基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于医药生物领域，涉及一种基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法及试剂盒。本发明公开了基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法及试剂盒，包含采集血液，分离血浆，纯化cfDNA的方法；设计胰腺癌特征热点突变区域的panel；PCR引物扩增，文库构建，高通量二代测序和数据分析的流程方法。本发明可以根据每个个体随着治疗的进行和病程发展，检测血浆cfD NA中胰腺癌特征突变类型、突变频率的动态变化，用来为胰腺癌病程监控和抗药的出现提供信息。
【专利说明】
基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法及试 剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于医药生物领域，涉及一种基于血浆CfDNA检测技术的无创胰腺癌多基 因检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，通常指胰腺管状腺癌，其起病隐匿、早期 诊断困难、进展迅速和易复发转移等特征导致临床治疗效果差，是目前预后最差的恶性肿 瘤之一，中位生存期约6个月，总体5年生存率为3~5%，严重威胁人类的健康，被称为"癌中 之王"。
[0003] 研究表明，人类癌症是由致癌基因和抑癌基因突变积累造成的，绝大多数的基因 突变都是没有功能或不是致病的突变，叫做"Passenger Mutation" ；少部分基因突变是具 有致癌功能，大部分肿瘤都共有的突变，叫做"Driver Mutation"。这一类型的突变是导致 肿瘤发生的主要原因，同时也是早期诊断和预警的重要分子标志物。
[0004] 随着基因组技术的不断发展进步，在胰腺癌基因组研究中已经发现了一些高频突 变，如导管腺癌中KRAS的体细胞突变率大于90%，它是胰腺癌中突变率最高的癌基因 。KRAS 突变主要集中在特定的密码子上(最常发现在12密码子），这被证实与胰腺癌的发展至关重 要。
[0005] 循环DNA又称游离DNA(cfDNA)，是一种存在于动、植物和人体液中的无细胞状态的 胞外DNA。目前，研究表明肿瘤患者血浆中游离DNA具有与肿瘤组织中DNA相一致的分子遗传 学改变(如基因突变、抑癌基因启动子高甲基化、微卫星不稳定和杂合性丢失等）。而在胰腺 癌的早期诊断及预警监控中，采集外周血比其他样本如胰液、肿块等更为简便、无创和广泛 适用。因此通过检测血浆中肿瘤cfDNA的突变成为胰腺癌早期诊断和预警研究的重要方向 之一。
[0006] 随着痕量DNA检测技术的不断进步和二代测序技术的迅猛发展，更加简便、经济、 高效的捕获测序技术被开发出来，以往疾病基因逐个筛查的传统模式(周期长、花费大、检 出率低)被颠覆，实现了"一次取样，全部筛查"的目标。基因捕获测序技术的优点在于充分 利用现二代高通量测序的优势，一次性捕获检测几十到几千种基因，上百万位点，不需要把 全部基因组测出来，就能把感兴趣的基因片段测出来。此外，该技术具有很高的敏感度。例 如，每个人类细胞中存在着数百个拷贝的线粒体DNA，传统的Sanger测序技术的检测下限为 10-15%，因此许多低丰度的线粒体异质性无法用传统技术检测出来。通过捕获测序技术可 以精确检测线粒体DNA中所有位点>2%以上的异质性。
[0007] 综上所述，本发明基于痕量DNA检测技术和二代测序技术提供了一种胰腺癌血浆 cfDNA多基因检测的方法，并根据自主设计的胰腺癌panel(基本涵盖了胰腺癌的高频突变 位点)开发成试剂盒。最终，根据检测血浆cfDNA中胰腺癌特征突变类型、突变频率的动态变 化，用来为胰腺癌病程监控和抗药的出现提供信息。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法。
[0009] 一种基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法，包括如下步骤：
[0010] ⑴分离血浆；
[0011] (2)纯化 cfDNA;
[0012] (3)将步骤(2)的DNAlOng与胰腺癌特征热点突变pane 1混合，进行单管多重PCR反 应来扩增目标基因；胰腺癌特征热点突变panel包括表1所示37个基因的特异性引物。
[0013] (4)文库构建；
[0014] (5)高通量测序；
[0015] ⑻数据分析。
[0016] 其中，
