柠檬苦素类化合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用

文档序号:10713786阅读:283来源:国知局
柠檬苦素类化合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种柠檬苦素类化合物及含其的药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。该应用中所述化合物为首次报道,是一种结构新颖的柠檬苦素类化合物,可以从吴茱萸的干燥近成熟果实中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物可直接抑制K562细胞的增殖,抑制能力随浓度的增加和作用时间的延长而增强;同时,该化合物可诱导K562细胞凋亡,且这种促凋亡的效应随着浓度和时间的增加而增加。化合物(Ⅰ)可能为慢性粒细胞白血病的治疗提供一种潜在的手段,可以用来开发成治疗慢性粒细胞白血病的药物。
【专利说明】
柠檬苦素类化合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的 应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域,具体涉及从吴茱萸的干燥近成熟果实中分离得到的一 种柠檬苦素类化合物及含其的药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 慢性粒细胞白血病是一种影响血液及骨髓的恶性肿瘤,它的特点是产生大量不成 熟的白细胞,这些白细胞在骨髓内聚集,抑制骨髓的正常造血;并且能够通过血液在全身扩 散,导致病人出现贫血、容易出血、感染及器官浸润等。慢性粒细胞白血病是一种相对少见 的恶性肿瘤,大约占所有癌症的0.3%,占成人白血病的20% ;-般人群中,大约每10万有1 至2个人患有该病。慢性粒细胞白血病可以发生于任何年龄的人群,但以50岁以上的人群最 常见,平均发病年龄为65岁,男性比女性更常见。
[0003] 吴茱萸为传统中药,始载于《神农本草经》,列为中品。其味辛、苦,性热,有小毒;具 有散寒止痛,降逆止呕,助阳止泻的功效。主要用于治疗厥阴头痛,寒疝腹痛,寒湿脚气等。 1977-2010版《中国药典》均收载吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss .) Benth ·,石虎E · Rutaecarpa(Juss · )Benth · var · Officinal is (Dode)Huang 或疏毛吴茱萸 E .Rutaecarpa( Juss · )Benth · var .Bodinieri (Dode)Huang的干燥近成熟果实。常绿灌木或 小乔木,主要分布在中国的贵州、四川、湖南、湖北、江西、广西、安徽和浙江省等。
[0004] 吴茱萸主要包括生物碱类、柠檬苦素类、挥发油类、黄酮类等化学成分。生物碱是 吴茱萸成分研究的主流。目前,从该属植物中已经分离鉴定出多种生物碱,主要有吲哚类、 喹诺酮类、呋喃喹啉类和吖喧酮类生物碱,另外,还有其他类型生物碱。柠檬苦素也是吴茱 萸的重要活性成分,主要包括柠檬苦素(C 26H3Q08),吴茱萸苦素,吴茱萸内酯醇,黄柏酮,吴茱 萸苦素乙酸酯,格罗苦素甲等化合物。吴茱萸富含挥发油,主要成分是月桂烯(占挥发油总 量的45.37 % )。此外,还包括萜类,异戊烯黄酮类黄酮化合物,香豆精,留体(β-谷留醇),木 质素,多糖,花色苷,多种氨基酸类化合物及微量元素和脂肪酸类化合物等。
[0005] 现代药理研究表明,吴茱萸具有镇痛作用,体温上升作用,对消化系统具有抗溃 疡、双向调节肠运动和保肝利胆作用,对子宫平滑肌和支气管具有双向调节作用,对心血管 系统具有降低血压,溶栓、增加血流量、扩张血管等作用,其中生物碱、柠檬苦素类化合物为 其主要有效成分。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供从吴茱萸的干燥近成熟果实中分离得到的一种柠檬苦素类 化合物及含其的药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的:
[0008] -种柠檬苦素类化合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用,具有下述 结构式的化合物(I),
[0009]
[0010] 化合物(I)从吴茱萸的干燥近成熟果实中分离得到,具体包含以下操作步骤:
[0011] (a)吴茱萸的干燥近成熟果实粉碎,用80~90%乙醇热回流提取,合并提取液,浓 缩至无醇味,依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取,分别得到石油醚萃取物、乙 酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物;
[0012] (b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂,先用15%乙醇洗脱8个柱体积,再 用75%乙醇洗脱12个柱体积,收集75%乙醇洗脱液,减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏;
[0013] (C)步骤(b)中75%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离,依次用体积比为85:1、55:1、 35:1、15 :1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得至1」5个组分;
[0014] (d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离,依次用体积比为20:1、15:1和10:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分;
[0015] (e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离,用体积百分浓度为 80 %的甲醇水溶液等度洗脱,收集8~10个柱体积洗脱液,洗脱液减压浓缩得到纯的化合物 (1)〇
