一种木脂素类化合物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种木脂素类化合物及其制备方法和应用。木脂素类化合物的制法如下：（1）取热毒宁注射液成品，经HP?20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、25~35％乙醇、90～100％乙醇这三种溶剂进行洗脱，分别收集各洗脱液，浓缩，得到90～100％乙醇洗脱部位；（2）90～100%乙醇洗脱部位，依次经硅胶柱色谱，ODS柱色谱分离，半制备液相色谱分离，得到本发明化合物。本发明所述化合物可用于抗甲型流感病毒H1N1或H3N2。本发明从热毒宁注射液成品中提取得到一种新的木脂素类化合物，该化合物具有较为显著的抗病毒作用；同时，本发明公开的木脂素类化合物的制备方法操作简单，可控性强，稳定性好。
【专利说明】
-种木脂素类化合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明设及医药技术领域，特别设及一种新化合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 热毒宁注射液（国药准字Z20050217)为江苏康缘药业股份有限公司自主研发的原 中药二类新药，属中药复方注射剂，由金银花、檐子和青葛Ξ味中药精制而成，具有清热、疏 风、解毒的功效，临床上主要用于治疗外感风热所致的感冒、咳嗽、上呼吸道感染、急性支气 管炎等症，其临床疗效确切、效果显著。
[0003] 前期对热毒宁注射液中的化学成分已进行了深入的研究，但主要发现的是咖啡酷 奎宁酸类成分和环締酸祗类成分，通过体内外实验证实了咖啡酷奎宁酸类成分具有较好抗 病毒作用，但是本专利公开的新化合物及其抑制甲型流感病毒H1N1/H3N2的作用还未见诸 报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的首要目的在于提供一种新的木脂素类成分。
[0005] 本发明的另一目的在于提供一种制备上述新的木脂素类化合物的方法。
[0006] 本发明的再一目的在于提供上述新的木脂素类成分作为制备抗病毒药物的用途。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种新的木脂素类化合物，其结构如式I所 示：
(I)。
[000引本发明所述的木脂素类化合物是研究人员在热毒宁注射液中发现的新化学成分， 并且发现此化合物在各批次的热毒宁注射液中均稳定存在。经查阅文献得知，运是首次在 热毒宁注射液中发现并鉴定出的新的化学成分，并经过Scifinder scholar检索发现该化 合物为新化合物。
[0009]本发明还提供了上述木脂素类化合物的制备方法，包括如下步骤： (1) 取热毒宁注射液成品，经HP-20大孔吸附树脂色谱柱分离，依次W水、25~35%乙醇、 90~100 %乙醇运Ξ种溶剂进行洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱 部位、25~35%乙醇洗脱部位、90~100%乙醇洗脱部位； (2) 取步骤（1)的90~100%乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱， 收集氯仿-甲醇比例为95: 5的馈分B，馈分B经0DS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收集甲 醇-水比例为6:4的馈分C，馈分C经半制备液相色谱分离，得到结构如式(I)所示的本发明化 合物。
[0010]上述制备方法中，步骤(2)所述半制备液相色谱，优选W比例为30:70的乙腊-水为 流动相，检测波长为254 nm，流速4 mL/min，在半制备液相上的保留时间为13.2 min。
[00川发明人通过理化性质和现代波谱学手段化0、]?5、1护醒1?、1化-醒巧日20-醒1〇对上 述方法分离得到的化合物进行了结构鉴定，证实其为结构如式(I)所示的新化合物。
[0012] 本发明的另一个目的在于提供一种式（I)所示化合物在制备治疗甲型流感病毒 H1N1或H3N2感染药物中的应用。发明人发现本发明化合物对甲型流感病毒H1N1或H3N2有一 定的抑制作用。
[0013] 本发明还提供了一种用于治疗甲型流感病毒H1N1或H3N2感染的药物，包括式（I) 所示化合物。
[0014] 本发明还提供了一种抗甲型流感病毒H1N1或H3N2感染的药物组合物，含有治疗有 效量的上述式(I)化合物W及一种或多种药学上可接受的载体。
[0015] 所述的药物组合物是药剂学上所说的任何一种剂型，包括片剂、胶囊剂、软胶囊、 凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳 剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。