[0017]步骤（1)中：将全血加入含有抗凝剂的EDTA管中；将EDTA管2h内转入4°C冷冻离心 机中以1900g(3000rpm)离心10min，下层为血细胞，上层为血楽；，分别转移到EP管，存放于-80°C，保存。
[0018] 步骤（2 ) cf DNA纯化采用Gnomegen公司的纯化试剂盒（Circulat ing DNA Purification Kit)，应用磁珠纯化的技术从血衆中集中富集300bp以下的DNA片段。
[0019] 步骤（4)文库构建采用Gnomegen公司的建库试剂盒（DNA Seq NGS Library Preparation Kit For Amp1 icon Sequencing)。
[0020] 步骤(5)采用Ion torrent测序平台进行测序，Proton，读长为150bp，lOOOOx测序 深度。
[0021] 步骤(6)针对血浆游离DNA中的低频突变进行检测的生物信息学分析流程如下
[0022] 1.原始数据质检
[0023] 2.过滤
[0024] a)去除read 中的adapter 序列；
[0025] b)去除read 中的primer 序列；
[0026] c)去除含N碱基数大于整条reads的10%的reads;
[0027] d)去除 read 长度<50bp 的 reads;
[0028] e)去除低质量的reads:Q>20的碱基数不足reads总长的70% ;
[0029] 3.比对
[0030] 利用BWA工具将clean reads比对回参考基因组，BWA通过Burrows Wheeler转换将 基因组序列压缩并建立索引，再通过查找和回溯来定位读段，在查找时可通过碱基替代来 实现允许的错配；
[0031] 4.体细胞突变检测
[0032] 过滤掉血浆cfDNA样品和血细胞样本中均检出且频率相似的变异位点 [0033] 当频率〈10%时，频率差〈2%
[0034] 当频率>10%时，频率差〈1〇%。
[0035] 另外，本发明还提供了一种用于检测血浆cfDNA中胰腺癌多基因的引物组合(如表 1所示的上游引物的组合和/或下游引物的组合)及引物组合在制备无创胰腺癌多基因检测 试剂或试剂盒中的应用。
[0036]另外还提供了检测血浆cfDNA中胰腺癌多基因的检测试剂和检测盒。
[0037] 一种检测血浆cfDNA中胰腺癌多基因的检测试剂，含有用于检测血浆cfDNA中胰腺 癌多基因的引物组合(如表1所示的上游引物的组合和/或下游引物的组合）。
[0038] 一种检测血浆cfDNA中胰腺癌多基因的检测试剂盒，含有用于检测血浆cfDNA中胰 腺癌多基因的引物组合(如表1所示的上游引物的组合和/或下游引物的组合）。
[0039]下面对本发明做进一步的说明，基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检 测方法步骤：
[0040] (1)采集血液，分离血浆
[0041 ] 将全血加入含有抗凝剂的EDTA管中。将EDTA管2h内转入4°C冷冻离心机中以1900g (3000rpm)离心10min，下层为血细胞，上层为血浆，分别转移到EP管，存放于-80°C，保存。
[0042] (2)纯化 cfDNA
[0043] cfDNA纯化米用Gnomegen公司的Circulating DNA Purification Kit，应用磁珠 纯化的技术从血浆中集中富集300bp以下的DNA片段，更有效地去除大片段基因组DNA的污 染，尤其适用于从肿瘤病人血浆游离DNA中检测肿瘤相关基因突变信息的研究。具体流程按 照试剂盒说明书进行。
[0044] (3)胰腺癌特征热点突变panel，PCR引物扩增
[0045] panel覆盖5个基因的全外显子区和32个基因热点突变区（见表1)。并将每个样品 (约10ng DNA)和自主定制的引物混合，进行单管多重PCR反应来扩增目标基因。
[0046] (4)文库构建
[0047] 米用Gnomegen公司的DNA Seq NGS Library Preparation Kit For Amplicon Sequenc ing。具体流程按照试剂盒说明书进行。
[0048] (5)高通量测序
[0049] 采用Ion torrent测序平台进行测序，Proton，读长为150bp，10000x测序深度。
[0050] (6)数据分析
[0051]根据图1对血浆游离DNA中的低频突变进行检测的生物信息学分析流程，以保证检 测的准确度和灵敏度。
[0052]本发明公开了基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法及试剂和试 剂盒，包含采集血液，分离血衆，纯化cfDNA的方法;设计胰腺癌特征热点突变区域的panel; PCR引物扩增，文库构建，高通量二代测序和数据分析的流程方法。本发明可以根据每个个 体的血液随着治疗的进行和病程发展，检测血浆cfDNA中胰腺癌特征突变类型、突变频率的 动态变化，用来为胰腺癌病程监控和抗药的出现提供信息。