[0016] 进一步地,步骤(a)中,用85%乙醇热回流提取,合并提取液。
[0017]进一步地,所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0018] -种药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用,该药物组合物含 有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
[0019] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(I),其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0020] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时,可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时,可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
[0021] 与现有技术相比,本发明的有益效果体现在:
[0022] 本发明的应用可以治疗慢性粒细胞白血病,本应用中所述化合物(I)可直接抑制 K562细胞的增殖,抑制能力随浓度的增加和作用时间的延长而增强。同时,化合物(I)可诱 导K562细胞凋亡,且这种促凋亡的效应随着浓度和时间的增加而增加。
【附图说明】
[0023] 图1为化合物(I)结构式;
[0024]图2为化合物(I)理论E⑶值与实验E⑶值比较。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容,但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0026]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0027] 试剂来源:乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯,购自上海凌峰化 学试剂有限公司,甲醇,分析纯,购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0028]制备方法:(a)将吴茱萸的干燥近成熟果实(8kg)粉碎,用85%乙醇热回流提取 (25LX3次),合并提取液,浓缩至无醇味(3L),依次用石油醚(3LX3次)、乙酸乙酯(3LX3 次)和水饱和的正丁醇(3LX3次)萃取,分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(347g)和 正丁醇萃取物;(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂,先用15%乙醇洗脱8 个柱体积,再用75%乙醇洗脱12个柱体积,收集75%乙醇洗脱液,减压浓缩得75%乙醇洗脱 物浸膏(131g);(c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离,依次用体积比为85:1(8 个柱体积)、55:1 (8个柱体积)、35:1 (6个柱体积)、15:1 (8个柱体积)和1:1 (5个柱体积)的二 氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分;(d)步骤(c)中组分4(29g)用正相硅胶进一步分离,依 次用体积比为20:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和10:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脱得到3个组分;(e)步骤(d)中组分2(llg)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离,用 体积百分浓度为80 %的甲醇水溶液等度洗脱,收集8-10个柱体积洗脱液,洗脱液减压浓缩 得到纯的化合物(I)(33mg)。
[0029] 结构确证:册431]\^显示[]\1+他]+为111/2 661.3022,结合核磁特征可得分子式为 C36H46〇iq,不饱和度为 14。核磁共振氢谱数据δΗ(ppm,DMS〇-d6,400MHz): H-1 (3 · 52,ddd,J = 8. l,3.4,2.2),H-2(1.96,m),H-2(2.28,ddd,J=16.2,3.4,2.8),H-3(5.05,dd,J = 2.8, 2.8),H-5(1.34,d,J=12.6),H-6(4.07,dd,J=12.6,3.1),H-7(5.61,d,J = 3.1),H-9 (1.69,dd,J=11.3,7.4),H-ll(2.61,m),H-ll(2.18,m),H-15(6.01,s),H-17(3.39,s),H-18(1.41,s),H-19(0.97,s),H-21(7.38,br,s),H-22(6.19,br,d,J=1.6),H-23(7.35,dd,J = 1.6,1.6),H-28(3.25,br,d,J = 7.7),H-28(3.46,d,J = 7.7),H-29(1.07,s),H-30(1.26, s),H-3'(6.69,m),H-4'(1.81,dq,J=7.1,l.l),H-5'(1.85,br,s),H-3"(6.72,m),H-4" (1.75,dq,J = 7.1,l.l),H-5"( 1 · 81,dq,J = 1 · 1,1 · 1);核磁共振碳谱数据 δ。