[0016] 上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如:稀释剂、赋形 剂和水等，填充剂如淀粉、薦糖，乳糖、微晶纤维素等;粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶 和聚乙締化咯烧酬;润湿剂如甘油；崩解剂如簇甲基淀粉钢，径丙纤维素，交联簇甲基纤维 素，琼脂、碳酸巧和碳酸氨钢;吸收促进剂如季锭化合物;表面活性剂如十六烧醇，十二烷基 硫酸钢;吸附载体如高龄±和皂粘上;润滑剂如滑石粉、硬脂酸巧和儀、微粉硅胶和聚乙二 醇等。另外还可W在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
[0017] 本发明相对现有技术具有如下的优点及有益效果：（1)提供了一种结构新颖的木 脂素类化合物；（2)运用体外抗甲型流感病毒等活性筛选体系进行活性评价，发现本发明的 化合物能有效地抑制甲型流感病毒H1N1或H3N2,表明本发明化合物具有预防和治疗甲型流 感病毒化N1或H3N2病毒感染的作用，具有良好的研究开发前景。
【附图说明】 [001 引 图1为本发明化合物的HR-ESI-Q-T0F-MS; 图2为本发明化合物的iH-NMR谱； 图3为本发明化合物的"C-NIR谱与肥PT-135谱； 图4为本发明化合物的Hi-Hi COSY谱； 图5为本发明化合物的HMB幻普； 图6为本发明化合物的C的普； 图7为本发明化合物的HSQ幻普； 图8为本发明化合物的主要HMBC相关和h1-h1 COSY相关； 图9为本发明化合物的R0SEY谱。
【具体实施方式】
[0019] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对 本发明作进一步的详细说明。
[0020] 实施例1，本发明化合物的制备 (1) 取热毒宁注射液成品，经HP-20大孔吸附树脂色谱柱分离，依次W水、25~35%乙醇、 90~100 %乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、25~30 %乙醇 洗脱部位、90~100%乙醇洗脱部位； (2) 取步骤(1)的90~100%乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收 集氯仿-甲醇比例为95:5的馈分B 1.8 g，馈分B经0DS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收 集甲醇-水比例为6:4的馈分C 95 mg，馈分C经半制备液相色谱分离，W比例为30:70的乙 腊-水为流动相，检测波长为254加 1，流速4 mL/min，在半制备液相上的保留时间为13.2 min，分离所得溶液干燥，得到本发明化合物11.3 mg。
[0021] 实施例2,取实施例1制得的本发明化合物，进行如下结构鉴定 本化合物为黄色无定型粉末，ESI-MS (positive)给出m/z 411 [M+Na] +，ESI-MS (negative)给出m/z 387 [M-H]-，提示化合物分子量为388。皿-ESI-Q-TOF-MS给出 m/z 411.1422 [M+Nar(计算值为411.1420)(见图l)，确定化合物分子式为C2l出407，计算不饱 和度为10。
[0022] 本化合物的的iH-NMR (400 MHz, in CD30D)图谱（见图2)，显示了21个氨信号， 4个芳香氨信号[《6.65 (1H, S, H-2')，6.64 (1H, d, /=1.6 Hz, H-2), 6.69 (1H, d, /= 8.0 Hz, H-5)，6.40 (IH, dd，/= 1.6，8.0 Hz, H-6)]，推测结构中可能存在 1 个五取代苯环和1，3, 4-Ξ取代苯环的结构;3个单峰的甲氧基氨信号[《3.90 (3H，s)， 3.37 (3H, S), 3.77 (3H, S)]，提示其可能与苯环相连。Uc-NMR (lOOMHz, in CD3OD)结 合DEPT-135图谱（见图3)共显示21个碳信号，包括8个季碳信号（《149.3，148.8， 148.1，145.9，140.9，138.3，131.9，123.7),4个芳香次甲基碳信号（《121.7， 115.8，113.2，107.1)，2个亚甲基碳信号（《71.3, 62.8) W及3个甲氧基碳信号（《 59.9, 56.8, 56.4)。