[0053]本发明公开了基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法及试剂盒， 包含采集血液，分离血浆，纯化cfDNA的方法;设计胰腺癌特征热点突变区域的panel;PCR引 物扩增，文库构建，高通量二代测序和数据分析的流程方法。本发明可以根据每个个体随着 治疗的进行和病程发展，检测血浆cfDNA中胰腺癌特征突变类型、突变频率的动态变化，用 来为胰腺癌病程监控和抗药的出现提供信息。
【附图说明】
[0054] 图1为本发明1-3号病人突变分布图。
【具体实施方式】
[0055] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的保护范围。
[0056] 本发明实施例中所需要的材料、试剂除特殊说明均可市场购得。
[0057] 实施例1
[0058]对来源于1-3号3例胰腺癌患者的全血（由浙江大学第一附属医院提供)分别进行 胰腺癌血浆cfDNA多基因检测试和肿瘤组织DNA的多基因检测，比较其一致性，判断血浆 cfDNA检出的突变是否能作为患者个体化的监测标志物。
[0059] 1.取材，分离
[0060] 1.1来源于1-3号3例胰腺癌患者的全血各5ml，将全血加入含有抗凝剂的EDTA管 中。将EDTA管2h内转入4°C冷冻离心机中以1900g(3000rpm)离心10min，下层为血细胞，上层 为血浆，分别转移到EP管，存放于-80°C，保存。
[0061] 1.2肿瘤手术组织各取30mg，直接放入EP管中立即在-80°c或者液氮冻存即可。
[0062] 2DNA的纯化、定量
[0063] 2.1 血衆cfDNA的纯化米用Gnomegen Circulating DNA Purification Kit，血细 胞基因组DNA的纯化采用Qiamp DNA Blood Mini Kit，具体流程按照试剂盒标准说明书进 行。纯化后的血浆游离DNA采用Qubit定量检测游离DNA的浓度。纯化后的血细胞基因组DNA 采用Qubit定量检测DNA的浓度。
[0064] 2.2肿瘤组织基因组0嫩的纯化采用如&8611〇嫩1^1^灯丨，具体流程按照试剂盒 标准说明书进行。纯化后的肿瘤组织基因组DNA采用Qubit定量检测DNA的浓度。
[0065] 3、目标基因 PCR扩增
[0066] 胰腺癌多基因检测试剂盒，包含胰腺癌特征热点突变pane 1的37个基因的特异性 引物，其中覆盖5个基因的全外显子区和32个基因热点突变区（见表1)。并将每个样品（约 10ng DNA)和自主定制的引物混合，进行单管多重PCR反应来扩增目标基因。
[0067] 表1:
[0073]
[0074] 4、文库构建和测序
[0075] 文库构建米用Gnomegen公司的DNA Seq NGS Library Preparation Kit For Amp 1 icon Sequencing进行。采用Ion torrent测序平台进行测序，Proton，读长为150bp， lOOOOx测序深度。
[0076] 5、生物信息学分析流程
[0077] 5.1原始数据质检
[0078] 5.2 过滤
[0079] f)去除read 中的adapter 序列；
[0080] g)去除read 中的primer 序列；
[0081 ] h)去除含附咸基数大于整条reads的10%的reads;
[0082] i)去除 read 长度<50bp 的 reads;
[0083] j)去除低质量的reads(Q>20的碱基数不足reads总长的70% )。
[0084] 5.3比对
[0085] 利用BWA工具将clean reads比对回参考基因组。BWA通过Burrows Wheeler转换将 基因组序列压缩并建立索引，再通过查找和回溯来定位读段，在查找时可通过碱基替代来 实现允许的错配。
[0086] 5.4体细胞突变检测
[0087] 比较肿瘤组织样品中检出体细胞突变与血浆cfDNA样品检出体细胞突变时，做了 以下过滤：
[0088] a).过滤掉肿瘤组织和血细胞样本中均检出且频率相似的变异位点。
[0089] 当频率〈10%时，频率差〈2%.
[0090] 当频率>10%时，频率差〈10%.
[0091 ] 2.过滤掉血浆cfDNA样品和血细胞样本中均检出且频率相似的变异位点。
[0092] 当频率〈10%时，频率差〈2%.
[0093] 当频率>10%时，频率差〈10%.
