一种检测癌细胞内硫化氢的荧光探针的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测癌细胞内硫化氢的荧光探针，该荧光探针为含有生物素基团的萘酰亚胺衍生物。本发明的荧光探针易于制备成本低廉，且具有高特异性，可快速检测溶液环境的硫离子，检测过程不会受其他组分的干扰，可用于活癌细胞中硫化氢的测定，具有广阔的应用前景。
【专利说明】
一种检测癌细胞内硫化氢的荧光探针
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于癌细胞内硫化氢的新型荧光探针及其应用，属于分析化学技 术领域。
【背景技术】
[0002] 硫化氢继一氧化氮和一氧化碳之后发现的第三种新型内源性气体信号传递分子， 可在生命体系内发挥重要生理作用的气体信号分子，在心血管系统、神经系统和免疫系统 中参与多种病理、生理过程。硫化氢能够对人体和动物体的健康产生极大的伤害，易造成 人神经系统和大脑等组织的损伤，吸食过量的硫化氢会出现头痛、头晕、乏力、恶心等症状， 严重将会导致死亡。硫化氢作为心血管系统生理性的血管舒张因子和血压调节因子，通过 调节血管张力、抑制血管重塑以及作用于心脏的负性肌力，在高血压的产生发展中有着重 要的意义，同时还可以缓解缺血性再灌注损伤、负性调节心脏代谢消耗和改善心肌氧化应 激损伤，起到保护心脏的作用。体内硫化氢浓度的异常与阿兹海默症、心血管疾病、癌症等 重大疾病密切相关，因此实时快速检测生物体内硫化氢浓度具有很重要的意义。
[0003] 近期研究报道，结肠癌细胞等许多癌细胞的生长依赖硫化氢，没有硫化氢，肿瘤生 长将变得缓慢。以结肠癌细胞为例，大部分的结肠癌硫化氢生成都与一种叫做CBS(胱硫 醚-β-合成酶，cystathionine-P-synthase)的蛋白有关。相比于非癌性组织，结肠癌细胞中 CBS蛋白的水平要高得多。采用化学方法阻断CBS活性时，结肠癌细胞的生长会受到明显 的遏制，而正常细胞生长则不受影响。将患者来源的结肠癌肿瘤细胞植入到裸鼠体内时，同 样观察到了阻断CBS所造成的抗结肠癌效应。没有硫化氢存在的条件下，肿瘤生长变得非 常缓慢。因此，对癌细胞内的硫化氢进行实时快速检测对肿瘤的预防和诊断具有重要意义。
[0004] 荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单等优点，而且对细 胞基本没有损伤，已经广泛用于各种生物小分子的检测。目前，用于检测细胞内硫化氢的荧 光探针也得到了迅速发展。但是，目前报道的硫化氢荧光探针大都不具备癌细胞靶向，不能 区分癌细胞和正常细胞，一般对所有细胞都有相应。因此开发新的具有高选择性、高灵敏 度、光稳定性及透膜性好，且具有癌细胞靶向的硫化氢荧光探针具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种新型检测癌细胞内硫化氢 的型荧光探针及其应用。
[0006] 本发明所述的新型检测癌细胞内硫化氢的荧光探针为含有生物素基团的萘酰亚 胺衍生物，其特征在于:所述荧光探针的化学结构通式如式（I)所示，其中生物素部分具有 癌细胞靶向性，叠氮基团为硫化氢响应位点：
式(?) 本发明所述的荧光探针的制备方法为:将式（Π )所示的化合物a (1 mmol)、叠氮化钠 (1 mmol)和N，N-二甲基甲酰胺（5 mL)加入到50 mL单口烧瓶中，90°C下加热5小时。冷却至 室温，加入到水中，过滤，烘干。将所得固体进行柱层析纯化，得到浅黄色产物即为本发明所 述检测癌细胞内硫化氢的荧光探针。
[0007] 式（Π ) 本发明所述的荧光探针在检测癌细胞内硫化氢的应用。
[0008] 本发明所述的荧光探针可应用于癌细胞内硫化氢的检测评价。该探针作为癌细胞 硫化氢的特异性探针，在硫化氢存在的环境下，可以将叠氮还原为氨基，生成具有高荧光发 射能力的荧光物质，通过检测不同的荧光强度来测定癌细胞内的硫化氢。
[0009] 具体测定方法为:室温条件下，配制5 μΜ荧光探针乙醇溶液，加入到具有不同浓度 的硫化钠溶液系中，测定溶液荧光强度作为硫离子浓度的评价指标。
[0010] 本发明所述的荧光探针在硫化氢存在的条件下，萘酰亚胺荧光团的叠氮部分将被 还原为氨基，此时荧光探针可以发射萘酰亚胺荧光团的绿色荧光(峰值约为544 nm)。同时， 由于生物素具有癌细胞靶向性，可以将癌细胞和正常细胞区分，因此该荧光探针可以用于 检测癌细胞内的硫化氢。可采用荧光检测器实现产物的快速灵敏检测;检测条件为:激发波 长为440 nm，在520~700 nm之间进行荧光发射光谱的检测。
[0011]荧光探针在生物成像应用研究主要内容有探针对活细胞的毒性、染色能力、活细 胞和活组织荧光成像。采用MTT比色法，通过分析细胞在加入荧光探针之后的存活率，讨论 荧光探针对细胞的毒性。在此基础上，应用本发明所述的荧光探针对活癌细胞内的硫化氢 进行快速检测。
[0012]本发明的有益效果为： 本发明所述的检测癌细胞内硫化氢的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易 行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。
