一种二膦酸化合物及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种二膦酸化合物，具有式Ⅱ的结构：其中，R1为H、OH或者卤素，R2是烃基基团M，烃基基团M结构是线性的、具有支链的、环的或具有芳香族环的，该烃基基团M具有1～20个碳原子；R3是?H、?OH、?CN或具有1～20个碳原子的烃基基团N。本发明提供了一种新型二膦酸盐化合物对老年骨质疏松患者，可使骨细胞的骨形成和骨破坏维持一个较为理想的动态平衡。
【专利说明】
一种二麟酸化合物及其制备方法与应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种新的二膦酸化合物，以及制备所述新的二膦酸盐化合物的方法， 属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松症(osteoporosis，0P)是一种以骨量低下、骨微结构损坏，导致骨脆性增 加，易发生骨折为特征的全身性骨病。目前骨质疏松症在全球常见病、多发病中居第7位，患 者总数超过2亿人，我国超过9000万人患不同程度骨质疏松，60岁以上老人骨质疏松患病率 约 50 % ~60 %。
[0003] 二膦酸已被广泛应用于治疗骨质疏松症、恶性肿瘤相关性疾病如高钙血症和骨痛 症、变形性骨炎等代谢性骨病。二膦酸分子基本结构为由两个膦酸根与一个中心碳原子连 接，基本的P-C-P结构(式1)可取代骨内的Ρ-0-Ρ结构，成为在体内不易被酶分解的化合物， 不发生生物降解。
[0004]
[0005] 在式1结构中，其中心碳原子上有两个可变的侧链(R'、R〃），通过改变这些侧链的 化学修饰来增加骨亲和力和抗骨重吸收的强弱。二膦酸是一类主要用于增加骨质疏松患者 骨量、减少骨折危险、减缓Paget's病骨转换、治疗肿瘤骨转移并对癌症患者升高的血钙水 平有降低作用的药物。二膦酸应用和发展前景十分广阔，但是仍有很多亟待研究和解决的 问题。主要有：
[0006] 1、二膦酸治疗骨质疏松主要是通过抑制破骨细胞的活性达到治疗目的，但其对成 骨细胞的促进作用却不明显，这导致患者长期治疗后会引起骨脆性增加，增加骨折的风险。 因此增强二膦酸对成骨细胞的促进作用是必要的；
[0007] 2、目前上市的二膦酸长期服用都会存在一定的肝、肾毒性等毒副作用，因此开发 具有高效、低毒、副作用小的二膦酸是广大骨质疏松患者的福音并且应用前景广阔。
[0008] 硒是人体必须的微量矿物营养元素，常取代含硫氨基酸中的硫而成为含硒氨基 酸，参与体内的正常生理生化过程。最常见的含硒氨基酸为硒蛋氨酸和硒半胱氨酸。硒可以 通过改善钙磷代谢增加血钙含量和骨钙沉积、减少骨盐分解，降低机体对铝的吸收，对高铝 引发的骨质疏松有一定的保护作用，因而降低骨质疏松的发生和发展。补硒可使机体的抗 氧化能力得到优化，从而降低发生动脉粥样硬化、癌症和骨质疏松的可能性。此外，硒蛋白 对于骨代谢十分重要，缺硒往往同骨量减少以骨关节病密切相关。骨质疏松患者血清中谷 胱甘肽过氧化物酶以及其它抗氧化物质含量也较对照组低。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于针对现有技术中的二膦酸药物所存在的毒副作用问题，结合二 膦酸类药物和硒元素，开发出一种新的含硒烷基的二膦酸盐，同时兼顾二膦酸独特的抗骨 质疏松活性和硒的抗氧化能力。该新型化合物具有更好的抗骨质疏松活性和更佳的生理效 应，同时对肝肾等器官的毒副作用更小。
[0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0011] -种二膦酸化合物，具有式π的结构：
[0012]
[0013] 式中，
[0014] 办为!1、0!1或者卤素。
[0015] R2是烃基基团M，烃基基团Μ结构是线性的、具有支链的、环的或具有芳香族环的， 该烃基基团Μ具有1~20个碳原子。烃基基团Μ任选地被一个或多个独立选自!1、-0?3、-卩、-(：1、-31?、4(1〇 2、-3021?和-01?的基团取代。显然，烃基基团1应该是二价烃基基团。当烃基基团 Μ上的取代基团为Η的时候，等价于烃基基团Μ没有其他的取代基，即烃基基团可以是没有被 取代的烃基基团。
[0016] R3是-H、-〇H、-CN或具有1~20个碳原子的烃基基团Ν，该烃基基团Ν是线性的、支链 的、环的或芳香族的烃基基团。其中，烃基基团N具有1~20个碳原子。烃基基团N任选地被一 个或多个选自^? 3、4、-(：1、-31?、4(1〇2、-3021?和-01?的基团取代。当烃基基团~上的取代 基团为Η的时候，等价于烃基基团N没有其他的取代基。
