳离子性官能团作为离子交换基 团的色谱柱填充剂的阴离子交换色谱用色谱柱已经上市销售，并在各种研究领域中使用。
[0006] 此外，已经报道了通过使用了填充有具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团二者 作为阳离子性官能团的色谱柱填充剂的色谱柱的离子交换色谱，能够对20mer的未甲基化 合成寡核巧酸间的单个碱基的差异进行分离分析(专利文献2)。
[0007] 肾细胞癌(Renal Cell化;rcinoma:RCC)常发生于属于劳动人口的壮年期，大部分 是利用肾摘除术得到根治的病例人群，相反地，也明显存在迅速远距离转移的病例人群，两 者的临床过程有很大差异。此外，已知即使转移也有免疫疗法?分子祀向治疗药等成功的 病例。复发可能性高的病例如果经过密切观察早期诊断复发，并追加后续疗法则有能够改 善预后的可能性。但是，接触过虽然属于病理组织学上为低非典型度且作为最常见组织类 型的透明细胞型RCC但迅速远距离转移的病例，基于现有的临床病理学因素等的预后预测 是困难的。
[000引通过基于MSP法、COBRA法W及细菌人工染色体(BAC)阵列的甲基化CpG岛扩增法 (BAMCA法)进行解析，显示出从RCC患者得到的非癌肾皮质组织已经处于与DNA甲基化状态 的变化相关的前癌阶段(专利文献3和非专利文献8~11)。进而，通过基于BAMCA法的全基因 组的解析，也可明确处于前癌阶段的非癌肾皮质组织的DNA甲基化的变化来自于同一患者 的相应的RCC，成功开发出预测RCC病例的预后的方法(专利文献3和非专利文献10)。
[0009] 最近，可判明恶性度高的RCC显示CIMP阳性表型，W及FAM150A、GRM6、ZW540、 ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、K皿RBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、WNT3A、T畑、FAM78A、ZNF6 71、 SLC13A5和NKX6-2的17种基因的CpG位点的甲基化为RCC的CIMP的特征(专利文献4)。专利文 献4中，提出了如下方法，即，利用微珠阵列法，质量分析(MassARRAY法）、焦憐酸测序、甲基 化敏感性高分辨率烙解曲线分析、定量PCR、亚硫酸氨盐处理物的直接测序、COBRA法等，对 上述17种基因的CpG位点的甲基化水平进行检测，由此来检测RCC的预后不良风险。用W往 使用的MassARRAY法、焦憐酸测序等方法得到的DNA甲基化率的值可得到作为供于测定的试 样全体的平均值的DNA甲基化率。因此，在试样中DNA甲基化率低的细胞量多的情况下，即使 混合存在具有高度甲基化DNA的细胞，得到的DNA甲基化率的值也变低。作为结果，存在W下 问题:无法判定有无具有高度甲基化DNA的细胞，进而不能避免过低估计DNA甲基化率的风 险。
[0010] 现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1:美国专利第5786146号公报
[0013] 专利文献2:国际公开公报第2012/108516号
[0014] 专利文献3:日本特开2010-63413号公报 [0015] 专利文献4:国际公开公报第2013/062650号
[0016] 非专利文献
[0017] 非专利文献 1: Nat. Rev. Cancer，4，988-993( 2004)
[001 引 非专利文献2: Proc. Natl. Acad. Sci . USA，96，8681-8686( 1999)
[0019] 非专利文献 3 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104,18654-18659(2007)
[0020] 非专利文献4:Cancer Res. ,59,5438-5442(1999)
[0021] 非专利文献 5 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,9821-9826( 1996)
[0022] 非专利文献6:Nucleic Acids Res. ,24,5058-5059(1996)
[0023] 非专利文献7:Nucleic Acids Res. ,25,2532-2534(1997)
[0024] 非专利文献8:Clin.Cancer Res. ,14,5531-5539(2008)
[00巧]非专利文献9: Int. J. Cancer，119，288-296(2006)
[0026] 非专利文献 10: Carcinogenesis，30，214-221 (2009)
[0027] 非专利文献 ll:Pathobiology，78，l-9(2011)

【发明内容】

[0028] 为了防止癌症的复发，优选通过获得基因组DNA的甲基化状态的信息，从而特异性 高地判定复发风险来开始治疗。如果能够预测并早期发现癌的转移?复发，则对其可期待 免疫疗法或分子祀向治疗药等的奏效，所W，正在寻求一种能够进行更准确的癌预后诊断 的方法。进而，寻求一种用于准确的癌预后诊断的迅速且简便的方法。
[0029] 本发明人等发现通过用PCR对经亚硫酸氨盐处理的DNA进行扩增，将由此得到的 PCR扩增产物利用离子交换色谱进行分离，从而能够迅速且简便地检测甲基化DNA。进而，本 发明人等发现，利用离子交换色谱得到的信号的图案在由CIMP阳性癌得到的DNA和由CIMP 阴性癌得到的DNA之间是不同的，并且通过对该图案的不同进行解析，能够判定预后不良的 癌，从而完成本发明。
[0030] 本发明提供W下内容。
[0031] 〔1)一种含有肾细胞癌的组织的判定方法，包括W下工序：
[0032] (1)将由受检者的肾脏组织制备的基因组DNA用亚硫酸氨盐进行处理的工序；
[0033] (2)将该用亚硫酸氨盐处理了的DNA通过PCR进行扩增的的工序；
[0034] (3)将得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序；
[0035] (4)获得在该色谱中得到的检测信号的保留时间的工序；
[0036] (5)在工序(4)的结果早于成为基准的保留时间的情况下，判定该组织为从预后不 良的肾细胞癌患者得到的含有肾细胞癌的组织的工序。
[0037] 〔2)-种用于判定含有肾细胞癌的组织的数据的获得方法，包括W下工序：
[0038] (1)将由受检者的肾脏组织制备的基因组DNA用亚硫酸氨盐进行处理的工序；
[0039] (2)将该用亚硫酸氨盐处理了的DNA通过PCR进行扩增的的工序；
[0040] (3)将得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序；
[0041] (4)获得在该色谱中得到的检测信号的保留时间的工序；
[0042] (5)取得W下数据的工序，即，将工序(4)的结果是否早于成为基准的保留时间作 为用于判定该组织是否为从预后不良的肾细胞癌患者得到的含有肾细胞癌的组织的数据。
[0043] 〔3)-种肾细胞癌患者的预后判定方法，包括W下工序：
[0044] (1)将由受检者的肾脏组织制备的基因组DNA用亚硫酸氨盐进行处理的工序；
[0045] (2)将该用亚硫酸氨盐处理了的DNA通过PCR进行扩增的的工序；
[0046] (3)将得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序；
[0047] (4)获得在该色谱中得到的检测信号的保留时间的工序；
[0048] (5)在工序(4)的结果早于成为基准的保留时间的情况下，将该受检者的肾细胞癌 判定为预后不良的工序。
[0049] 〔 4)根据〔1)~〔3)中任一项记载的方法，上述工序(2)中，被PCR扩增的DNA含有选 自FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、 WNT3A、T畑、FAM78A、ZNF671、化Cl 3A5 W 及 NKX6-2 中的至少一个基因的 CpG 岛。
[0050] 〔5)根据〔1)~〔3)中任一项记载的方法，上述工序（2)中，被PCR扩增的DNA含有 FAMl 50A基因启动子区域。
[0051] 〔6)根据〔1)~〔3)中任一项记载的方法，上述工序(2)的PCR中，使用由序列号51和 52表示的PCR引物。
[0化2] 〔7)根据〔1)~〔6)中任一项记载的方法，在上述工序(4)之间，进一步包括W下工 序：
[0053] (r)将与由上述受检者的肾脏组织制备的基因组DNA的PCR扩增区域相当的未甲 基化的DNA用亚硫酸氨盐进行处理的工序；
[0054] (2'）将工序（1'）中得到的被亚硫酸氨盐处理过的DNA通过PCR进行扩增的工序；
