一种牛血清白蛋白提取方法和牛血清白蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛血清白蛋白提取方法，其包括，用第一超滤膜对蛋白溶解液进行超滤浓缩的得到蛋白浓缩液的第一次浓缩换液步骤；用弱阴离子交换介质对蛋白浓缩液进行层析纯化收集得到粗白蛋白溶液的第一次纯化步骤；用第二超滤膜对粗白蛋白溶液进行超滤浓缩到粗白蛋白浓缩液的第二次浓缩换液步骤；用强阳离子交换介质对粗白蛋白浓缩液进行层析纯化收集得到白蛋白溶液的第二次纯化步骤。本发明的提取方法通过两次超滤浓缩，两次层析纯化的步骤，最大程度地去除血浆中的杂质，提高了牛血清白蛋白的纯度。此外本发明还提供了一种由上述方法得到的牛血清白蛋白。
【专利说明】
一种牛血清白蛋白提取方法和牛血清白蛋白
技术领域
[0001 ]本发明涉及牛血清白蛋白提取技术领域，具体而言，涉及一种牛血清白蛋白提取方法和牛血清白蛋白。
【背景技术】
[0002]目前，牛血清白蛋白(BSA)，又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.43kDa，等电点为4.7，是生物学诸多学科及医、药学各领域广泛应用的生化试剂，也可用作医药保健食品、调味品。
[0003]牛血清中白蛋白的制备方法很多，主要采用盐析法、有机溶剂沉淀法和热激法提取。盐析法用硫酸铵分级沉淀后，经辛酸处理精制而得;有机溶剂沉淀法最早用于人血液制品的生产，利用乙醇的低介电常数性质以及蛋白质在一定温度、PH、离子强度及浓度条件下在不同浓度乙醇中的溶解度不同分离血浆蛋白质，可以生产出多种血浆蛋白；热激法是取牛血用枸橼酸钠抗凝离心后得到血浆，加热，加入辛酸钠，调pH值后加乙醇，再经过滤、脱盐、浓缩、冻干后得牛血清中白蛋白。
[0004]总之，现有的用于制备牛血清白蛋白的方法所得的牛血清白蛋白收率或纯度都比较低，且所提取的牛血清白蛋白中含有较高浓度的杂质例如脂肪酸、蛋白酶、核酸酶以及内毒素。这类杂质限制了牛血清白蛋白的进一步应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种牛血清白蛋白提取方法，此方法能够从牛血中提取出高纯度、高收率的牛血清白蛋白，且通过本方法提取得到的牛血清白蛋白不含肪酸、蛋白酶、核酸酶以及只含较低浓度的内毒素。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种牛血清白蛋白，该牛血清白蛋白由采用上述提取方法提取得到，该牛血清白蛋白的纯度高，不含肪酸、蛋白酶、核酸酶以及只含较低浓度的内毒素。
[0007]本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0008]—种牛血清白蛋白提取方法，其包括:
[0009]血液分离步骤:取新鲜牛血液，分离成血细胞和血浆；
[0010]蛋白沉淀溶解步骤:往血浆中加入沉淀剂进行沉淀，得到蛋白沉淀，加入水溶解蛋白沉淀，得到蛋白溶解液；
[0011 ]第一次浓缩换液步骤:用第一超滤膜对蛋白溶解液进行超滤浓缩，用的第一磷酸盐缓冲液换液，得到蛋白浓缩液；
[0012]第一次纯化步骤:用弱阴离子交换介质对蛋白浓缩液进行层析纯化，用含氯化钠的第二磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集得到粗白蛋白溶液；