[0023] 在 1h-1h COSY谱（见图4)中，H-7/H-8/H-9，H-7'/H-8'/H-9'之间具有明显的相关 信号，结合HMBC谱（见图5)，可见H-7' (δ 4.76VC-8，2'，6'，9'，H-8 (δ 2.53)/ C-1, 6^, ?/，y及Η-2^ (δ 6.65)/ C-3/，少，0/，之间的HMBC远程相关，提示化合物中含 有一个取代的芳香四氨糞环。此外，H-2, 6与C-7，H-8与C-1的HMBC相关，证明芳香四氨糞环 与3-甲氧基-4-径基苯环相连接。关键的HMBC相关峰H-7/ (δ 4.76VC-9提示C-9与C-7/通 过酸键相连形成五元环。通过ΗΜΒ幻普，可知δ 3.90的甲氧基位于C-3M立，δ 3.37的甲氧基位 于(：-5/位，5 3.77的甲氧基位于(：-3位。结合分子式，推断(：-4/、(：-4和(：-9/位被径基取代。
[0024] 通过禪合常数(/7,8= 2.0 Hz)判断化合物8的Η-7与Η-8处于顺式。化合物的CD谱 (见图6)中，288 nm ( 4 -0.02)显示负的Cotton效应，与文献进行对比，确定化合物的 绝对构型为7S, 8S, 7'R, 8'S。综合 1h-1h C0SY、HSQC (见图7)、R0SEY (见图9)和HMBC谱 信息，对化合物的全部碳信号和氨信号进行了归属（见表1)。经过SciFinder Scholar网 络检索，未发现相关报道，表明化合物为一个新的木脂素类化合物，命名为japonicaside D。
[0025] 表1化合物的核磁数据（気代甲醇，iH-NMR 400 MHz, "C-NIR lOOMHz)
实施例3,本发明化合物体外抗HlNl和H3N2检测 1. 材料 1.1毒株甲型流感病毒(A/Human/Hubei/2005 H3N2)和甲型流感病毒(A/PR/8/：34 化N1 )，中国科学院武汉病毒所传代保存； 1.2细胞模型狗肾细胞系MDCK,本实验室传代保存。培养条件：DMEM+10%胎牛血清， 37°C,5% C02； 2. 原理和方法 2.1药物的细胞毒性检测 实验原理:alamarBlue ?是一种氧化还原指示剂，能根据代谢活性产生吸光度变化和 巧光信号。alamarBlue ?易溶于水，其氧化形式进入细胞后经线粒体酶还原产生可测量的 巧光及颜色变化，用于细胞活性和细胞增殖的定量分析W及体外细胞毒性研究。运种测定 是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成巧光和比色指示剂的能力，受损和无活性细胞具 有较低的天然代谢活性，对应的信号较低。因此巧光信号强弱，可w反映细胞活性的高低。
[0026] 方法步骤:MDCK细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。将药物从起始浓 度80 μΜ连续3倍梯度稀释6个梯度。加药培养后，光镜下观察药物引起的细胞病变效应 (CPE)，加入alamarBlue ?，37 °C解育化，巧光检测alamarBlue ?的还原情况，激发光570nm， 发射光595nm。
[0027] 细胞活性(％)=(样品孔-空白对照)/ (细胞对照-空白对照)* 100%。
[0028] 药物对化N1和册N2的抑制试验 鉴于基于病毒引起的细胞病变效应检测不够灵敏和不便于定量分析。我们采用检测 流感病毒神经氨酸酶活性来代表病毒的复制水平，是更为准确和可定量的方法。
[0029] 实验原理:流感病毒神经氨酸酶(NA)，又称唾液酸酶，是一种表面糖蛋白，具有酶 活性，对A、B型流感病毒的复制有重要作用。它可W裂解细胞表面流感病毒受体末端的唾液 酸残基，帮助子代病毒粒子的释放，并防止病毒粒子聚集，促进病毒的扩散。神经氨酸酶是 抗流感病毒药物研发的重要祀点。本实验室采用MUNANA作为底物检测流感病毒NA活性。 MUNANA(4-methylumbelliferyl-α-N-acetyl-neuraminate)是流感病毒NA的特异性底物， 在NA作用下产生的催化产物在3 5 5nm激发光照射下，可W产生46化m巧光，巧光强度的变化， 可W灵敏反映神经氨酸酶活性。病毒感染细胞并加药培养一定时间后，取培养液上清进行 神经氨酸酶活性检测，在反应底物过量时，酶促反应的速度与酶浓度是呈正比的，所W根据 此原理可W检测NA酶活来反映上清中病毒粒子的滴度。
[0030] 方法步骤： (1) 细胞铺板:将MDCK细胞接种于96孔细胞培养板中备用； (2) 病毒感染细胞:药物从2倍最高测试浓度起连续3倍梯度稀释6个梯度;将孔板中培 养基弃去，同时加入药物和病毒液于细胞孔中，37°C细胞培养箱中解育Ih后，弃上清培养 基，PBS洗涂后，再次加入梯度稀释药物。置于37°C细胞培养箱培养48h，辅W观察细胞病变 (CPE)。取培养液上清进行神经氨酸酶活力检测； 实验设空白对照孔(正常细胞），酶活对照孔(病毒感染后未加药物孔），阳性药物对照 孔(感染后加利己韦林）； (3) 神经氨酸酶活性检测：实验操作:96孔黑色微量板中加入2化L底物(MUNANA)，吸取 病毒培养液4化L上清加入孔板中，避光置于37°C解育60min，加入10化L终止液/孔终止反 应，多功能检测仪上测定巧光值。激发波长为:355nm，发射波长485nm。计算各检测孔中NA被 抑制率； 抑制率(％)=1〇〇-(样品孔-空白对照)/(酶活对照-空白对照)*1〇〇%。