[0055] (3'）将工序(2'）中得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序；
[0056] (3a)从工序(3)的色谱所得到的检测信号减去工序(3'）的色谱所得到的检测信号 而得到差值数据的工序。
[0057] 本发明提供一种迅速、简便且高精度的癌预后判定方法。根据本发明，能够更迅 速、简便且高精度判定癌患者的复发风险，因此，能够对必须进行治疗的癌患者重新进行早 期治疗。因此，本发明对癌患者的生存率的提高有贡献。
【附图说明】
[0化引图1是DNA甲基化率所致的色谱洗脱时间的变动。A: DNA甲基化率的不同DNA(0 %、 25%、50%、75%、100% )的色谱图，B:DNA甲基化位置不同的50%甲基化DNA(随机、5'端附 近、3'端附近、中央)的色谱图。
[0059] 图2是DNA甲基化率与色谱保留时间的相关性。
[0060] 图3是CIMP阳性和阴性试样的色谱。A、B: CIMP阳性试样，C、D: CIMP阴性试样。
[0061 ]图4是CIMP阳性和阴性试样的色谱保留时间。
[0062] 图5-1是MassARRAY法和本发明所得到的DNA甲基化率的比较。
[0063] 图5-2是MassARRAY法和本发明所得到的DNA甲基化率的比较。
【具体实施方式】
[0064] 本说明书中，"肾细胞癌"是指肾脏的肾小管上皮细胞被癌化的癌，是根据其病理 学的特征被分类为透明细胞型、颗粒细胞型、嫌色细胞型、纺键型、囊肿相关型、囊肿派生 型、囊肿性型、乳头状型的癌。另外，本说明书中，作为"受检者"，例如，可举出患有肾细胞癌 的患者或者疑似患病的患者、通过外科手术等实施了肾细胞癌的治疗的患者。
[0065] 本说明书中，癌的"预后不良"是指例如可举出受检者的预后（治疗后）的生存率 低，更具体而言，可举出术后经过500天后的无复发生存率(无癌生存率)为50% W下，或者， 可举出术后经过1500天后的总生存率(全体的生存率)为70% W下。
[0066] 本说明书中，"DNA甲基化"是指在DNA中，胞喀晚的5位的碳被甲基化的状态。另外， 本说明书中，DNA的"甲基化的检测"是指测定该DNA中有无存在甲基化DNA或存在量、存在量 之比、或者该DNA的甲基化率。本说明书中，"DNA甲基化率"是指在作为检测对象的特定DNA 中CpG岛的胞喀晚被甲基化的比例，例如W作为检测对象的特定DNA的CpG岛中的、甲基化胞 喀晚数相对于胞喀晚总数（甲基化胞喀晚和未甲基化胞喀晚）的比率表示。
[0067] 本说明书中，"CpG位点"是指，在DNA中胞喀晚(C)与鸟嚷岭(G)之间进行憐酸二醋 键合(P)的部位。另外，本说明书中，CpG岛是指介由憐酸二醋键(p)的胞喀晚(C)-鸟嚷岭(G) 的二碱基序列高频出现的区域。CpG岛大多存在于基因上游的启动子区域。本说明书中， "(某一)基因的CpG位点或CpG岛"是指存在于接近该基因的编码区域的位置的CpG岛、或者 该CpG岛所含的CpG位点，优选是指存在于该基因的启动子区域的CpG位点或者CpG岛。特定 的基因的CpG位点或者CpG岛可W基于MassARRAY法、焦憐酸测序等方法进行确定。
[006引本说明书中，"成为基准的保留时间"（W下，也称为基准保留时间）表示，能够区分 CIMP阳性组和CIMP阴性组的HPLC保留时间，或者表示针对来自由肾细胞癌制备的基因组 DNA的检测信号而言能够区分来自高度甲基化的DNA的信号组和来自甲基化程度低的DNA的 信号组的HPLC保留时间。即，由于在比成为基准的保留时间（基准保留时间）早的保留时间 能够检测出来自高度甲基化的DNA的信号，所W在比基准保留时间早的保留时间具有检测 信号的样本能够判定为预后不良。上述基准保留时间根据HPLC的分析条件、基因组DNA的区 域、或者基因标志物的种类等而色谱发生变化，因此，根据运些条件等设定适当的基准保留 时间即可。另外，优选还考虑必要的临床灵敏度来设定基准保留时间。
[0069] 在一个实施方式中，本发明提供一种包括W下工序的含有肾细胞癌的组织的判定 方法。
[0070] (1)将由受检者的肾脏组织制备的基因组DNA用亚硫酸氨盐进行处理的工序；
[0071] (2)将该用亚硫酸氨盐处理了的DNA通过PCR进行扩增的工序；
[0072] (3)将得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序；
[0073] (4)获得在该色谱中得到的检测信号的保留时间的工序；
[0074] (5)在工序(4)的结果早于成为基准的保留时间的情况下，判定该组织为从预后不 良的肾细胞癌患者得到的含有肾细胞癌的组织的工序。
[0075] 在另一实施方式中，本发明提供一种包含W下工序的获得用于判定含有肾细胞癌 的组织的数据的方法。
[0076] (1)将由受检者的肾脏组织制备的基因组DNA用亚硫酸氨盐进行处理的工序；
[0077] (2)将该用亚硫酸氨盐处理了的DNA通过PCR进行扩增的工序；
[007引（3)将得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序；
[0079] (4)获得在该色谱中得到的检测信号的保留时间的工序；
[0080] (5)取得W下数据的工序，即，将工序(4)的结果是否早于成为基准的保留时间作 为用于判定该组织是否为从预后不良的肾细胞癌患者得到的含有肾细胞癌的组织的数据。
[0081] 在另一实施方式中，本发明提供包含W下工序的肾细胞癌患者的预后判定方法。
[0082] (1)将由受检者的肾脏组织制备的基因组DNA用亚硫酸氨盐进行处理的工序；
[0083] (2)将该用亚硫酸氨盐处理了的DNA通过PCR进行扩增的工序；
[0084] (3)将得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序；
[0085] (4)获得在该色谱中得到的检测信号的保留时间的工序；
[0086] (5)在工序(4)的结果早于成为基准的保留时间的情况下，将受检者的肾细胞癌判 定为预后不良的工序。
[0087] 在另一实施方式中，本发明提供在上述工序(4)前进一步进行W下工序的含有肾 细胞癌的组织或者肾细胞癌患者的判定方法。
[00则 （r)将与由上述受检者的肾脏组织制备的基因组DNA的PCR扩增区域相当的未甲 基化的DM用亚硫酸氨盐进行处理的工序；
[0089] (2'）将在工序（1'）中得到的用亚硫酸氨盐处理了的DNA通过PCR进行扩增的工序；
[0090] (3'）将工序(2'）中得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序；
[0091] (3a)用工序(3)的色谱所得到的检测信号减去工序(3'）的色谱所得到的检测信号 而得到差值数据的工序。
[0092] 作为受检者的肾脏组织，只要是含有DNA的肾脏组织或者其细胞即可，例如，可举 出在活检、外科手术等中采集的组织、及其冷冻物或固定化标本。从抑制基因组DNA的分解 等、更高效地进行DNA甲基化检测的观点考虑，优选使用冷冻的肾脏组织。
[0093] 作为从上述肾脏组织或细胞制备样品DNA的方法，没有特别限制，可适当地选择使 用公知的方法。作为制备DNA的公知方法，可举出酪氯仿法或者使用市售的DNA提取试剂盒、 例如后述的QIAamp DNA Mini kit(Qiagen公司制）、Clean Columns(NexTec公司制）、 Aqua化re(Bi〇-Rad公司制）、ZR Plant/Seed DNA Kit(Zymo Research公司制）、prepGEM (ZyGEM公司制）、Buccal如ick(T;rimGen公司制）的DNA提取方法等。
[0094] 接着，用亚硫酸氨盐对提取的样品DNA进行处理。作为DNA的亚硫酸氨盐处理的方 法，没有特别限制，可适当选择使用公知的方法。作为用于亚硫酸氨盐处理的公知方法，例 如，可举出使用后述的化 iTect Bisulfite Kit(48) (Qiagen 公司制）、Methy 化 asy(Human Genetic Signatures Pty公司制）、Cells-t〇-CpG Bisulfite Conversion Kit(Applied Biosystems公司制）、CpGenome Turbo Bisulfite Modification Kit(MERCK MILLIPORE公 司制)等市售试剂盒的方法。
[0095] 接着，将用亚硫酸氨盐处理了的样品DNA通过PCR进行扩增。作为PCR扩增的方法， 没有特别限制，可根据扩增对象的DNA的序列、长度、量等适当选择使用公知的方法。