[0017] 优选的，烃基基团Μ和烃基基团Ν可以是C1-C6的烷基、C1-C6的烯基、C1-C6的炔基， C5-C7的杂环或芳环，所述的杂环基团可以包含1~4个独立的选自氮、硫和氧的杂原子，以 使得这些杂环或者杂芳环的单一杂原子的数量至少为2。
[0018] 所述的取代基R各自独立的选自：氢原子、-C00R'、-C0R'、-C0N(R'）2，C1~C1(^^^ 基、Cl~CIO的取代烷基、C2~C6的烯基、C2~C6的取代烯基、C2~C6的炔基、C2~C6的取代 炔基、芳基或取代芳基；
[0019]其中，R'各自独立地选自：氢、C1~C6的烷基、芳基、取代基R"取代的C1~C6的烷基 或取代基R"取代的芳基；
[0020] 其中，取代基R"独立地选自-OH、卤原子、-NH2、-CN、C1-C4的烷基，C2-C4的烯基。 [0021] 优选的，还可以进一步的优选取代基R为：Η、-C00H、-⑶0CH3、-COOC2H 5、-C00C3H7、_ COOC4H9、-COOCH2X、-COOC2H4X、-C0H、-COCH3、-COC2H5、-COC3H7、-C0C6H5、-⑶CH 2X、-COC2H4X、- CONH (CH3)、-CON (CH3) 2、-CON (CH3) C2H5、-CON (C2H5) 2、-CON (CH3) C3H7、-CON (C2H5) C3H7、甲基、 乙基、丙基、丁基、卤取代甲基、卤取代乙基、卤取代丙基、卤取代丁基、乙烯基、丙烯基、丁烯 基、齒取代乙烯基、齒取代丙烯基、齒取代丁烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、苯基、甲基苯基、 乙基苯基、丙基苯基、二甲基苯基、三甲基苯基、甲乙基苯基、二乙基苯基、甲丙基苯基、卤取 代苯基、氣基苯基、氛基苯基等。其中X为卤素原子。
[0022]进一步，所述的化合物中，RAH或0H。
[0023]进一步，所述的化合物中，为卤素。优选的，R^F、Cl、BrSl。
[0024] 进一步，所述的式Π 化合物，在办中，烃基基团Μ是具有1-10个碳原子的烃基基团。 最好是具有1-5个碳原子的烃基基团，其上至少有1个氨基或N(R) 2取代基。此N(R)2基团上的 取代基R表示以支链、线性、环状、芳香族、杂环或者芳杂环的构型存在的具有1~12单元组 的烷基基团、或者氢。两个R基团之间相互独立，互不影响。进一步的，取代基R选择范围与上 述取代基R的选择范围一样。
[0025] 进一步，所述的化合物中，烃基基团Μ多个N(R)2基团取代。
[0026] 进一步，所述的化合物中，烃基基团Μ是带支链的烃基基团，且烃基基团Μ具有1~5 个碳原子，其上至少有1个氨基或N(R) 2取代基。此N(R)2基团上的取代基R选择范围与上述R 取代基的选择范围一样。
[0027]进一步，优选的所述的办为以下基团之一 ：1_氨基-1，2-亚乙基，1-氨基-1，3-亚丙 基，氨基亚甲基，二甲氨基亚甲基，1-氨基-2-氯-1，2-亚乙基，1-二甲氨基-1，2-亚乙基，-CH2-、-C2H5-、C3H5、_CH( CH2NH2) CH2-、_CH( CH = CHNH2) CH2-、-CH2CH (NH2) CH2-、-CH (C6H5) CH (NH2) CH2-、_CH (CH3) CH (NH2) CH2-、_CH (NH2) CH (NH2) CH2-、_CH (CH2NH2) CH2CH2-、_CH (CH3) CH (CH2NH2) CH2-、-CH (CH2NH2) CH (CH3) CH2-、-CH2CH (NH2) CH2CH2-、_CH( CH3) CH2CH2CH (NH2)-、-CH2CH(CH3)CH2CH(NH2)-、-CH(CH = CH2)CH(NH2)CH2-、-CH(CH = CH2)CH2CH(NH2)-、-CH (CONHCH3)-、-C(CON(CH3)2)-、-C(⑶ N(CH3)C2H5)-、-C(CON(C2H5)2)-、-C(CON(CH3)C3H7)-、-C (⑶ N(C2H5)C3H7)-、-CH(CH2(NH2)CH = CH2)-、-CH(CH = CH2)CH(NH2)-、-CH(NH2)C5H4-、-CH (NH2) CH2C5H4-、-CH2CH (NH2) C5H4-、-CH2C5H4CH (NH2)-等。
[0028] 进一步，所述的化合物中，R3为H、0H、CN或带支链的烃基基团N，烃基取代基N具有1 ~10个碳原子。