[0013]第二次浓缩换液步骤:用第二超滤膜对粗白蛋白溶液进行超滤浓缩，用柠檬酸盐缓冲液换液，得到粗白蛋白浓缩液；
[0014]第二次纯化步骤:用强阳离子交换介质对粗白蛋白浓缩液进行层析纯化，收集得到白蛋白溶液。
[0015]—种牛血清白蛋白，其由上述所述的牛血清白蛋白提取方法提取得到。
[0016]本发明提供的牛血清白蛋白提取方法和牛血清白蛋白的有益效果是:本发明的牛血清白蛋白提取方法将从新鲜牛血液分离的血浆经蛋白沉淀溶解之后制得的蛋白溶解液，用第一超滤膜对蛋白溶解液进行超滤浓缩的得到蛋白浓缩液;用弱阴离子交换介质对蛋白浓缩液进行层析纯化收集得到粗白蛋白溶液;用第二超滤膜对粗白蛋白溶液进行超滤浓缩到粗白蛋白浓缩液;用强阳离子交换介质对粗白蛋白浓缩液进行层析纯化收集得到白蛋白溶液。利用多次浓缩换液(第一次浓缩换液步骤，第二次浓缩换液步骤)和多次层析纯化步骤(第一次纯化步骤，第二次纯化步骤)，以最大程度的提纯牛血清白蛋白，所得到的牛血清白蛋白的纯度大于等于99%，并且使得所提取的牛血清白蛋白不含肪酸、蛋白酶、核酸酶以及低于0.2EU/mg的内毒素。
【具体实施方式】
[0017]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品O
[0018]下面对本发明实施例的牛血清白蛋白提取方法进行具体说明。
[0019]—种牛血清白蛋白提取方法，其包括如下步骤。
[0020]SI血液分离
[0021]取新鲜的牛血液，将其分离成血细胞或血浆。较佳地，为了防止牛血液凝固，可在分离前往新鲜的牛血液中加入抗凝剂例如柠檬酸钠或水蛭素等。在本发明较佳的实施例中，以柠檬酸钠作为抗凝剂，且控制柠檬酸钠加入血液中的终浓度为3.6?4%。
[0022]S2蛋白沉淀溶解
[0023]往血浆中加入沉淀剂进行沉淀，得到蛋白沉淀，然后，加入水溶解该蛋白沉淀，得到蛋白溶解液。
[0024]其中，沉淀剂的主要作用是使血浆中的蛋白质沉淀，其可以是硫酸铵。需要说明的是，为了保证所提取的牛血清白蛋白中在应用到诊断试剂盒中时不产生干扰，在本发明较佳的实施例中，沉淀剂优选为硫酸铵，控制硫酸铵加入到血浆中的硫酸铵终浓度为40 %?8 O %。较佳地，控制硫酸钱加入到血楽中的硫酸钱终浓度为3 O %?5 O %。所用硫酸钱为100 %的饱和硫酸铵溶液(1L饱和硫酸铵溶液含硫酸铵685g)。当然，在其他的实施例中，可根据所提取的牛血清白蛋白的应用领域，选择性使用沉淀剂，也就说在其他的实施例中，沉淀剂是可以用辛酸钠或其他类别的沉淀剂。
[0025]另外，在步骤S2中，所用的水是超纯水。较佳地，所用的水与蛋白沉淀的质量比为4.8?5.3:1 ο
[0026]S3第一次浓缩换液
[0027]用第一超滤膜对蛋白溶解液进行超滤浓缩，用第一磷酸盐缓冲液换液，得到蛋白浓缩液。
[0028]其中，第一超滤膜的截留分子量为4.8?5KD，能够保证蛋白质尤其是牛血清白蛋白(其分子量为66.43kDa)大分子物质能够被有效地被截留在第一超滤膜上，而小分子物质能够被有效地过滤去除，提高牛血清白蛋白的纯度。另外，蛋白溶解液浓缩时的跨膜压控制在0.1psi左右。
[0029]另外，用于换液的第一磷酸盐缓冲液的磷酸盐浓度例如为18?2ImM，pH为6.8?