[0096] 关于肾细胞癌，已报到了 17种基因（FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、 PC畑AC1、KHDRBS2、AS化2、KCNQ1、PRAC、WNT3A、T畑、FAM78A、ZNF671、化C13A5 U 及NKX6-2)中 的DNA甲基化与肾细胞癌的预后不良（CIMP阳性)相关（专利文献4)。因此，在本发明的方法 中，被PCR扩增的祀DNA优选W能够检测选自上述17种基因中的至少一个基因的CpG岛的DNA 甲基化而进行选择，更优选W能够检测上述17种基因的CpG位点的甲基化来进行选择。例 如，祀DNA是编码上述17种基因中任一种基因的编码区域和/或启动子区域的一部分或全部 的DNA。优选是编码上述17种基因中任一种基因的启动子区域的一部分或全部的DNA。更优 选是编码上述17种基因中任一种基因的CpG岛的一部分或者全部的DNA。
[0097] FAM150A是对由RefSeq ID:NP_997296标识的蛋白质进行编码的基因，GRM6是对 由Ref Seq ID:NP_000834标识的蛋白质进行编码的基因，ZNF540是对由Ref Seq ID:NP_ 689819标识的蛋白质进行编码的基因，ZFP42是对由RefSeq ID:NP_777560标识的蛋白质 进行编码的基因，ZNF154是对由RefSeq ID:NP_001078853标识的蛋白质进行编码的基因， RIMS4是对由RefSeq ID:NP_892015标识的蛋白质进行编码的基因，PCDHAC1是对由Ref Seq ID:NP_061721标识的蛋白质进行编码的基因，K皿RBS2是对由RefSeq ID:NP_689901标识 的蛋白质进行编码的基因，ASCL2是对由Ref Seq ID: NP_005161标识的蛋白质进行编码的 基因，KCNQ1是对由RefSeq ID :NP_000209标识的蛋白质进行编码的基因，PRAC是对由 RefSeq ID: NP_115767标识的蛋白质进行编码的基因，WNT3A是对由Ref Seq ID: NP_ 149122标识的蛋白质进行编码的基因，T畑是对由Ref Seq ID: NP_009048标识的蛋白质进 行编码的基因，FAM78A是对由RefSeq ID:NP_203745标识的蛋白质进行编码的基因， ZNF671是对由RefSeq ID:NP_079109标识的蛋白质进行编码的基因，SLC13A5是对由 RefSeq ID:NP_808218标识的蛋白质进行编码的基因，NKX6-2是对由RefSeq ID:NP_ 796374标识的蛋白质进行编码的基因。
[0098] 上述17种基因的CpG位点，W基准人类基因组序列即NCBI数据库Genome Build 37 上的位置为基准，位于表1~4中记载的染色体上的位置。
[0099] 表 1
[0100]
[0101]表 2
[0102]
[0103]表3
[0106]
[0107] 在专利文献4中记载的CIMP判定中，作为DNA甲基化的检测对象所优选的CpG位点， 是基准人类基因组序列即NCBI数据库Genome Build 37上的位置为选自第8染色体53、478、 454位，第5染色体178、422、244位，第19染色体38、042、472位，第4染色体188、916、867位，第 19染色体58、220、662位，第20染色体43、438、865位，第5染色体140、306、458位，第6染色体 62、995、963位，第 11 染色体 2、292、004位，第 11 染色体 2、466、409位，第 17 染色体 46、799、640 位，第19染色体58、220、494位，第1染色体228、194、448位，第3染色体129、693、613位，第9染 色体134、152、531位，第19染色体58、238、928位，第17染色体6、617、030位^及第10染色体 134、599、860位中的至少1个的CpG位点。
[0108] PCR扩增产物的链长可W在考虑PCR的扩增时间的缩短W及离子交换色谱中的分 析时间的缩短、分离性能的维持等要素的基础上进行适当选择。例如，使用CpG岛多的样品 DNA时的PCR扩增产物的链长优选为lOOObpW下，更优选为70化pW下，进一步优选为500bp W下。另一方面，使用CpG岛少的样品DM时的PCR扩增产物的链长，下限为使用避免PCR中的 非特异性杂交的15mer附近的引物时的PCR扩增产物的链长即30~40bp。另一方面，优选W CpG岛的含有率变得丰富的方式设计引物。例如，CpG位点的胞喀晚相对于PCR扩增产物的链 长，优选含有2 % W上，更优选含有5 % W上。
[0109] 接着，将得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱。本发明中进行的离子交换色谱优 选为阴离子交换色谱。作为在本发明中进行的离子交换色谱所使用的色谱柱的填充剂，只 要是在表面具有强阳离子性基团的基材粒子，就没有特别限定，但优选专利文献2中示出的 在填充剂表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团运两种基团的基材粒子。
[0110] 本说明书中，上述强阳离子性基团是指在pH为1~14的宽范围内解离的阳离子性 基团。即，上述强阳离子性基团不受水溶液的抑的影响而保持解离（阳离子化)状态。
[0111] 作为上述强阳离子性基团，可举出季锭基团。具体而言，例如，可举出S甲基锭基、 =乙基锭基、二甲基乙基锭基等=烷基锭基等。另外，作为上述强阳离子性基团的反离子， 例如，可举出氯化物离子、漠化物离子、舰化物离子等面化物离子。
[0112] 导入至上述基材粒子表面的上述强阳离子性基团量，没有特别限定，相对于填充 剂的干燥重量的优选下限为化eq/g，优选上限为50化eq/g。上述强阳离子性基团量如果小 于化eq/g，则保持力弱且分离性能变差。上述强阳离子性基团量如果超过50化eq/g，会产生 保持力变得过强而不容易将PCR扩增产物洗脱，分析时间变得过长等问题。
[0113] 本说明书中，上述弱阳离子性基团是指pfoi为8W上的阳离子性基团。即，上述弱阳 离子性基团受到水溶液的抑的影响，解离状态发生变化。即，如果抑变得比8高，则上述弱阳 离子性基团的质子解离，不具有正电荷的比例增加。相反，如果抑变得比8低，上则述弱阳离 子性基团质子化，具有正电荷的比例增加。
[0114] 作为上述弱阳离子性基团，例如，可举出叔氨基、仲氨基、伯氨基等。其中，优选为 叔氨基。
[0115] 导入至上述基材粒子表面的上述弱阳离子性基团量，没有特别限定，相对于填充 剂的干燥重量的优选下限优选为0.扣eq/g，优选上限为50化eq/g。上述弱阳离子性基团量 如果小于0.扣eq/g，则过少有时分离性能没有提高。上述弱阳离子性基团量如果超过50化 eq/g，则与强阳离子性基团同样产生保持力过强，不容易将PCR扩增产物洗脱，分析时间变 得过长等问题。
[0116] 上述基材粒子表面的强阳离子性基团或弱阳离子性基团量，通过将氨基所含的氮 原子定量进行测定。作为对氮进行定量的方法，例如可举出凯氏定氮法。在本发明（实施例） 记载的填充剂的情况下，首先，将聚合后强阳离子性基团所含的氮定量，接着，通过将导入 弱阳离子性基团后的强阳离子性基团和弱阳离子性基团中含有的氮定量，能够算出之后导 入的弱阳离子性基团量。通过运样进行定量，制备填充剂时，能够将强阳离子性基团量和弱 阳离子性基团量调整在上述范围内。
[0117] 作为上述基材粒子，例如，可使用利用聚合性单体等得到的合成高分子微粒、二氧 化娃系等无机微粒等，但优选由合成有机高分子构成的疏水性交联聚合物粒子。
[0118] 上述疏水性交联聚合物，可W是将至少巧巾疏水性交联单体与至少巧巾具有反应性 官能团的单体共聚而得的疏水性交联聚合物、将至少1种疏水性交联单体和至少1种具有反 应性官能团的单体W及至少1种疏水性交联单体共聚而得的疏水性交联聚合物中的任一 个。
[0119] 作为上述疏水性交联性单体，只要是在1分子单体中具有2个W上乙締基的单体， 就没有特别限定，例如，可举出乙二醇二（甲基）丙締酸醋、聚乙二醇二（甲基）丙締酸醋、丙 二醇二（甲基）丙締酸醋、聚丙二醇二（甲基）丙締酸醋等二（甲基）丙締酸醋、S径甲基甲烧 立（甲基)丙締酸醋、四径甲基甲烧立（甲基)丙締酸醋等立（甲基)丙締酸醋或四（甲基)丙締 酸醋、或者二乙締基苯、二乙締基甲苯、二乙締基二甲苯、二乙締基糞等芳香族系化合物。应 予说明，本说明书中，上述（甲基)丙締酸醋是指丙締酸醋或甲基丙締酸醋，（甲基)丙締酷基 是指丙締酷基或甲基丙締酷基。
[0120] 作为上述具有反应性官能团的单体，可举出缩水甘油基（甲基）丙締酸醋、异氯酸 醋乙基（甲基)丙締酸醋等。
[0121] 作为上述疏水性非交联性单体，只要是具有疏水性的性质的非交联性的聚合性有 机单体，就没有特别限定，例如，可举出（甲基)丙締酸甲醋、（甲基)丙締酸乙醋、（甲基)丙締 酸下醋、（甲基)丙締酸叔下醋等（甲基)丙締酸醋、苯乙締、甲基苯乙締等苯乙締系单体。