[0029] 进一步，所述的R3为以下基团之一:-!1、-0!1、-01甲基、乙基、丙基、环丙基、丁基、 环丁基、戊基、环戊基、环己基、庚基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、1-环 戊基-乙基、2-甲硫基-丙基、2-甲氧基-丙基、2-二氣甲基-丙基、环丙基、-〇?3、-〇12〇?3、 _ CH2CH2CF3、_CH( CH3) CF3、-CH2X、-C2H5X、-C3H6X、-C4H7X、-CH2SCH3、-CH2SCH2X、-CH2SC2H5、-CH2SC3H7、-CH2SC4H9、-CH2CH2SCH3、-CH2CH2SCH2X、-CH2CH2SC2H5、-CH2CH2SC3H7、-CH2CH2SC4H9、- CHNHCH3、_CHN( CH3) 2、-CHNHC2H5、-CHNHCH2CH2CH3、_CHNHCH( CH3) 2、_CHN( CH3) C2H5、_CHN( CH3) C3H7、-CHN(CH3)C4H9、-CH2C0NHCH3、-CH2C0NHC2H5、-CH2C0NHC3H7、-CH2C0NHC4H9、-CH2CH2CONHCH3、-CH2CH2 ⑶ NHC2H5、-CH2CH2CONHC3H7、-CH2CH2CONHC4H9、_CH( CH3) C0NHCH3、-CH (CH3) CONHC2H5、_CH( CH3) CONHC3H7、_CH( CH3) CONHC4H9、-CH2SO2CH3、-CH2SO2C2H5、-CH2SO2C3H7、-CH2SO2C4H9、-CH2CH2SO2CH3、-CH2CH2SO2C2H5、-CH2CH2SO2C3H7、-CH2CH2SO2C4H9、_CH( CH3) SO2CH3、_ CH( CH3) SO2C2H5、_CH( CH3) SO2C3H7、_CH( CH3) SO2C4H9、-C3H6SO2CH3、-C3H6SO2C2H5、-C3H6SO2C3H7、-C3H6SO2C4H9、-CH2OCH3、-CH2OC2H5、-CH2OC3H7、-CH2CH2OCH3、-CH2CH2OC2H5、-CH2CH2OC3H7、-CH (CH3) OCH3、_CH (CH3) OC2H5、_CH (CH3) OC3H7、-C3H6〇CH3、-C3H6OC2H5、-C3H 60c3H7，其中 X为卤原子。
[0030] 进一步，所述的化合物中，含硒二膦酸选自以下品质表现最佳。
[0031]
[0032]
[0033] 本发明还提供了上述具有式Π 结构的二膦酸化合物的三种制备方法。
[0034] 一种制备上述具有式Π 结构二膦酸化合物的方法，先合成一种含硒有机羧酸m， 结构如下：
[0035] HOOC-R2-Se-R3
[0036] 式m
[0037] 通过式m合成含硒的二膦酸化合物。
[0038] 方法一：
[0039] 含硒有机羧酸(式m)中加入硼烷类的醚类溶液，将有机羧酸上面的氢取代形成硼 烷酯，反应时间约30min~120min，反应温度为0°C~60°C，其中式m化合物与硼烷的摩尔比 为1:1~1:5。再加入烷基类亚磷酸酯进行亲核取代，反应时间为2h~24h，式ΙΠ 化合物与烷 基亚磷酸酯的摩尔比为1:2~1:6。最后加入醇，发生醇水解反应，继续反应lh~4h。最终得 到式Π 结构的二膦酸。
[0040] 进一步，所述的硼烷类的醚类溶液中的醚类为四氢呋喃和/或1，4-二氧六环。
[0041] 进一步，所述的的醇水解中的醇为甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的一种或几种。
[0042] 按照上述制备方法一，可以制备得到式Π 结构的二膦酸化合物。上述制备方法的 过程如下：
[0043]
[0044] 本发明还提供了另外一种方法合成式Π 结构二膦酸。
[0045] 方法二：
[0046] 将式ΙΠ 化合物与亚磷酸、三氯化磷在80°C~120°C温度下反应2h~8h，向反应物中 加入水，1 g化合物m中加入lmL~40mL水，于90 °C~120 °C回流lh~6h，化合物m与亚磷酸的 摩尔比为1:1~1:6，化合物m与三氯化磷摩尔比为1:2~1:6，反应液过滤，滤液中加入醇溶 液并于-5 °C~5 °C放置12h~48h，抽滤，固体用水洗涤，60 °C~120 °C真空干燥4h~10h，得到 具有式Π 结构的二膦酸。
[0047] 进一步，滤液中加入醇溶液中的醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等试剂。
[0048]按照上述制备方法二，可以制备得到式Π 结构的二膦酸化合物。上述制备方法的 过程如下：
[0049]
[0050] 二膦酸盐类药物用于治疗骨质疏松，其主要作用是通过抑制破骨细胞活性、诱导 破骨细胞的凋亡起到抑制骨吸收，阻止骨吸收及骨微结构的破坏。尽管上市的二膦酸类化 合物对破骨细胞的抑制作用越来越强，但其对成骨细胞增殖作用的影响较弱，这可能会导 致患者骨折的风险相应地增加。