[0013] 本发明所述的检测癌细胞内硫化氢的荧光探针具有高特异性，在进行相应硫化氢 检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活癌细胞内硫化氢的实时测定，具有广阔的应用 前景。
[0014] 本发明所述的检测细胞内硫化氢的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱 特性(520~700 nm)，可以实现对细胞中的硫化氢快速准确检测的目的。
[0015]
【附图说明】
[0016] 图1是荧光探针的咕NMR图谱。
[0017]图2是荧光探针在不同浓度硫化钠条件下的荧光光谱。
[0018] 图3是荧光探针与硫化钠浓度的线性关系数据。
[0019] 图4是荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱。
[0020] 图5是荧光探针在活细胞中的成像应用。
[0021] A图：只加10 μΜ探针的细胞明场照片;B图：只加10 μΜ探针的细胞绿色通道荧光照 片;C图:Α图和Β图的叠加照片;D图：加入10 μΜ探针和50 μΜ硫化钠的细胞明场照片;Ε图：加 入10 μΜ探针和50 μΜ硫化钠的细胞绿色通道荧光照片;F图：D图和Ε图的叠加照片。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明保护内容不仅限于此。 [0023] 实施例1 检测癌细胞内硫化氢的荧光探针的制备 将式（Π )所示的化合物a (1 mmol)、叠氮化钠 (lmmol)和Ν，Ν-二甲基甲酰胺（5 mL)加 入到50 mL单口烧瓶中，90°C下加热5小时。冷却至室温，加入到水中，过滤，烘干。将所得固 体进行柱层析(二氯甲烷：甲醇=10:1 )纯化，得到黄色产物，即为本发明所述检测癌细胞 内硫化氢的荧光探针，产率63%。
[0024] 上述检测癌细胞内硫化氢的荧光探针的1H NMR图谱见图1。
[0025] 实施例2 荧光探针在不同硫化钠浓度下的荧光光谱 本专利采用硫化钠在水溶液中供应硫化氢。预先准备10份5mL的5 μΜ探针缓冲溶液， 含5%甲醇，所加入的硫化钠浓度为0到150 μΜ。然后进行荧光检测(λΕχ= 440 nm);计算各体 系中荧光强度;通过分析544nm处的荧光强度与硫化氢浓度的关系，评估该探针对硫化钠的 响应性能(见图2和图3)。图2表明，随着硫化钠浓度的增大，溶液的荧光强度逐渐增强。图3 表明，当硫化钠浓度在40~90 μΜ范围内，溶液的荧光强度和硫化钠的浓度呈较好的线性关 系，可采用公式Υ = 6.07 * X - 28.0表示，其中Υ为544nm出的荧光强度，X为硫化钠的浓 度。
[0026] 实施例3 荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱 预先准备10份5mL的5 μΜ探针缓冲溶液(含5%甲醇，pH = 7.4)，然后分别向该体系中 依次加入50 度为200 μΜ的Hcys、Na2S、Na2S〇3、NO、H2〇2、HCl〇4、Cys、GSH、NaN〇2、VC等小 分子的PBS溶液。然后进行荧光检测(λΕχ= 440 nm);计算各体系中荧光强度;评估该不同物 质对荧光探针溶液的干扰性(见图4)。从图中看出，当然探针溶液中加入Hey s、Na2S、Na2S03、 勵、出02、!1(：1〇4、〇78、63!1、似勵 2、￥(：等小分子时，只有硫化钠可以导致溶液产生显著的荧光， 而加入其他小分子时溶液的荧光基本没有变化，这表示该探针只对硫化钠有响应，而不受 其他小分子的干扰。 实施例4 荧光探针在活细胞中的成像应用 将He la细胞放在培养基(DMEM培养液和10%胎牛血清）中，放置于条件为37 °C、5% C02和 20% 02的培养箱中培养24 -48h。用微量进样器吸取本发明所述荧光探针（10 μΜ)注入含有 Hela细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min。加入100 μΜ硫化钠溶液，继续培养30 min。之后用PBS (磷酸盐缓冲溶液)冲洗培养细胞3次，进行荧光成像。
[0027] 结果见图5。从A、B和C图中看出，只加入探针时，细胞基本没有荧光;从D、E和F图中 看出，加入10 μΜ探针和50μΜ硫化钠之后，细胞产生明显的荧光，这表示该探针可用于检测 癌细胞中的硫化氢。
【主权项】
1. 一种检测癌细胞内硫化氨的新型巧光探针，其特征在于，其为含有生物素基团的糞 酷亚胺衍生物，所述巧光探针的化学结构通式如式α)所示：式(!)。2. 根据权利要求1所述的检测癌细胞内硫化氨的巧光探针，其特征在于:采用如下方法 制备而成：将1 mmol式（Π )所示的化合物a、1 mmol叠氮化钢和5 mL Ν,Ν-二甲基甲酯胺 加入到50 mL单口烧瓶中，90 °C下加热5小时;冷却至室溫，加入到水中，过滤，烘干，柱层析 纯化，得到浅黄色产物即为本发明所述检测癌细胞内硫化氨的巧光探针；
【文档编号】G01N21/64GK106083888SQ201610541898
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】林伟英, 董宝利, 宋学真, 孔秀琪, 王超
【申请人】济南大学