[0122] 当上述疏水性交联聚合物是将上述疏水性交联性单体和上述具有反应性官能团 的单体共聚而得到的聚合物的情况下，上述疏水性交联聚合物中的来自于上述疏水性交联 性单体的片段的含有比例的优选下限为10重量％，更优选下限为20重量％。
[0123] 本发明的离子交换色谱用填充剂优选是在上述基材粒子的表面具有聚合物层的 填充剂，该聚合物层具有上述强阳离子性基团和上述弱阳离子性基团。另外，在具有上述强 阳离子性基团和上述弱阳离子性基团的聚合物中，上述强阳离子性基团和上述弱阳离子性 基团优选分别来自于独立的单体。具体而言，本发明的离子交换色谱用填充剂，优选是在由 上述疏水性交联聚合物粒子和共聚于上述疏水性交联聚合物粒子表面的具有强阳离子性 基团的亲水性聚合物的层构成的被覆聚合物粒子的表面导入弱阳离子性基团而成的填充 剂。
[0124] 上述具有强阳离子性基团的亲水性聚合物是由具有强阳离子性基团的亲水性单 体构成的聚合物，含有来自于1种W上具有强阳离子性基团的亲水性单体的片段即可。即， 作为制造上述具有强阳离子性基团的亲水性聚合物的方法，可举出将具有强阳离子性基团 的亲水性单体均聚的方法、使巧巾W上的具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法、使 具有强阳离子性基团的亲水性单体和不具有强阳离子性基团的亲水性单体共聚的方法等。
[0125] 作为上述具有强阳离子性基团的亲水性单体，优选为具有季锭基团的单体。具体 而言，例如，可举出甲基丙締酷氧乙基=乙基氯化锭、甲基丙締酷氧乙基二甲基乙基氯化 锭、甲基丙締酷氧乙基二甲基苄基氯化锭、丙締酷氧乙基二甲基苄基氯化锭、丙締酷氧乙基 =乙基氯化锭、丙締酷氧乙基二甲基乙基氯化锭、丙締酷胺乙基=甲基氯化锭、丙締酷胺乙 基=乙基氯化锭、丙締酷胺乙基二甲基乙基氯化锭等。
[0126] 作为在上述被覆聚合物粒子的表面导入上述弱阳离子性基团的方法，可使用公知 的方法。具体而言，例如作为将叔氨基作为上述弱阳离子性基团进行导入的方法，可举出如 下方法，即，将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体在由含有来自于具有缩水甘油基的 单体的片段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面进行共聚，接着，使 具有叔氨基的试剂与缩水甘油基反应的方法;将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体在 由具备来自于具有异氯酸醋基的单体的片段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合 物粒子的表面进行共聚，接着，使具有叔氨基的试剂与异氯酸醋基反应的方法;使上述具有 强阳离子性基团的亲水性单体和具有叔氨基的单体在上述疏水性交联聚合物粒子的表面 共聚的方法;使用具有叔氨基的硅烷偶联剂，在具备上述具有强阳离子性基团的亲水性聚 合物的层的被覆聚合物粒子的表面导入叔氨基的方法;将上述具有强阳离子性基团的亲水 性单体在由具备来自于具有簇基的单体的片段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚 合物粒子的表面进行共聚，接着，使用碳二亚胺使簇基和具有叔氨基的试剂缩合的方法;将 上述具有强阳离子性基团的亲水性单体在由含有来自于具有醋键的单体的片段的疏水性 交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面进行共聚，将醋键部分水解后，接着，使用 碳二亚胺使通过水解生成的簇基和具有叔氨基的试剂缩合的方法等。其中，优选如下方法， 即，将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体在由含有来自于具有缩水甘油基的单体的片 段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的表面进行共聚，接着，使具有叔氨 基的试剂与缩水甘油基反应的方法;将上述具有强阳离子性基团的亲水性单体在由含有来 自于具有异氯酸醋基的单体的片段的疏水性交联聚合物构成的疏水性交联聚合物粒子的 表面进行共聚，接着，使具有叔氨基的试剂与异氯酸醋基反应的方法。
[0127] 作为与缩水甘油基或异氯酸醋基等反应性官能团反应的上述具有叔氨基的试剂， 只要是具有叔氨基和能够与反应性官能团反应的官能团的试剂，就没有特别限定。作为上 述叔氨基和能够与反应性官能团反应的官能团，例如，可举出伯氨基、径基等。其中，优选在 末端具有伯氨基的基团。作为具有该官能团的具体试剂，可举出N，N-二甲基氨基甲胺、N，N- 二甲基氨基乙胺、N，N-二甲基氨基丙胺、N，N-二甲基氨基下胺、N，N-二乙基氨基乙胺、N，N- 二乙基氨基丙基乙胺、N，N-二乙基氨基下胺、N，N-二乙基氨基戊胺、N，N-二乙基氨基己胺、 N,N-二丙基氨基下胺、N,N-二下基氨基丙胺等。
[0128] 上述强阳离子性基团优选为季锭盐与上述弱阳离子性基团优选为叔氨基的相对 位置关系，优选为上述强阳离子性基团位于与上述弱阳离子性基团相比距离基材粒子的表 面远的位置，即位于外侧。例如，优选上述弱阳离子性基团位于距离基材粒子表面3CL4W 内，上述强阳离子性基团位于距离基材粒子表面30化4 W内且与弱阳离子性基团相比位于 外侧。
[0129] 本发明的离子交换色谱用填充剂所使用的上述基材粒子的平均粒径没有特别限 定，优选下限为O.lwn，优选上限为20WI1。如果上述平均粒径小于O.Uim，则色谱柱内变为过 度高压，有时引起分离不良。如果上述平均粒径超过20WI1，则色谱柱内的无效体积变得过 大，有时引起分离不良。应予说明，本说明书中，上述平均粒径表示体积平均粒径，可使用粒 度分布测定装置(Ac州Sizer780/化；rticle Sizing Systems公司制等)进行测定。
[0130] 作为本发明中进行的离子交换色谱所使用的洗脱液的组成，可使用公知的条件。
[0131] 作为上述洗脱液所使用的缓冲液，优选使用公知的含有盐化合物的缓冲液类、有 机溶剂类，具体而言，例如，可举出Tris盐酸缓冲液，由Tris和抓TA构成的TE缓冲液，由 Tris、棚酸W及邸TA构成的TBA缓冲液等。
[0132] 上述洗脱液的抑没有特别限定，但优选下限为5,优选上限为10。认为通过设定在 该范围，上述弱阳离子性基团作为离子交换基团（阴离子交换基团）也能够有效地发挥作 用。上述洗脱液的抑的更优选下限为6，更优选上限为9。
[0133] 作为上述洗脱液所含有的盐，例如，可使用氯化钢、氯化钟、漠化钢、漠化钟等由面 化物和碱金属构成的盐;氯化巧、漠化巧、氯化儀、漠化儀等由面化物和碱±类金属构成的 盐;高氯酸钢、高氯酸钟、硫酸钢、硫酸钟、硫酸锭、硝酸钢、硝酸钟等无机酸盐等。另外，还可 使用乙酸钢、乙酸钟、班巧酸钢、班巧酸钟等有机酸盐。上述盐可W任一个可单独使用或组 合使用。
[0134] 作为上述洗脱液的盐浓度，根据分析条件适当地调整即可，优选下限为lOmmol/L， 优选上限为2000mmol/L，更优选下限为lOOmmol/L，更优选上限为1500mmol/L。
[0135] 进而，为了进一步提高分离性能，在本发明的离子交换色谱所使用的洗脱液中可 含有反离液离子。反离液离子具有与离液离子相反的性质，具有使水合结构稳定化的作用。 因此，具有增强填充剂与核酸分子之间的疏水性相互作用的效果。本发明的离子交换色谱 的主要相互作用是静电相互作用，除此之外，通过也利用疏水性相互作用的作用，分离性能 提局。
[0136] 作为上述洗脱液所含有的反离液离子，可举出憐酸根离子(P0431、硫酸根离子 (S0421、锭根离子(畑4+)、钟离子化+)、钢离子(化+)等。在运些离子的组合中，可优选使用硫 酸根离子和锭根离子。上述反离液离子，可W任一种单独使用或组合使用。应予说明，上述 反离液离子的一部分含有上述洗脱液所含的盐、缓冲液的成分。使用运样的成分时，由于具 备作为洗脱液所含的盐的性质或缓冲性能、和作为反离液离子的性质运两者，因此，适于本 发明。
[0137] 本发明的离子交换色谱用洗脱液中的反离液离子的分析时的浓度，根据分析对象 物进行适当地调整即可，但优选W反离液盐计为2000mmol/LW下。具体而言，可举出使反离 液盐的浓度在0~2000mmo 1/L的范围进行梯度洗脱的方法。因此，分析开始时的反离液盐的 浓度无需为Ommol/L，并且，分析结束时的反离液盐的浓度也无需为2000mmol/L。上述梯度 洗脱的方法可W为低压梯度法，也可W为高压梯度法，但优选一边进行利用高压梯度法的 精密浓度调整，一边洗脱的方法。