7.2。需要说明的是第一磷酸盐缓冲液可以是由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配置而成，也可以是由磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置而成。用第一磷酸盐缓冲液换液后的蛋白浓缩液中的牛血清白蛋白带负电荷。换液的操作步骤是用恒流栗将第一磷酸盐缓冲液加入到正在浓缩过程中的蛋白溶解液中，并通过恒流栗控制第一磷酸盐缓冲液的流速使蛋白溶解液的体积维持稳定。
[0030]还有，较佳地，在步骤S3中蛋白溶解液的浓缩倍数为9?11，也就是说，蛋白溶解液的体积与蛋白浓缩液的体积比为9?11:1。
[0031 ] S4第一次纯化
[0032]用弱阴离子交换介质对蛋白浓缩液进行层析纯化，用含氯化钠的第二磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集得到粗白蛋白溶液。
[0033]其中，弱阴离子交换介质采用二乙基氨基乙基(DEAE)离子交换介质对蛋白浓缩液进行层析纯化，其在层析柱上能够吸附带负电荷的分子，尤其适用于分离纯化生物大分子物质例如牛血清白蛋白。
[0034]另外，用于梯度洗脱的第二磷酸盐缓冲液的磷酸盐浓度例如为18?21mM，pH为6.8?7.2。每升第二磷酸盐缓冲液含有氯化钠为0.8?1.2mol。需要说明的是第二磷酸盐缓冲液可以是由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配置而成，也可以是由磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置
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[0035]S5第二次浓缩换液
[0036]用第二超滤膜对粗白蛋白溶液进行超滤浓缩，用柠檬酸盐缓冲液换液，得到粗白蛋白浓缩液。
[0037]其中，其中，第二超滤膜的截留分子量为4.8?5KD，能够保证蛋白质尤其是牛血清白蛋白(其分子量为66.43kDa)大分子物质能够被有效地被截留在第二超滤膜上，经过两次超滤后的牛血清白蛋白的纯度得到进一步提尚。
[0038]另外，在本步骤中，用于换液的柠檬酸盐缓冲液柠檬酸盐浓度为18_211111，？!1为4.8?5.2。该梓檬酸盐缓冲液主要由梓檬酸和梓檬酸三钠配置而成。用该梓檬酸盐缓冲液换液后的粗白蛋白浓缩液中的牛血清白蛋白带负电荷。
[0039]还有，在步骤S5中粗白蛋白溶解液的浓缩倍数为9?11，也就是说，粗白蛋白溶液的体积与粗白蛋白浓缩液的体积比为9?11:1。
[0040]S6第二次纯化
[0041 ]用强阳离子交换介质对粗白蛋白浓缩液进行层析纯化，收集得到白蛋白溶液。
[0042]其中，强阳离子交换介质为磺丙基离子交换介质，其能够吸附带正电荷的分子，进而可以吸附粗白蛋白浓缩液中的一些带正电荷的杂蛋白等物质。
[0043]由于步骤S5中的粗白蛋白浓缩液中的牛血清白蛋白处于其等电点，不带电荷，在本步骤中，牛血清白蛋白并不与带强阳离子交换介质的层析柱吸附结合，因此，可不用洗脱，可直接收集流出液得到高纯度的低杂质含量的白蛋白溶液。
[0044]因此，本发明通过两次超滤浓缩和两次层析纯化步骤，能够最大程度地去除血浆中的杂质例如脂肪酸、蛋白酶、核酸酶和内毒素，得到较高纯度的牛血清白蛋白，其能够广泛地应用医疗、生化等领域。
[0045]以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0046]实施例
[0047]本实施例提供的牛血清白蛋白提取方法，包括以下步骤:
[0048]1.血液分离
[0049]取新鲜的牛血液6000毫升，加入667毫升38%的柠檬酸三钠，使柠檬酸三钠在牛血液中的终重量浓度为3.8%,然后通过血球分离机(GFX-105血液分离机、辽阳翔隆制药机械有限公司)，对牛血液进行分离(转速16300rpm/min)，分离得到血细胞和血浆。
[0050]2.蛋白沉淀溶解
[0051 ] 2.1取步骤I中的血浆4000毫升，加入6000毫升的饱和硫酸铵，使硫酸铵在血浆中的终浓度为60%，并搅拌lh，使血浆中的蛋白质沉淀，去除上清液，保留蛋白沉淀。
[0052]2.2按与蛋白沉淀的质量比为5:1的比例加入超纯水6000毫升，溶解上述蛋白沉淀，得到蛋白溶解液7000毫升。
[0053]3.第一次浓缩换液
[0054]通过超滤机对步骤2.2中得到蛋白溶解液进行超滤浓缩，超滤机上所用超滤膜包的超滤膜的截留分子量为5 K D，调节超滤机的参数(M i n i P e 11 i c ο η超滤系统、m e r kmillipore公司)，流速为400ml/min、跨膜压为0.1psi，浓缩10倍，同时，用20mM、pH7.0的磷酸钠缓冲液进行换液。即用恒流栗将第一磷酸盐缓冲液加入到正在浓缩过程中的蛋白溶解液中，并通过恒流栗控制第一磷酸盐缓冲液的流速使蛋白溶解液的体积维持稳定，得到蛋白浓缩液700晕升。
[0055]4.第一次纯化