[0051] 与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0052]本发明提供了一种新型二膦酸盐化合物以及制备所述化合物的方法和用途，并且 已经鉴别出该化合物的结构特征。在细胞药理实验中，使用已经上市并广泛使用的阿伦膦 酸钠和唑来膦酸作为阳性对照药。通过系列SCDP化合物对体外成骨细胞和破骨细胞功能的 评价研究表明，SCDP化合物不仅保持与阿伦膦酸钠和唑来膦酸相似的抑制破骨细胞活力， 还具有比阿仑膦酸钠和唑来膦酸较好的促进成骨细胞增殖作用。故可以初步推断，对老年 骨质疏松患者，可使骨细胞的骨形成和骨破坏维持一个较为理想的动态平衡。
【具体实施方式】
[0053] 本发明中未特别说明的百分比均为重量百分比。
[0054] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应该将此理解为本发明 上述主题范围仅限于以下的实施例，凡基于本
【发明内容】
所实现的技术均属于本发明的范 围。
[0055]实施例1:合成SCDP-1化合物
[0056]本实施例举二膦酸化合物为:3_硒羟基-2-氨基-1-羟基亚丙基-1，1-二膦酸。结构 式如下
[0057]
[0058]该化合物具体制备方法如下：
[0059] 将3-硒羟基2-氨基-丙酸1.68g加入50mL三口瓶中。加入四氢呋喃10mL，搅拌后加 入儿茶酚硼烷2.4g，反应2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亚磷酸酯9.0g，反应2h后，加入甲醇 40mL反应2h。减压蒸馏至油状物产生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重结晶得到白 色固体3-硒羟基-2-氨基-1-羟基亚丙基-1，1-二膦酸。
[0060] 该白色固体鉴定：
[0061] 4-^^(4001^,020)32.65(1^10,31.41-1.72(0,21015^51,111/2)315.88(?) [0062]经上述鉴定可以确定该化合物为3-硒羟基-2-氨基-1-羟基亚丙基-1，1-二膦酸。 [0063]实施例2:合成S⑶P-2化合物
[0064]本实施例举二膦酸化合物为:3_甲硒基-2氨基-1羟基亚丙基-1，1-二膦酸。结构式 如下
[0065]
[0066]该化合物具体制备方法如下：
[0067] 将3-甲硒基-2-氨基-丙酸1.82g加入50mL三口瓶中。加入四氢呋喃10mL，搅拌后加 入儿茶酚硼烷2.4g，反应2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亚磷酸酯9. Og，反应2h后，加入甲醇 40mL反应2h。减压蒸馏至油状物产生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重结晶得到白 色固体3-甲硒基-2氨基-1羟基亚丙基-1，1-二膦酸。
[0068] 该白色固体鉴定：
[0069] 4-^^(40011^,020)32.68(1^10,31.43-1.74(0,210 4,0.98(5,31015^51,111/ ζ)329·89(+Η)
[0070] 经上述鉴定可以确定该化合物为3-甲硒基-2氨基-1羟基亚丙基-1，1_二膦酸。 [0071]实施例3:合成SCDP-3化合物
[0072]本实施例举二膦酸化合物为:4_甲硒基-2-氨基-1羟基亚丙基-1，1-二膦酸。结构 式如下：
[0073；
[0074]该化合物具体制备方法如下：
[0075] 将4-甲硒基-2-氨基-丁酸1.96g加入50mL三口瓶中。加入四氢呋喃10mL，搅拌后加 入儿茶酚硼烷2.4g，反应2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亚磷酸酯9. Og，反应2h后，加入甲醇 40mL反应2h。减压蒸馏至油状物产生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重结晶得到白 色固体4-甲硒基-氨基-1羟基亚丁基-1，1-二膦酸。
[0076] 该白色固体鉴定：
[0077] 1H-NMR(400MHz,D20)52.68(TaH),5l.53(Q,2H) ,5l.32(T,2H)5,0.99(S,3H)〇MS (ESI，m/z)343.87(+H)
[0078] 经上述鉴定可以确定该化合物为4-甲硒基-2-氨基-1羟基亚丁基-1，1_二膦酸。 [0079] 实施例4:合成S⑶P-4化合物