[0094] 6、数据解读和结果
[0095]体细胞突变检测报告
[0096]
[0097]
[0098]
[0099]
[0100]
[0101] 结论:发现血浆cfDNA中与肿瘤组织中的检出效果一致性，具有代替活检组织的效 果。
[0102] 突变分布图如附图1。
[0103] 临床意义(cfDNA中突变频率大于5%):
[0104] 病人 1 的个体化高频突变是FBXW7-chr4: 153249329A>G和MAP2K4-chrl7 : 12044664T>G两个位点，具有预后监测的价值。
[0105] 病人 2 的个体化高频突变是 81^^2-(：1^13:3291137认>6和41?1014-(31^1:27059176〇 >T两个位点，具有预后监测的价值。
[0106] 病人3的个体化高频突变是KMT2C-chr7:151879447T>A，具有预后监测的价值。
[0107] 研究价值:发现STK11基因上chrl9:1226599T>C突变位点具有影响其蛋白S419P的 改变，且为三个病人共有，具有研究价值。
【主权项】
1. 一种基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法，其特征在于，包括如下 步骤： (1) 分离血浆； (2) 纯化 cfDNA; (3) 将步骤(2)的DNAlOng与胰腺癌特征热点突变panel混合，进行单管多重PCR反应来 扩增目标基因；胰腺癌特征热点突变panel包括表1所示37个基因的特异性引物。 表1:(4) 文库构建； (5) 高通量测序； (6) 数据分析。2. 根据权利要求1所述的一种基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法， 其特征在于，步骤（1)中：将全血加入含有抗凝剂的Η)ΤΑ管中；将EDTA管2h内转入4 °C冷冻离 心机中以1900g (3000rpm)离心10min，下层为血细胞，上层为血浆，分别转移到EP管，存放 于-80°C，保存。3. 根据权利要求1所述的一种基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法， 其特征在于，步骤（2) cfDNA纯化采用Gnomegen公司的纯化试剂盒（Circulating DNA Purification Kit)，应用磁珠纯化的技术从血衆中集中富集300bp以下的DNA片段。4. 根据权利要求1所述的一种基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法， 其特征在于，步骤(4)文库构建采用Gnomegen公司的建库试剂盒(DNA Seq NGS Library Preparation Kit For Amp1 icon Sequencing)。5. 根据权利要求1所述的一种基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法， 其特征在于，步骤(5)采用Ion torrent测序平台进行测序，Proton，读长为150bp，ΙΟΟΟΟχ测 序深度。6. 根据权利要求1所述的一种基于血浆cfDNA检测技术的无创胰腺癌多基因检测方法， 其特征在于，步骤(6)针对血浆游离DNA中的低频突变进行检测的生物信息学分析流程如下1. 原始数据质检2. 过滤 a) 去除read中的adapter序列； b) 去除read中的primer序列； c) 去除含N碱基数大于整条reads的10 %的reads; d) 去除 read 长度 <50bp 的 reads; e) 去除低质量的reads :Q>20的碱基数不足reads总长的70% ;3. 比对 利用BWA工具将clean reads比对回参考基因组，BWA通过Burrows Wheeler转换将基因 组序列压缩并建立索引，再通过查找和回溯来定位读段，在查找时可通过碱基替代来实现 允许的错配；4. 体细胞突变检测 过滤掉血浆cfDNA样品和血细胞样本中均检出且频率相似的变异位点 当频率< 1 〇 %时，频率差< 2 % 当频率> 10 %时，频率差< 10 %。7. -种用于检测血浆cfDNA中胰腺癌多基因的引物组合，其特征在于，如表1所示的上 游引物和下游引物。8. 权利要求7所述引物组合在制备无创胰腺癌多基因检测试剂或试剂盒中的应用。9. 一种检测血浆cfDNA中胰腺癌多基因的检测试剂，含有权利要求7所述的引物组合。10. -种检测血浆cfDNA中胰腺癌多基因的检测试剂盒，含有权利要求7所述的引物组 合。
【文档编号】C12N15/11GK106065414SQ201610415898
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年6月15日 公开号201610415898.8, CN 106065414 A, CN 106065414A, CN 201610415898, CN-A-106065414, CN106065414 A, CN106065414A, CN201610415898, CN201610415898.8
【发明人】王伟林, 赵忻艺, 周东锴, 胡振华, 叶松, 孔阳
【申请人】浙江大学