[0056]用层析纯化仪(APPSMV 100D、利穗(苏州)科技有限公司)对上述蛋白浓缩液进行层析纯化，以二乙基氨基乙基-纤维素(二乙基氨基乙基离子交换介质)作为层析柱填料。上柱前，用20mM、pH7.0的磷酸钠缓冲液平衡，流速10ml/min，平衡体积5CV;平衡结束后，将蛋白浓缩液上柱层析，控制流速8ml/min;上样结束后，用平衡液平衡5CV，流速为1ml/min;用含lmol/L氯化钠的20mM、pH7.0的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱(从O % B到100 % B拉梯度洗脱，共10CV)，收集得到粗白蛋白溶液400ml毫升。洗脱后，用2mol/L的氯化钠溶液对层析柱进行再生处理。
[0057]5.第二次进行换液
[0058]通过超滤机对步骤4中得到粗白蛋白溶液进行超滤浓缩，超滤机上所用超滤膜包的超滤膜的截留分子量为5KD，调节超滤系统的参数，流速为400ml/min、跨膜压为0.lpsi，用20mM、pH5.0的柠檬酸钠缓冲液进行换液。得到粗蛋白液600毫升。
[0059]6.第二次纯化
[0060]用层析纯化仪对上述粗蛋白浓缩液层析纯化，以磺丙基-纤维素(磺丙基离子交换介质)作为层析柱填料。上柱前，用20mM、pH5.0的柠檬酸钠缓冲液平衡，流速6ml/min，平衡体积10CV;平衡结束后，将蛋白浓缩液上柱层析，流速4ml/min，直接收集流出液，得到高纯度的低杂质含量的牛血清白蛋白溶液100ml毫升。经冷冻干燥后记得到牛血清白蛋白粉。
[0061]经检测(脂肪酸的检测利用脂肪酸测定仪检测，蛋白酶利用蛋白酶elisa试剂盒检测，核酸酶利用elisa试剂盒检测，内毒素采用凝胶法检测)，采用本实施例提供的牛血清白蛋白提取方法所得到的牛血清白蛋白的纯度大于等于99%，且不含脂肪酸、蛋白酶和核酸酶，内毒素含量低于0.2EU/mg。其能够广泛地应用医药研究、生化研究以及遗传工程等领域。
[0062]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，其包括: 血液分离步骤:取新鲜牛血液，分离成血细胞和血浆； 蛋白沉淀溶解步骤:往所述血浆中加入沉淀剂进行沉淀，得到蛋白沉淀，加入水溶解所述蛋白沉淀，得到蛋白溶解液； 第一次浓缩换液步骤:用第一超滤膜对所述蛋白溶解液进行超滤浓缩，用第一磷酸盐缓冲液换液，得到蛋白浓缩液； 第一次纯化步骤:用弱阴离子交换介质对所述蛋白浓缩液进行层析纯化，用含氯化钠的第二磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集得到粗白蛋白溶液； 第二次浓缩换液步骤:用第二超滤膜对所述粗白蛋白溶液进行超滤浓缩，用柠檬酸盐缓冲液换液，得到粗白蛋白浓缩液； 第二次纯化步骤:用强阳离子交换介质对所述粗白蛋白浓缩液进行层析纯化，收集得到白蛋白溶液。2.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，所述沉淀剂是硫酸铵，所述硫酸铵加入到所述血浆中的终浓度为40%?80%。3.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，在所述蛋白沉淀溶解步骤中，所述水与所述蛋白沉淀的质量比为4.8?5.3:1。4.根据权利要求3所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，所述蛋白浓缩液与所述蛋白溶解液的体积比为1:8?11。5.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，所述第一磷酸盐缓冲液的磷酸盐浓度为18?21mM，pH为6.8?7.2，第二磷酸盐缓冲液的磷酸盐浓度为18?21mM，pH为6.8?7.2，所述柠檬酸盐缓冲液的柠檬酸盐浓度为18?21mM，pH为4.8?5.2。6.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，每升所述第二磷酸盐缓冲液中所述氯化钠为0.8?1.2mol。7.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，所述第一超滤膜的截留分子量为4.8?5KD，所述第二超滤膜的截留分子量为4.8?5KD。8.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，所述弱阴离子交换介质是二乙基氨基乙基离子交换介质;所述强阳离子交换介质是磺丙基离子交换介质。9.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白提取方法，其特征在于，在所述血液分离步骤中，先在所述新鲜牛血液中加入抗凝剂，再分离成所述血细胞和所述血浆，所述抗凝剂是柠檬酸钠，所述柠檬酸钠加入所述血液中的终浓度为3.8%。10.—种牛血清白蛋白，其特征在于，其由如权利要求1?9中任一项所述的牛血清白蛋白提取方法制得。
【文档编号】C07K1/34GK106065029SQ201610715134
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年8月24日
【发明人】熊川, 杨汝春, 邓飞
【申请人】成都远睿生物技术有限公司