[0138] 上述反离液离子可W仅添加到用于洗脱的洗脱液中的1种中，也可W添加到多种 洗脱液中。另外，上述反离液离子也可W具备如下两个作用：增强填充剂与PCR扩增产物之 间的疏水性相互作用的效果或缓冲性能，W及使PCR扩增产物从色谱柱中洗脱的效果。
[0139] 本发明中进行的离子交换色谱中，分析PCR扩增产物时的柱溫优选为3(TCW上，更 优选为40°CW上，进一步优选为45°CW上。离子交换色谱的柱溫如果小于30°C，则填充剂与 PCR扩增产物之间的疏水性相互作用减弱，很难得到所希望的分离效果。离子交换色谱的柱 溫小于45°C的情况下，甲基化DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产物（甲基化DNA样品）与 未甲基化DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产物(未甲基化DNA样品）的保留时间之差小。 进而，柱溫如果为60°CW上，则甲基化DNA样品与未甲基化DNA样品之间的保留时间之差进 一步扩大，并且各个峰也变得更清晰，所W，能够更加精度良好地进行DNA的甲基化的检测。
[0140] 进而，离子交换色谱的柱溫如果增高，则甲基化DNA样品与未甲基化DNA样品明显 被分离，所W，根据样品DNA中的甲基化DNA与未甲基化DNA的存在比率，两者的保留时间的 峰面积或峰高度容易产生差异。因此，如果提高柱溫，则基于甲基化DNA样品与未甲基化DNA 样品之间的保留时间的峰的面积或高度来测定样品DNA中的甲基化DNA和未甲基化DNA各自 的存在量或存在比率变得更加容易。
[0141] 另一方面，离子交换色谱的柱溫如果为90°CW上，则由于PCR扩增产物中的核酸分 子的双链解离，因此，在分析上不优选。进而，柱溫如果为i〇〇°cw上，则有时可能发生洗脱 液沸腾，因此，在分析上不优选。因此，用在本发明中进行的离子交换色谱来分析PCR扩增产 物时的柱溫为30°C W上且小于90°C即可，优选为40°C W上且小于90°C，更优选为45°C W上 且小于90°C，进一步优选为55°C W上且小于90°C，更进一步优选为55°C~85°C，进而优选为 60°C~85°C。
[0142] 对上述离子交换色谱色谱柱的试样注入量没有特别限定，根据色谱柱的离子交换 容量和试样浓度适当地调整即可。流速优选为0.1血/min~3. OmL/min，更优选为0.5mL/min ~1.5mL/min。如果流速变慢，则可期待分离的提高，但如果变得过慢，则分析需要长时间， 或者可能导致因峰的展宽化引起的分离性能的降低。相反，如果流速变快，则在分析时间的 缩短方面有优势，但由于峰被压缩而导致分离性能降低。由此，虽然是根据色谱柱的性能适 当地调整的参数，但优选设定在上述流速的范围内。各样品的保留时间可通过对各样品进 行预备实验而预先确定。送液方法可使用线性梯度洗脱法、阶梯式洗脱法等公知的送液方 法，但作为本发明中的送液方法，优选为线性梯度洗脱法。对于梯度(gradient)的大小，可 W将洗脱所使用的洗脱液在0%~100%的范围内根据色谱柱的分离性能和分析对象物(此 处为PCR扩增产物）的特性进行适当调整即可。
[0143] 本发明中，通过将W上述顺序亚硫酸氨盐处理了的DNA的PCR扩增产物供给离子交 换色谱，从而能够对样品DNA中的DNA的甲基化进行检测。
[0144] 对DNA进行亚硫酸氨盐处理的情况下，该DNA中的未甲基化胞喀晚变换为尿喀晚， 但甲基化胞喀晚仍是胞喀晚。如果对进行了亚硫酸氨盐处理的DNA进行PCR扩增，则来自于 未甲基化胞喀晚的尿喀晚进一步被置换为胸腺喀晚，因此，在甲基化DNA与未甲基化DNA之 间，胞喀晚与胸腺喀晚的存在比率产生差异。因此，PCR扩增产物中的DNA具有与甲基化率对 应的不同的序列。如果将上述PCR扩增产物供给离子交换色谱，则可根据该扩增产物中含有 的DNA的碱基序列，得到显示不同信号的色谱。
[0145] 例如，通过将来自样品DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产物的检测信号与来自 与样品DNA碱基序列相同但没有甲基化的DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产物m下，称 为阴性对照）的检测信号、或来自与样品DNA的碱基序列相同且甲基化率已知(例如，100%) 的DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产物下，称为阳性对照）的检测信号进行比较，可 W测定样品DNA中的甲基化DNA有无存在。
[0146] 或者，通过将来自样品DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产物的检测信号与来自 阴性和阳性对照的检测信号进行比较，可W测定样品DNA中的甲基化DNA的存在量和未甲基 化DNA的存在量之比。再或者，通过将来自与样品DNA碱基序列相同且甲基化率已知的多个 DNA的亚硫酸氨盐处理物所产生的多个PCR扩增产物下，称为标准品）的检测信号与来自 样品DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产物的检测信号进行比较，可W测定样品DNA中的 甲基化DNA的甲基化率、存在量、W及与未甲基化DNA的存在量之比。
[0147] 在本发明的方法中，代替上述阴性对照、阳性对照或标准品，也可W使用由与上述 阴性对照、阳性对照或标准品相同的碱基序列构成的、化学或基因工程合成的DNA。进一步， 在本发明的方法中，在阴性对照、阳性对照或标准品的制备中也可W使用市售品，例如可W 使用化iTect Control DNA and Control DNA Set(Qiagen公司制）。
[0148] 在优选的方式中，在本发明中进行的离子交换色谱中，将含有上述样品DNA的亚硫 酸氨盐处理物的PCR扩增产物的试样和上述阴性对照或阳性对照、或上述标准品的试样分 别独立地供于离子交换色谱分析。通过使用多个洗脱液对吸附于色谱柱的试样进行梯度洗 脱，从而可根据DNA甲基化率W不同保留时间将样品DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产 物和阴性对照或阳性对照或者标准品进行洗脱。
[0149] 来自于阴性对照的检测信号可W通过代替样品DNA而使用与样品DNA碱基序列相 同但没有甲基化的DNA，按照上述顺序进行亚硫酸氨盐处理和PCR，将得到的PCR扩增产物供 给离子交换色谱而获得。来自于阳性对照的检测信号可W通过代替样品DNA而使用与样品 DNA碱基序列相同且甲基化率已知（例如，100 % )的DNA按照上述顺序进行亚硫酸氨盐处理 和PCR，将得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱而获得。或者，也可W通过将上述合成DNA、 市售的DNA作为阴性或阳性对照供给离子交换色谱，从而得到来自于阴性或阳性对照的检 测信号。
[0150] 来自于标准品的检测信号可W通过代替样品DNA而使用与样品DNA碱基序列相同 且甲基化率已知的多个DNA，按照上述顺序进行亚硫酸氨盐处理和PCR，将得到的多个PCR扩 增产物分别供给离子交换色谱而获得。进而，可W根据得到的各个检测信号，制作标准曲 线。或者，通过将上述合成DNA、市售的DNA作为标准品供给离子交换色谱，也可W得到来自 于标准品的检测信号。
[0151] 接着，将在上述色谱中得到的来自于样品DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产物 的检测信号与来自于阴性或阳性对照、或标准品的检测信号进行比较。基于两者的检测信 号的差异，可W检测样品DNA的甲基化。
[0152] 例如，由样品DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产物得到的检测信号的峰的保留 时间如果偏离阴性对照的峰的保留时间，则可W判定样品DNA甲基化。进而此时，如果保留 时间的偏离越大，可W推知甲基化率越大。相反，由样品DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增 产物得到的检测信号的峰的保留时间如果越偏离100%甲基化阳性对照的峰的保留时间， 则可W推知样品DNA的甲基化率越小。或者，基于由甲基化率已知的标准品得到的多个峰的 保留时间制作标准曲线，基于该标准曲线可W确定样品DNA的甲基化率(参照图1和2)。
[0153] 根据上述标准曲线，能够使DNA甲基化率与保留时间相关联。因此，基于该标准曲 线，可W求得与基准保留时间对应的DNA甲基化率（W下，也称为基准DNA甲基化率）。如果事 先取得基准DNA甲基化率，则即使在变更HPLC的器材、分析条件的情况下，通过在该变更的 器材、条件下，对新制成的标准曲线拟合该基准DNA甲基化率，也能够容易地算出新的基准 保留时间。