[0080]本实施例举二膦酸化合物为：3_烯丙硒基-2-氨基-1羟基亚丙基-1，1-二膦酸。结 构式如下：
[0081]
[0082]该化合物具体制备方法如下：
[0083] 将3-烯丙硒基-2氨基-丙酸2.08g加入50mL三口瓶中。加入四氢呋喃10mL，搅拌后 加入儿茶酚硼烷2.4g，反应2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亚磷酸酯9.0g，反应2h后，加入甲 醇40mL反应2h。减压蒸馏至油状物产生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重结晶得到 白色固体3-硒丙硒基-2氨基-1羟基亚丙基-1，1-二膦酸。
[0084] 该白色固体鉴定：
[0085] 1H-NMR(400MHz,D20)55.68(MaH)55.08(D,2H),52.63(TaH),52.10(D,2H),52.02 (D,2H)〇MS(ESI,m/z)355.87(+H)
[0086] 经上述鉴定可以确定该化合物为3-烯丙硒基-2-氨基-1羟基亚丙基-1，1_二膦酸。 [0087] 实施例5:合成S⑶P-5化合物
[0088]本实施例举二膦酸化合物为:3_丙硒基-2-氨基-1羟基亚丙基-1，1-二膦酸。结构 式如下-
[0089]
[0090]该化合物具体制备方法如下：
[0091] 将3-丙硒基-2-氨基-丙酸2. lg、亚磷酸3.9g和甲苯10ml的混合物加热至80°C，缓 慢滴入三氯化磷5.6g，滴毕同温反应4h，加入水20mL，加热回流反应4h。反应液冷却后加至 无水乙醇30ml中，冷冻析晶，过滤，滤饼用水重结晶，得白色固体。
[0092] 该白色固体鉴定：
[0093] 4-^1^(40010^,020)32.73(1^11)41.45-1.73(0,210 41.33(1211)41.42(]^ 2H),5l.02(T,3H)〇MS(ESI,m/z)37.88(+H)
[0094]经上述鉴定可以确定该化合物为3-丙硒基-2-氨基-1羟基亚丙基-1，1_二膦酸。
[0095] S⑶P系列化合物骨显像研究
[0096] 99Tcm标记化合物的制备及稳定性研究
[0097] 99Tcm 标记 SCDP 化合物：各 SCDP 浓度为 5mg/mL，SnCl2 为 50mg/mL。
[0098] 分别向 0 · 4mL SCDP-1、SCDP-2、SCDP-3、SCDP-4和SCDP-5溶液中加入PBS缓冲液 1.5mL，再加入SnCl 2溶液30yL，最后加入"Tcm〇4-淋洗液20yL(74MBq)，用PBS定容至2mL，震荡 混匀静置l〇min，并用滤头过滤。最后将标记溶液进行纸薄层扫描(TLC)，标记率大于95%方 可进行体内注射。
[0099] 对照药99Tcm标记亚甲基二膦酸(MDP):向5mg MDP中加入2.4mL PBS，然后向其中加 入"Tcm〇4-淋洗液25yL(93MBq)，用PBS定容至2.5mL，震荡混匀静置lOmin，并用滤头过滤。最 后将标记溶液进行纸薄层扫描(TLC)，标记率大于95%方可进行体内注射。
[0100] 标记化合物稳定性研究：经研究各SCDP化合物及对照药MDP在标记后其标记率皆 大于95%。
[0101] 99Tcm标记化合物兔骨显像结果
[0102] 用双探头电子发射计算机断层扫描成像系统对给与99Tcm#记药物的各组进行扫 描，通过固定的感兴趣区域做骨与肌肉、骨与血、骨与肝、骨与肾、骨与膀胱的放射性计数比 值，分别计算30、60、120、180、240min时，骨与组织对放射性物质的摄取比值结果见表1。 [0103]表1兔感兴趣区域放射性计数比值表
[0104]
[0105]
[0106]从表1可见，各SCDP系列化合物其趋骨性与对照药MDP相当，故SCDP化合物可开发 为一种供临床诊断用骨显像剂。
[0107]通过细胞实验评价系列SCDP化合物的抗骨质疏松能力。
[0108] 采用成骨细胞（OBs)及破骨细胞（OCs)两种体外细胞模型对这五种SCDP化合物 (SCDP-1、SCDP-2、SCDP-3、SCDP-4和SCDP-5)的体外抗骨质疏松能力进行初步评价，并以目 前临床上被公认治疗骨质疏松药物阿仑膦酸(ALN)和唑来膦酸(Z0L)作为阳性对照。系列 SCDP化合物对成骨细胞功能的影响用KM种（昆明种)24h内新出生乳鼠颅盖骨为源代的成骨 细胞，评价药物对促成骨细胞增殖能力和促成骨细胞矿化能力影响。系列SCDP化合物对破 骨细胞功能的影响用购自日本C0SM0BI0公司的大鼠破骨细胞前体试剂盒，评价药物对抑制 破骨细胞活力的影响。