[0031 ]实验结果 3.1药物样品对MDCK细胞的毒性检测及对H1N1抑制活性检测 药物样品稀释所用溶剂，最高溶解浓度，最高测试浓度，CC50，EC50 W及SI (选择指数)如 表2所示。
[0032] 表2实验结果
注：，未检测到明显细胞毒性，其CCSQ值大于最大测试浓度 3.2药物样品对MDCK细胞的毒性检测及对H3N2抑制活性检测 药物样品稀释所用溶剂，最高溶解浓度，最高测试浓度，CC50，EC50 W及SI (选择指数)如 表3所示。
[0033] 表3实验结果
注：，未检测到明显细胞毒性，其CC5Q值大于最大测试浓度 4.结论 本发明化合物无细胞毒性，其抗甲型流感病毒H1N1和H3N2的SI值分别为大于12.20和 11.48，显示其对甲型流感病毒化N1和册N2具有一定的抑制作用。
[0034] 实施例4, 一种用于治疗病毒感染的药物组合物 采用实施例2所制得的结构式（I)所示的木脂素类化合物，加上药学上可接受的载体， 制成药物组合物。所述的载体选自稀释剂、赋形剂、水、填充剂粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收 促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、香味剂或者甜味剂等中的至少一种。
[0035] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W做出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种木脂素类化合物，其结构如式I所示：2. -种如权利要求1所述的木脂素类化合物的制备方法，其特征在于，包括W下步骤： (1) 取热毒宁注射液成品，经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次W水、25~35%乙醇、 90~100 %乙醇运Ξ种溶剂进行洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱 部位、25~35%乙醇洗脱部位、90~100%乙醇洗脱部位； (2) 取步骤（1)的90~100%乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱， 收集氯仿-甲醇比例为95: 5的馈分B，馈分B经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收集甲 醇-水比例为6:4的馈分C，馈分C经半制备液相色谱分离，得到结构如式(I)所示的目标产物 木脂素类化合物。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述半制备液相色谱，W比例 为30:70的乙腊-水为流动相，检测波长为254 nm，流速4 mL/min，在半制备液相上的保留时 间为 13.2 min。4. 权利要求1所述化合物在制备抗病毒感染药物中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述抗病毒药物为用于抗抗甲型流感病毒 化N1或册N2感染的药物。6. -种用于治疗病毒感染的药物，其特征在于：该药物包含权利要求1所述的、或者权 利要求2或3所述制备方法制得的结构如式(I)所示的木脂素类化合物。7. 根据权利要求6所述的用于治疗病毒感染的药物，其特征在于:所述的病毒感染为抗 甲型流感病毒化N1或册N2感染。8. -种用于治疗病毒感染的药物组合物，其特征在于：该药物包含权利要求1所述的、 或者权利要求2或3所述制备方法制得的结构如式（I)所示的木脂素类化合物，W及药学上 可接受的载体。9. 根据权利要求8所述的用于治疗病毒感染的药物组合物，其特征在于:所述的病毒感 染为抗甲型流感病毒化N1或H3N2感染。
【文档编号】C07D307/00GK106083770SQ201610415635
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月14日 公开号201610415635.7, CN 106083770 A, CN 106083770A, CN 201610415635, CN-A-106083770, CN106083770 A, CN106083770A, CN201610415635, CN201610415635.7
【发明人】萧伟, 李海波, 姚新生, 于洋, 房卉, 李梦璇, 孟兆青, 黄文哲, 丁岗, 王振中, 胡晗绯
【申请人】江苏康缘药业股份有限公司