[0154] 此外例如，通过将由样品DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产物得到的检测信号 的峰的高度或峰面积，与由甲基化DNA的甲基化率和混合比已知的DNA的亚硫酸氨盐处理物 的PCR扩增产物得到的检测信号的峰的高度或峰面积进行比较，可W确定样品DNA中的甲基 化DNA的存在比率（例如未甲基化DNA的存在比率、W特定的比例甲基化的DNA的存在比率 等)。
[0155] 本发明的方法中，作为判定色谱的检测信号的峰的有无的方法，可举出使用已有 的数据处理软件例如LCsolution(岛津制作所）^RAMS/AKlliermo Fisher Scientific公 司）、Igor P;ro(WaveMe化ics公司）等的峰检测。例示使用了LCsolution的峰的有无的判定 方法时，具体而言，首先指定要检测出峰的保留时间的区间。接下来，为了除去噪音等不必 要的峰，设定各种参数。例如，可举出将参数"WIDTH"设置为大于不要的峰的半峰宽，将参数 "化OPE"设置为大于不要的峰的上升斜率，通过改变参数"DRIFT"的设定来选择垂直分割或 基线分割分离度低的峰等。对于参数值而言，由于分析条件、选择的基因标志物的种类、样 本的量等而得到不同色谱图，因此，根据色谱图设定适当的值即可。
[0156] 保留时间即峰顶的时间可W用上述的数据处理软件自动算出。例如，可W将色谱 图进行一次微分，并将微分系数从正数变化为负数的时间作为峰顶的时间而取得。
[0157] 在本发明的方法中，对利用色谱得到的检测信号的保留时间进行调查。其结果，在 早于基准保留时间的保留时间得到检测信号的情况下，可判定该试样为从预后不良的肾细 胞癌患者得到的试样。如图3A、B所示，在高甲基化率DNA的峰和低甲基化率DNA的峰分离良 好且二峰化的情况下，通过峰的分离而能够除去未甲基化DNA的影响，可精度良好地判定为 由预后不良的肾细胞癌患者得到的试样。
[015引进而，本发明的方法中，从由样品DNA的亚硫酸氨盐处理物的PCR扩增产物得到的 检测信号减去由阴性对照得到的检测信号，可W求出差值数据。通过求得差值数据，可W从 作为样品DNA整体的检测信号中除去来自未甲基化DNA的信号（噪音），仅提取来自甲基化 DNA的信号。该差值数据相当于样品DNA中的甲基化DNA所致的检测信号。将该差值数据的保 留时间与基准保留时间进行比较。其结果，在早于基准保留时间的情况下，可判定该试样为 从预后不良的肾细胞癌患者得到的试样。通过使用该差值数据，即使在仅微弱检测出来自 甲基化DNA的信号成分的样品中，例如甲基化DNA的存在比率低的样品DNA、或者含有甲基化 率低的甲基化DNA的样品DNA中，也能够进行甲基化DNA的检巧U、解析。另外，在样品DNA中含 有各种甲基化率的DNA的情况下，能够得到有肩峰的、多个峰重叠等各种图案的色谱图。在 运种情况下，通过求出差值数据仅提取高甲基化率的样品DNA的信号，因此，可高精度地进 行癌预后判定。
[0159] 因此，通过使用上述差值数据，关于样品DNA中的甲基化DNA，能够更高精度的解 析。应予说明，求出差值数据时，优选样品DNA与阴性对照中使用的DNA的DNA量事先匹配。 DNA量的确认通过吸光度测定等的测定方法进行确认即可。
[0160] 利用上述差值数据时的本发明的癌预后判定方法的顺序，基本上与上述差值前的 数据的情况相同。例如，对利用色谱得到的检测信号的保留时间进行调查，其结果，在早于 成为基准的保留时间的保留时间得到检测信号的情况下，可判定该试样为从预后不良的肾 细胞癌患者得到的试样。
[0161] 在本发明的预后判定方法中，上述差值数据的利用非常有效。为了临床检查而采 取的样本存在W下的情况，即，含有没有进行DNA甲基化的非癌上皮细胞、间质细胞等正常 细胞的情况;或者含有大量DNA甲基化没有特别进行的前癌状态的细胞的情况;或者W各种 比例存在各种DNA甲基化率的癌细胞的情况。通过使用上述差值数据，能够除去样本中的正 常细胞或前癌细胞中的正常DNA、或者来自作为测定对象的基因区域没有甲基化的癌细胞 的未甲基化DNA的影响，所W能够进行更高精度的甲基化DNA的检测，进而利用该检测结果 时，能够进行更高精度的癌预后判定。
[0162] 根据本发明的预后判定方法，能够对试样中的甲基化DNA和未甲基化DNA进行分离 检测，因此，即使试样含有大量正常细胞的情况下，也可高精度地检测甲基化DNA的存在及 其甲基化率，并进行准确的预后判定。在本发明的方法中，对于W往的检查中尽管预后不良 但没有判定为CIMP阳性运样的受检者，也能够进行正确的预后判定。
[0163] 实施例
[0164] W下，通过实施例对本发明作详细说明，但本发明不受W下实施例的限制。
[01化]〔患者和组织样品）
[0166] 109癌组织(T)样品和对应的10巧自癌肾皮质组织(N)样品是从由患有原发性的透 明细胞型肾细胞癌的110人的患者通过手术摘出的试样得到的，N样品中没有看到显著的组 织学变化。应予说明，运些患者是没有接受术前治疗的、在国立癌症研究中屯、医院接受肾摘 出术的患者。由79名男性和31名女性构成，平均年龄为62.8± 10.3岁（平均±标准偏差，36 ~85岁）。
[0167] 另外，样品的组织学诊断是根据WHO的分类进行的（参照化le，J.N.等，"肾细胞癌 肿瘤WHO分类病理学W及遗传学男性生殖器W及泌尿系统的肿瘤"，2004年，IARC出版， Lyon, 10~43页，图1)。
[016引进而，全部的肿瘤的组织学异型度根据"Fuhrman，S. A.等，Am. J. Surg.化tho 1.， 1982年，6卷，655~663页"记载的基准进行评价，了醒分类根据"Sobin，L. H.等，国际抗癌联 盟化ICC)，?M恶性肿瘤的分类，第6版，2002年，Wil巧-Liss，化W化rk，193~195页"等进行 分类。
[0169] 另外，作为肾细胞癌的肉眼分类的基准，采用在肝细胞癌化CC)中确立的基准（参 照非专利文献4~6)。应予说明，类型3(多结节愈合型化CC与类型1(单结节型）和类型2(单 结节周围增殖型）的HC讨目比，组织学的分化度低、肝内转移的产生率高（参照Kanai，T.等， Cancer ,1987年，60 卷，810~819页）。
[0170] 有无血管侵袭，通过用显微镜观察实施了苏木精-曙红和Elastica van Gieson s化in染色的载玻片进行调查。肾静脉的主干中的肿瘤血栓的有无通过肉眼观察来调查。
[0171] 从作为运次研究对象的全部患者获得书面的知情同意书。另外，本研究受到国立 癌症研究中屯、的伦理委员会的承认而进行实施。
[0172] 〔参考例1)利用现有方法的CIMP阴性/阳性判定
[017引利用现有方法的CIMP阴性/阳性判定，根据专利文献帥记载的MassARRAY法(实施 例5)进行。用甲基化DNA检测方法之一的MaSSARRAY法，检测17种基因（FAM150A、GRM6、 ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、WNT3A、T畑、FAM78A、 ZNF671、化C13A5 W及NKX6-2)的CpG位点（表1~4)的DNA甲基化水平。
[0174] MassARRAY法是如下方法，即，将亚硫酸氨盐处理后的DNA扩增，转录为RNA，进而利 用RNAase进行碱基特异性切割后，利用质量分析仪，检测甲基化DNA片段与未甲基化DNA片 段的分子量之差。
[01巧]首先，对含有上述CpG位点的CpG岛，使用6910日31旨〇日^5691]6肋1公司制， MassARRAY用引物设计软件)进行MassARRAY的引物设计。
[0176] 另外，为了排除PCR中的偏差的影响，每1个引物组，平均进行3种DNA聚合酶和4个 阶段左右退火溫度的条件的组合来试行，确定定量性良好的最佳PCR条件。接着，针对PCR祀 序列所包含的作为解析对象的全部CpG部位，确认在采用的PCR条件下定量性良好，在109的 肾细胞癌组织样品中的肾细胞癌102样本中，实施MassARRAY解析。