[0109] 成骨细胞的分离培养，取24h内新出生乳鼠10只左右，拉颈处死后投入盛有75%乙 醇的烧杯内消毒5min。成骨细胞原代培养采用通用的培养方法，培养出符合实验要求数量 和质量的成骨细胞。
[0110] 实验分为空白对照组（CTL组）、唑来膦酸组（Z0L组）、阿仑膦酸组（ALN组）和5个 SCDP化合物组，各实验组浓度为HTVol/L。数据分析采用SPSS软件的t检验进行分析，P< 0.05认为与对照组(CTL组)有显著性差异。
[0111] 促成骨细胞增殖能力
[0112] 大鼠成骨细胞以3 X103/孔接种于96孔培养板中，每孔体积100μΙ，每组设6个平行 孔进行测定。过夜培养后(37°C，5%C02)，待细胞贴壁完全，吸干培养基，按照实验分组情况 每孔分别加入含对应药物的培养基1〇〇μ1，继续培养后第1、2、3天取每组6孔样本进行检测。 增殖能力测定采用CCK-8试剂盒在测定，原理为CCK-8溶液中的WST-8可被活细胞内的脱氢 酶氧化还原后生成的橙黄色甲臢染料溶解在培养基中，生成的甲臢量与活细胞的数量成正 比，测定溶液的吸光度值(0.D)即可间接反应细胞的数量，即增殖能力。以成骨细胞增殖促 进率为评价结果。成骨细胞增殖促进率=[(0. D^n/0. -1 ] X 100 %。结果见下表2:
[0113]表2促成骨细胞增殖平均促进率（％ )
[0114]
[0115] 促成骨细胞矿化能力
[0116] 每组设3个平行孔进行测定，大鼠成骨细胞以4X104/孔接种于24孔培养板中，每 孔体积500μ1。过夜培养后（37 °C，5 %⑶2)，待细胞贴壁完全，吸干培养基。每孔分别加入含 对应药物浓度的培养基500μ1，向加样培养基中加入矿化诱导剂(含2πιΜβ-甘油磷酸钠(β- GP)，10nM地塞米松和50yg/mL抗坏血酸），每3d换液一次，继续培养至第21天，每组3孔样本 进行检测。
[0117]矿化能力测定用细胞的茜素红染色，其中矿化结节被染成橘红色。再向染色的成 骨细胞中加入10 %西吡氯胺溶液，每孔加200μ1，静置30min，橘红色红色结节逐渐被溶解， 溶液呈现紫红色。将溶液转入96孔板中，每孔100μΙ，于570nm波长处测定各孔吸光度(0.D)。 矿化结节形成促进率（％) = [ (0. Dffia/o. -1 ] X 100 %。结果见下表3:
[0118]表3促成骨细胞矿化能力平均促进率（％ )
[0119]
[0120]系列SCDP化合物药物对促成骨细胞增殖能力和促成骨细胞矿化能力影响结果表 明，对成骨细胞增殖能力各SCDP药物与Z0L和ALN比较，皆具有一定的促进成骨细胞增殖作 用;在反映药物对骨形成作用的矿化能力，各SCDP药物促进作用显著优于Z0L和ALN。从上述 结果表明，各SCDP化合物皆有促成骨能力。
[0121] 对破骨细胞功能影响的实验研究
[0122] 破骨细胞的骨吸收能力测定采用日本C0SM0BI0公司的破骨细胞骨吸收检测试剂 盒进行测定。取出骨吸收检测试剂盒中的48孔板，每孔小心沿孔壁加入0.25mL试剂盒中的 BONE RESORPTION ASSAY FACS，每孔接种细胞悬液500yL，每孔接种细胞6.5X103cells/ mL。每孔加入100 X药物母液各5yL。连续培养4~7天，中间不换液。连续培养4天后，从骨吸 收检测板各孔中取l〇〇yL细胞培养上清至96孔板中。96孔板各孔中加入50yL试剂盒中的 BONE RESORPTION ASSAY BUFFER，轻轻混匀。用荧光酶标仪检测各孔的吸光度值，若骨吸收 效果不明显，可将骨吸收检测板全部更换新鲜无酚红的培养基，再相应加入药物，再连续培 养至7d后重复检测。抑制破骨细胞活力抑制率（％) = [1-(0.1)|^/0.0?0]\100%。结果见 下表4:
[0123] 表4抑制破骨细胞活力平均抑制率（％ )
[0124]
[0125] 系列SCDP化合物药物对破骨细胞抑制活力，从表4结果可见，除SCDP-1、与SCDP-5 外，在第4天抑制破骨细胞抑制活力低于Z0L和ALN外，其它各SCDP都优于Z0L和ALN。在第7天 各SCDP药物的抑制破骨细胞活力与Z0L和ALN相当。
[0126] 总之，通过系列SCDP化合物对体外成骨细胞和破骨细胞功能的评价研究，表明， S⑶P化合物不仅保持与Z0L和ALN相似的抑制破骨细胞活力，还具有比Z0L和ALN较好的促进 成骨细胞增殖作用。故可以初步推断，对老年骨质疏松患者，可使骨细胞的骨形成和骨破坏 维持一个较为理想的动态平衡。
[0127] 实施例6
[0128] 按照实施例1的合成方法一，合成以下二膦酸化合物：
[0129]
【主权项】