[0177] 首先，通过将从上述患者得到的新鲜冷冻组织样品用苯酪-氯仿进行处理，接着实 施透析，从而提取高分子量DM(参照Sambrook，J.等，分子克隆：实验手册第3版，冷泉港实 验室出版，NY，6.14~6.15页）。而且，使用EZ DNA Methylation-Gold?试剂盒（Zymo Research公司制），将DNA50化g供于亚硫酸氨盐处理。用PCR对亚硫酸氨盐处理基因组DNA进 行扩增，从而进行体外转录反应。接着，将得到的RNA利用RNAase在尿喀晚的部位进行特异 性切割，生成与各样品的基因组DNA的甲基化的有无对应的长度不同的片段。而且，将得到 的RNA片段供给能够检测一个碱基质量的差异的MALDI-T0F MAS(SEQUENOM公司制， MassARRAY Analyzer 4)，进行质量分析。使用解析软件化piTYP邸，SEQ肥N0M公司制），将得 到的质量分析结果与参比序列进行比对，根据来自于甲基化DNA的RNA片段和来自于未甲基 化DNA的RNA片段的质量比，算出甲基化水平。将本解析所使用的引物的序列和使用该引物 组进行扩增的PCR产物的序列示于表5和6 W及序列表中。
[017引表5
[0181]
[0182] 关于作为MassARRAY的解析对象的全部区域，通过检测上述CpG位点的DM甲基化 水平，来辨别预后不良的肾细胞癌(CIMP阳性组：14样本)和预后良好的肾细胞癌(CIMP阴性 组:88样本）。
[0183] 〔参考例2)阴离子交换色谱柱的制备
[0184] 向带有揽拌机的反应器中的3重量％聚乙締醇（日本合成化学公司制）水溶液 2000mL中，添加四乙二醇二甲基丙締酸醋(新中村化学工业公司制）200g、S乙二醇二甲基 丙締酸醋(新中村化学工业公司制noog、甲基丙締酸缩水甘油醋（和光纯药工业公司制） lOOgW及过氧化苯甲酯化ISHIDA化学公司制n.Og的混合物。边揽拌边加热，在氮气氛下W 8(TC聚合1小时。接下来，作为具有强阳离子性基团的亲水性单体，将甲基丙締酸乙基S甲 基氯化锭(和光纯药工业公司制noog溶解于离子交换水。将其添加至相同的反应器，按照 相同方式，边揽拌边在氮气氛下W80°c聚合2小时。通过用水和丙酬将得到的聚合组合物清 洗，得到表面具有具备季锭基的亲水性聚合物的层的被覆聚合物粒子。对于得到的被覆聚 合物粒子，使用粒度分布测定装置(Ac州Sizer780/化；rticle Sizing Systems公司制）进行 测定，结果平均粒径为10皿。
[0185] 使得到的被覆聚合物粒子lOg分散在离子交换水lOOmL中，准备反应前浆料。接着， 边揽拌该浆料，边添加 N，N-二甲基氨基丙基胺(和光纯药工业公司制）lOmL，在70°C反应4小 时。反应结束后，使用离屯、分离机（日立制作所公司制，巧imac CR20G")除去上清，用离子交 换水清洗。清洗后，使用离屯、分离机除去上清。进一步重复4次该利用离子交换水的清洗，得 到在基材粒子的表面具有季锭基和叔氨基的离子交换色谱用填充剂。
[0186] 将上述离子交换色谱用填充剂填充于液相色谱系统的不诱钢制色谱柱(色谱柱尺 寸：内径4.6mm X长度20mm)。
[0187] 〔参考例3)利用离子交换色谱的甲基化DNA的检测
[0188] (1)基因组DNA的提取和亚硫酸氨盐处理
[0189] 将从患者得到的新鲜冷冻组织样品用苯酪-氯仿进行处理，接着实施透析，从而提 取高分子量DNA(参照Sambrook，J.等，分子克隆：实验手册第3版，冷泉港实验室出版，NY， 6.14~6.15页）。使用62 0麻16证71日11〇11-6〇1(1了《试剂盒（27111〇1?636日'地公司制），将 DNA50化g供于亚硫酸氨盐处理。
[0190] (2)PCR
[0191] 对（1)中得到的亚硫酸氨盐处理基因组DNA进行PCR扩增。PCR用含有模板DNA 10ng、GeneAmp 1XPCR buffeHLife Technologies公司制）、200皿ol/L GeneAmp dNTP MixiXife Technologies公司制）、0.75U Ampinaq Gold DNA聚合酶(Xife Technologies 公司制）、〇.25皿ol/L正义W及反义引物的25化的反应液进行。在PCR中，在95°C进行5分钟 初始热变性后，将94°C 30秒^59 °C (使用F3-R3引物时）30秒^72 °C40秒作为1个循环，持续 35个循环，进一步在72°C进行10分的延伸反应。PCR结束后，在预先添加了漠化乙锭的3%琼 脂糖凝胶中，对反应液扣L混合loading dye solution 1化后上样而进行电泳，观察PCR扩 增产物来确认得到目标PCR扩增产物。各引物的序列示于表7。
[0192] 表7
[0193]
[0194] 下划线是引物结合部位
[0195] (3)HPLC 分析
[0196] 使用参考例2中准备的阴离子交换色谱柱，按W下条件进行离子交换色谱，对(2) 中得到的各PCR扩增产物进行分离检测。
[0197] 系统:LC-20A系列（岛津制作所公司制）
[019引洗脱液:洗脱液A 25mmol/L Tris-盐酸缓冲液(PH7.5)
[0199] 洗脱液B 25mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)+lmol/L硫酸锭分析时间：分析时间 为15分钟
[0200] 洗脱法:根据W下的梯度条件使洗脱液B的混合比率线性增加。
[0201] 0分钟(洗脱液B 40%)一 10分钟(洗脱液B 100%)
[0202] 样本:（2)中得到的PCR扩增产物
[0203] 流速：1.0mL/min [0204] 检测波长：260nm [02化]试样注入量:如L
[0206] 柱溫：70 r
[0207] 〔实施例1)基于DM甲基化率的色谱保留时间的变动
[020引基于FAM150A基因启动子的具有39个CpG位点的384bp区域的DNA序列，合成从39个 CpG位点全部被甲基化的DNA( 100%甲基化DNA)至完全没有被甲基化的DNA(0%甲基化DNA) 的甲基化率不同的8个DNA。应予说明，对于50%甲基化DNA，合成甲基化位置在5 '端附近、在 3'端附近、和在中央附近的巧中模式的DNA。将各合成DNA的甲基化率和CpG岛的甲基化数示 于表8。
[0209]表 8
[0210]
[0別。将上述8个合成DNA，按照参考例3的顺序供给亚硫酸氨盐处理、PCRW及HPLC。将合 成DNA齡.1(100%甲基化）、齡.2(0%甲基化）、齡.3(25%甲基化）、齡.4(50%甲基化）^及 No.5(75%甲基化）的HPLC的色谱示于图1。能看到保留时间随着DNA甲基化率而缩短。进而， 对于8个DNA，将HPLC的保留时间相对于甲基化率绘制的数据示于图2。显示HPLC的保留时间 相对于DNA甲基化率有极高的相关性。进而，对于50%甲基化DNA，可确认不依赖于甲基化位 置地显示基本相同的保留时间。由此显示出不依赖于DNA中的甲基化位置而取决于甲基化 率来确定保留时间。因此，通过测定HPLC的保留时间能够测定样品DNA所含的甲基化率。
[0212] 〔实施例2)肾细胞癌中的DNA甲基化解析和预后判定
[0213] 参考例1中CIMP判定的肾细胞癌中，由来自患者13人的CIMP阳性肾细胞癌和来自5 人的CIMP阴性肾细胞癌制备基因组DNA。按照参考例3 (1)~(3)的顺序，将该DNA供给亚硫酸 氨盐处理、PCR W及HPLC。PCR中，对FAM150A基因启动子中的384bp区域进行扩增。
[0214] 进而，对于上述PCR扩增区域中的甲基化率为0 % (阴性对照）和100 % (阳性对照） 的DNA，也分别按相同的顺序进行HPLC分析。
[0215] 将由CIMP阳性和CIMP阴性试样得到的HPLC色谱示于图3。图3中也示出了未甲基化 DNA(阴性对照)和100%甲基化DNA(阳性对照）的色谱图。图3A、B为CIMP阳性试样的色谱图， 与未甲基化DNA(阴性对照）的峰保留时间不同的峰清晰地出现，表示甲基化DNA的存在。图 3C为CIMP阴性试样的色谱，其峰与未甲基化DNA(阴性对照）的峰在保留时间上基本没有区 另IJ，表示基本不存在甲基化DNA。图3D为CIMP阴性试样的色谱，但与未甲基化DNA(阴性对照） 的峰保留时间不同的峰清晰地出现，表示存在甲基化DNA。即，即使判定为CIMP阴性，也启示 有可能为预后不良的样本。
[0216] 图4是对本实施例中调查的全部18个CIMP阴性/阳性试样绘制HPLC色谱的峰的保 留时间的图。由于CIMP阴性试样和阳性试样的保留时间的分布明显不同，所W可明确根据 本发明的方法，用MassARRAY法判定的癌的CIMP也能够通过本发明的方法准确地判断。 [0217] 在本实施例中使用的FAM150A基因启动子384bp区域中，如图4所示，在保留时间 9.3min附近可区分CIMP阳性组和CIMP阴性组，所W，可W将保留时间9.3min附近设定为成 为基准的保留时间。即，在早于成为基准的保留时间（基准保留时间）的保留时间具有检测 信号的样本可判定为预后不良。上述基准保留时间根据HPLC的分析条件、基因组DNA的区 域、或基因标志物的种类等而色谱图发生变化，所W设定适当的基准保留时间即可。另外， 也优选考虑必要的临床灵敏度来设定基准保留时间。
[0218] 本实施例中，由于阳性对照(dm甲基化率100%)的保留时间为约9.0分钟和阴性 对照(DNA甲基化率0 % )的保留时间约为9.35分钟，所W算出具有基准保留时间的基准DNA 甲基化率约为17%。因此，显示在本实施例中使用的FAM150A基因启动子384bp区域中，具有 高于上述基准DNA甲基化率(约17%)的DNA甲基化率的样本为预后不良。
[0219] 将MassARRAY中得到的DNA甲基化率的平均值与本发明中得到的DNA甲基化率进行 比较。对于本发明中的得到的检测信号为图3A、B所示的二峰化的峰，绘制根据保留时间(将 洗脱较快的保留时间设为曰、较慢的保留时间设为b)算出的DNA甲基化率，与用MassARRAY得 到的DNA甲基化率进行比较，将结果示于图5A。在图5A中，没有看到由各个方法得到的DNA甲 基化率有相关性。然而，将由W保留时间a与保留时间b的平均算出的合成峰C(保留时间C) 得到的DNA甲基化率进行绘制，同样地，与用MassARRAY得到的DNA甲基化率进行比较，将结 果示于图5B。如图5B所示，由合成峰C算出的DNA甲基化率与用MassARRAY法得到的DNA甲基 化率的平均值有良好的相关性。
[0220] 根据本发明，例如30%甲基化DNA与70%甲基化DNA等量混合而成的试样和全部为 50 %甲基化DNA的试样在色谱图上可明显地辨别。与此相对，在上述的例子中，通过 MassARRAY法对于任一试样也仅能够得到W平均值计为50%甲基化DNA的信息。根据本发 明，由于与MassARRAY法不同，能够将试样中所含的各种DNA甲基化率的信号分离检测，所W 能够得到没有被平均化的DNA甲基化率。
[0221] 由于MassARRAY法、焦憐酸测序等方法中得到的DNA甲基化率的值能够得到作为供 于测定的试样整体的平均值的DNA甲基化率，因此，作为结果，存在无法判定有无具有高度 甲基化DNA的细胞运一问题。根据本发明，即使判定为CIMP阴性，由于能够除去未甲基化DNA 的影响，并能够检测是否含有高甲基化DNA，所W能够避免低估DNA甲基化率的风险。进而可 判定疑似预后不良的样本。
[0222] 基于专利文献4中记载的方法的CIMP判定是W多个基因标志物的CpG岛为对象对 CpG位点的甲基化进行调查来判定CIMP阳性或CIMP阴性。根据本发明，即使为单独的基因标 志物，也启示有可能通过对由HPLC得到的检测信号进行解析而能够容易地得到与CIMP判定 同等的肾细胞癌的预后判定。进而，启示了有可能通过对多个基因标志物解析基于HPLC的 检测信号从而能够使预后判定高精度化。
【主权项】
1. 一种含有肾细胞癌的组织的判定方法，包括以下工序： (1) 将由受检者的肾脏组织制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐进行处理的工序； (2) 将工序（1)中得到的被亚硫酸氢盐处理过的DNA通过PCR进行扩增的工序； (3) 将工序(2)中得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序； (4) 获得在该色谱中得到的检测信号的保留时间的工序； (5) 在工序(4)的结果早于成为基准的保留时间的情况下，判定该组织为从预后不良的 肾细胞癌患者得到的含有肾细胞癌的组织的工序。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，在所述工序（2)中，被P C R扩增的D N A含有选自 FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、 WNT3A、TRH、FAM78A、ZNF671、SLC13A5 以及 NKX6-2 中的至少一个基因的 CpG 岛。3. 根据权利要求1所述的方法，其中，在所述工序(2)中，被PCR扩增的DNA含有FAM150A 基因启动子区域。4. 根据权利要求1所述的方法，其中，在所述工序(2)的PCR中，使用由序列号51和52表 示的PCR引物。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，在所述工序(4)之前，进一步包括以 下工序： 0-)将与由所述受检者的肾脏组织制备的基因组DNA的PCR扩增区域相当的未甲基化 的DNA用亚硫酸氢盐进行处理的工序； (2'）将工序0- )中得到的被亚硫酸氢盐处理过的DNA通过PCR进行扩增的工序； (3'）将工序(2'）中得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序； (3a)从工序(3)的色谱所得到的检测信号减去工序(3'）的色谱所得到的检测信号而得 到差值数据的工序。6. -种肾细胞癌患者的预后判定方法，包括以下工序： (1) 将由受检者的肾脏组织制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐进行处理的工序； (2) 将被该亚硫酸氢盐处理过的DNA通过PCR进行扩增的工序； (3) 将得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序； (4) 获得在该色谱中得到的检测信号的保留时间的工序； (5) 在工序(4)的结果早于成为基准的保留时间的情况下，将该受检者的肾细胞癌判定 为预后不良的工序。7. 根据权利要求6所述的方法，其中，在所述工序（2)中，被PCR扩增的DNA含有选自 FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、 WNT3A、TRH、FAM78A、ZNF671、SLC13A5 以及 NKX6-2 中的至少一个基因的 CpG 岛。8. 根据权利要求6所述的方法，其中，在所述工序(2)中，被PCR扩增的DNA含有FAM150A 基因启动子区域。9. 根据权利要求6所述的方法，其中，在所述工序(2)的PCR中，使用由序列号51和52表 示的PCR引物。10. 根据权利要求6~9中任一项所述的方法，其中，在所述工序(4)之前，进一步包括以 下工序： 0-)将与由所述受检者的肾脏组织制备的基因组DNA的PCR扩增区域相当的未甲基化 的DNA用亚硫酸氢盐进行处理的工序； (2'）将工序0- )中得到的被亚硫酸氢盐处理过的DNA通过PCR进行扩增的工序； (3'）将工序(2'）中得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序； (3a)从工序(3)的色谱所得到的检测信号减去工序(3'）的色谱所得到的检测信号而得 到差值数据的工序。11. 一种用于判定含有肾细胞癌的组织的数据的获得方法，包括以下工序： (1) 将由受检者的肾脏组织制备的基因组DNA用亚硫酸氢盐进行处理的工序； (2) 将被该亚硫酸氢盐处理过的DNA通过PCR进行扩增的工序； (3) 将得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序； (4) 获得在该色谱中得到的检测信号的保留时间的工序； (5) 取得以下数据的工序，即，将工序(4)的结果是否早于成为基准的保留时间作为用 于判定该组织是否为从预后不良的肾细胞癌患者得到的含有肾细胞癌的组织的数据。12. 根据权利要求11所述的方法，其中，在所述工序（2)中，被PCR扩增的DNA含有选自 FAM150A、GRM6、ZNF540、ZFP42、ZNF154、RIMS4、PCDHAC1、KHDRBS2、ASCL2、KCNQ1、PRAC、 WNT3A、TRH、FAM78A、ZNF671、SLC13A5 以及 NKX6-2 中的至少一个基因的 CpG 岛。13. 根据权利要求11所述的方法，其中，在所述工序（2 )中，被P C R扩增的D N A含有 FAM150A基因启动子区域。14. 根据权利要求11所述的方法，其中，在所述工序(2)的PCR中，使用由序列号51和52 表示的PCR引物。15. 根据权利要求11~14中任一项所述的方法，其中，在所述工序(4)之前，进一步包括 以下工序： 0-)将与由所述受检者的肾脏组织制备的基因组DNA的PCR扩增区域相当的未甲基化 的DNA用亚硫酸氢盐进行处理的工序； (2'）将工序0- )中得到的被亚硫酸氢盐处理过的DNA通过PCR进行扩增的工序； (3'）将工序(2'）中得到的PCR扩增产物供给离子交换色谱的工序； (3a)从工序(3)的色谱所得到的检测信号减去工序(3'）的色谱所得到的检测信号而得 到差值数据的工序。
【文档编号】G01N30/88GK106062215SQ201580010887
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年3月2日
【发明人】金井弥荣, 新井惠吏, 根本有理子, 与谷卓也
【申请人】国立研究开发法人国立癌研究中心, 积水医疗株式会社