1. 一种二麟酸化合物，具有式π的结构：式中， 化为Η、ΟΗ或者面素。 R2是控基基团Μ，控基基团Μ结构是线性的、具有支链的、环的或具有芳香族环的，该控 基基团Μ具有1~20个碳原子;控基基团Μ任选地被一个或多个独立选自H、-CF3、-F、-C1、- SR、-N(R)2、-S02R和-OR的基团取代;显然，控基基团Μ应该是二价控基基团； R3是-H、-〇H、-CN或具有1~20个碳原子的控基基团Ν，该控基基团Ν是线性的、支链的、 环的或芳香族的控基基团；其中，控基基团N具有1~20个碳原子;控基基团N任选地被一个 或多个选自H、-C的、斗、-(：1、-51?、-則1〇2、-5〇21?和-〇如勺基团取代； 所述的取代基R各自独立的选自：氨原子、-C00R'、-C0R'、-C0N(R'）2，C1~CIO的烷基、 Cl~CIO的取代烷基、C2~C6的締基、C2~C6的取代締基、C2~C6的烘基、C2~C6的取代烘 基、芳基或取代芳基； 其中，R '各自独立地选自：氨、C1~C6的烷基、芳基、取代基r取代的C1~C6的烷基或取 代基R"取代的芳基； 其中，取代基护独立地选自-OH、面原子、-畑2、-CN、Cl-C4的烷基，C2-C4的締基。2. 如权利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，控基基团Μ和控基基团N是C1-C6的烧 基、C1-C6的締基、C1-C6的烘基，C5-C7的杂环或芳环，所述的杂环基团可W包含1~4个独立 的选自氮、硫和氧的杂原子，W使得运些杂环或者杂芳环的单一杂原子的数量至少为2。3. 如权利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，优选取代基R为:H、-C00H、-C00C曲、- C00C2 也、-C00C3 出、-C00C姐9、-C00CH2X、-COOC2H4X、-C0H、-C0C 曲、-C0C2 也、-C0C3 出、-C0C6曲、- C0CH2X、-COC2H4X、-C0NH (邸3)、-CON (邸3) 2、-CON (邸3) C2也、-CON (C2也）2、-CON (邸3) C3出、-CON (C2曲)C3出、甲基、乙基、丙基、下基、面取代甲基、面取代乙基、面取代丙基、面取代下基、乙 締基、丙締基、下締基、面取代乙締基、面取代丙締基、面取代下締基、乙烘基、丙烘基、下烘 基、苯基、甲基苯基、乙基苯基、丙基苯基、二甲基苯基、Ξ甲基苯基、甲乙基苯基、二乙基苯 基、甲丙基苯基、面取代苯基、氨基苯基、氯基苯基等;其中X为面素原子。4. 如权利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，Ri为面素原子、Η或 OHo5. 如权利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的式Π 化合物，在R2中，控基基团Μ 是具有1-10个碳原子的控基基团；最好是具有1-5个碳原子的控基基团，其上至少有1个氨 基或N(R)2取代基;此N(R)2基团上的取代基R表示W支链、线性、环状、芳香族、杂环或者芳杂 环的构型存在的具有1~12单元组的烷基基团、或者氨；两个R基团之间相互独立，互不影 响。6. 如权利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，控基基团Μ被多个N (R)2基团取代。7. 如权利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，控基基团Μ是带支链 的控基基团，且控基基团Μ具有1~5个碳原子，其上至少有1个氨基或N(R)2取代基。8. 如权利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，优选的所述的R2为W下基团之一 ：1-氨 基-1,2-亚乙基，1-氨基-1,3-亚丙基，氨基亚甲基，二甲氨基亚甲基，1-氨基-2-氯-1,2-亚 乙基，1-二甲氨基-1,2-亚乙基，-畑2-、-C2出-、C油5、-CH (C出畑2) C出-、-CH( CH = CHN出） C出-、-C此 CH (N此）C此-、-CH (C6曲）CH (N此）C此-、-CH (C曲）CH (N出）C出-、-CH (畑2) CH (N出） CH2-、-CH (C此畑2) CH2C出-、-CH (CH3) CH (C此畑2) C此-、-CH (CH2N出）CH (CH3) CH2-、-CH2CH (畑2) CH2C此-、-CH (CH3) CH2C出 CH (畑2) -、-OfeCH (CH3) CH2CH(畑2) -、-CH (CH=CH2) CH (畑2) C出-、-CH (CH = CH2^H2CH(NH2)-、-CH(CONHCH3)-、-C(CON(Ol3)2)-、-C(CON(CH3)C2H5)-、-C(CON (C2 也）2)-、-C(C0N(CH3)C3 出）-、-C(C0N(C2 也）C3 出）-、-CH(C 出（N 出）CH=CH2)-、-CH(CH = CH2) CH (畑2) -、-CH (畑2) C5H4-、-CH (畑2) CH2C5H4-、-CH2CH (畑2) C5H4-、-CH2C5H4CH (畑2 )-等。9. 如权利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，R3为H、0H、CN或带支 链的控基基团N，控基取代基N具有1~10个碳原子。10. 如权利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的R3为W下基团之一 CN、甲基、乙基、丙基、环丙基、下基、环下基、戊基、环戊基、环己基、庚基、乙締基、丙締基、下 締基、乙烘基、丙烘基、下烘基、1-环戊基-乙基、2-甲硫基-丙基、2-甲氧基-丙基、2-二氣甲 基-丙基、环丙基、-CF3、-C此 CF3、-C此 C此 CF3、-CH (C曲）CF3、-C此X、-C2曲X、-C抽6X、-C祖7乂、- 畑25畑3、-畑25畑2乂、-畑25〔2出、-畑25〔3化、-畑25〔姐9、-畑2畑25畑3、-畑2畑25畑2乂、- C出 C出 SC2 也、-C出 C出 SC3 出、-C出 C出 SC姐9、-CHNHC出、-CHN( C出）2、-CHNHC 抽5、-CHNHC出 C出 C出、- CHNHCH (C曲）2、-CHN (C出）C2曲、-CHN (C出）C3出、-CHN (C出）C姐9、-C此 CON肥曲、-C出 C0NHC2曲、- 畑2CONHC3H7、-CH2CONHC4H9、-CH2CH2CONH畑3、-CH2CH2CONHC2H5、-CH2CH2CONHC3H7、- CH2CH2CONHC姐9、-畑（畑3) C0NHCH3、-畑（畑3) CONHC2H5、-畑（畑3) CONHC3H7、-畑（畑3 ) CONHC4H9、-C出S化C出、-C出S化C2也、-C出S化C3出、-OfeS化C4H9、-C出C出S化C出、-C出C出SO2C2也、- C出 C此 S化 C3出、-C出 C此 S化 C姐9、-CH (C出）S〇2C出、-CH (C曲）S化 C2曲、-CH (C出）SO2C3出、-CH (C出） S〇2C姐 9、-C3H6SO2C 出、-C3H6SO2C2H5、-C3H6SO2C3H7、-C3H6SO2C姐9、-C 出 0C出、-C 出 OC2H5、- C此0。化、-C此C出0C曲、-C此C出0。曲、-C此C此0。出、-CH (C出）0C出、-CH (C出）0。也、-CH (C出） 0C3出、-C3也0C出、-C3也0C2也、-C3也Oc抽7，其中X为面原子。11. 如权利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，含砸二麟酸是W下 之一：12.-种制备上述具有式π结构二麟酸化合物的方法，先合成一种含砸有机簇酸虹，结 构如下： 册 OC-R2-Se-R3 式虹 通过式虹合成含砸的二麟酸化合物。13. 根据权利要求12制备上述具有式Π 结构二麟酸化合物的方法，其特征在于， 含砸有机簇酸（式虹）中加入棚烧类的酸类溶液，将有机簇酸上面的氨取代形成棚烧 醋，反应时间约30min~120min，反应溫度为0°C~60°C，其中式虹化合物与棚烧的摩尔比为 1:1~1:5。再加入烷基类亚憐酸醋进行亲核取代，反应时间为化~2地，式虹化合物与烷基 亚憐酸醋的摩尔比为1:2~1:6。最后加入醇，发生醇水解反应，继续反应化~地。 最终得到式Π 结构的二麟酸。14. 根据权利要求12制备上述具有式Π 结构二麟酸化合物的方法，其特征在于， 将式虹化合物与亚憐酸、Ξ氯化憐在80°C~120°C溫度下反应化~化，向反应物中加入 水，1 g化合物虹中加入ImL~40血水，于90 °C~120 °C回流化~化，化合物虹与亚憐酸的摩尔 比为1:1~1:6,化合物虹与Ξ氯化憐摩尔比为1:2~1:6,反应液过滤，滤液中加入醇溶液并 于-5 °C~5 °C放置1化~48h，抽滤，固体用水洗涂，60°C~120°C真空干燥地~lOh，得到具有 式Π 结构的二麟酸。15. 上述的二麟酸化合物在治疗骨质疏松的药物中的应用。
【文档编号】C07F9/38GK106083925SQ201610539886
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】李明起, 潘俊男, 王翰, 曾永龙, 曹刚, 文德仲, 程作用, 邓启民, 段玉春, 蒋雪, 刘媛媛
【申请人】成都云克药业有限责任公司