(ppm,DMS〇-d6, 125MHz):73.7(CH,1-C),30.8(CH2,2-C),73.1(CH,3-C),41.7(C,4-C),40.1(CH,5-C),71.1 (CH,6-C),73.8(CH,7-C),45.7(C,8-C),34.0(CH,9-C),39.6(C,10-C),37.1(CH 2,n-C), 210.1(C,12-C),54.1(C,13-C),191.3(C,14-C),124.7(CH,15-C),205.2(C,16-C),60.1 (CH,17-C),26.1(CH 3,18-C),15.7(CH3,19-C),119.1(C,20-C),141.1(CH,21-C),110.9(CH, 22-C),142.3(CH,23-C),67.6(CH2,28-C),18.1(CH 3,29-C),25.1(CH3,30-C),166.9(C,r-C),127.9(C,2'-C),138.2(CH,3'-C),12.7(CH3,4'-C),14.1(CH3,5'-C),166.7(C,1"-C), 127.9(<:,2"-〇,138.1(01,3"-〇,12.9(013,4"-〇,13.8(013,5"-〇 ;碳原子标记参见图1。 红外光谱表明该化合物含有羟基(3435CHT1)和羰基(1742和1714CHT 1)基团,紫外光谱显示 该化合物在230nm处有紫外吸收,表明含有α,β-不饱和酯羰基结构。4和13C NMR数据表明该 化合物含有的两个羰基(一个α,β_不饱和酮羰基),一个取代呋喃环,两个巴豆酰氧基基 团,四个含氧次甲基,1个含氧亚甲基以及四个甲基。两个巴豆酰氧基分别与C-3和C-7相连; HMBC 谱中,!1-30!15.〇5,(1(1,了 = 2.8,2.8!^)和!1-70!15.61,(1,了 = 3.1!^)与相应酯羰基碳[3 <:166.9和166.7]的相关性验证了上述结论。此外,〇1(3073.7),〇6(3071.1)和(:-28(3 C67.6)的化学位移表明了 1-0Η,6-0Η和28-0Η的存在。此外,根据HMBC谱中H-170H3.39,s) 与 〇2〇0(:119.1),(:-21(3(:141.1)和(:-22(3(:11〇.9)的相关性,可推断呋喃环位于(:-17位 上。ROESY谱中,H3-29与Η-2β,H-6和H3-19; H3-19与Η-2β,H-6和H3-30;以及H3-30与H-6的相关 性表明11-20,!1-6,!13-19,!1 3-29和!13-3是|3构型,因而使得(:-6位的羟基是€[-构型。了 5,6 (12.6Hz)的耦合常数表明Η-5是α-构型,从而确立了Η-9和Η3-18为α-构型;ROESY谱中Η-9与 Η-5和Η3-18的相关性验证了上述推论。此外,九2{!(3.4抱),如,3(2.8他)和九7(3.1他)较小 的耦合常数表明Η-1,Η-3和Η-7为β-构型,从而C-l,C-3,C-7位其余的取代基团均为α-构型。 综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱,以及文献关于相关类型核磁数据,可基本确定该化合物 如图1所示,立体构型进一步通过Ε⑶试验确定,理论值与实验值基本一致(图2)。
[0030]实施例2:化合物(I)药理作用试验 [0031] -、材料和仪器
[0032] Κ562细胞由中科院上海生物细胞所提供。化合物(I)为自制,HPLC归一化纯度大于 98% ΑΡΜΙ-1640干粉培养基购于Gibco公司。小牛血清购于杭州四季青生物工程材料研究 所。青霉素、链霉素购于华北制药厂。Glutamine、MTT、DMSO购于AMRESOLAnnexinv-FITC细 胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。M0PS,Rnasin、琼脂糖、嗅乙锭、溴 酚兰华美生物工程公司华美生物工程公司。
[0033] C02孵箱(美国Thermo公司),超净工作台(苏州净化设备厂),磁力搅拌器(上海南 汇电讯器材厂),倒置显微镜(日本OLYMPUS公司),水平式离心机(上海安亭科学仪器厂),电 子分析天平(德国Sartorius公司),自动酶标仪(德国Humareader公司),U-3010型紫外分光 光度计(日本HITACHI公司),流式细胞仪(美国BECKMAN公司),Eppendorf Centrifuge 5417R离心机(德国Eppendorf公司)。
[0034]二、试验方法 [0035] 1、K562细胞的培养
[0036]将新购买的细胞株的培养瓶表面用75%酒精擦拭3遍。将细胞悬液吸入离心管, lOOOrpm离心10min。弃去上清,滴加含10%NBS的RPMI-1640完全培养基,轻轻吹打制备成细 胞悬液。接种于培养瓶中,置于37°C,5%C0 2培养箱中培养,每天换液传代。
[0037] 2、实验分组
[0038]正常对照组:10%NBS 的 RPMI-1640;实验组:D1:10%NBS 的 RPMI-1640+终浓度 100mg/L化合物(I) ;D2:10%NBS的即RPMI-1640+终浓度200mg/L化合物(I) ;D3:10%NBS的 即RPMI-1640+终浓度400π^/1 化合物(I) ;D4:10%NBS的即RPMI-1640+终浓度800mg/L化合 物⑴。
[0039] 3、MTT法检测化合物(I)对K562细胞增殖的影响
[0040] (1)取生长状态良好的细胞,用含10%NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细胞 悬液,以5X103细胞/孔接种于无菌96孔培养板中。(2)依实验分组,每组加入不同浓度的药 物50yL,设无细胞孔为空白对照组,每组设8个复孔,将96孔培养板放入C02培养箱中培养; (3) 24、48和72h后取出96孔培养板,每孔加入20yL MTT (5mg/mL),放入C02培养箱中孵育4h, 即有紫蓝色结晶物生成,在一定细胞数范围内,结晶物的生成量与细胞数成正比。(4)每孔 加入酸化的SDS 1 OOyL放入C02培养箱中过夜。(5)用酶标仪测定0D,比色时以空白孔调零。 [0041 ] 4、AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡
[0042] (1)取生长状态好的细胞,用含10%NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细胞悬 液,并调整细胞浓度为5X105/mL,接种于无菌6孔培养板,每孔2mL细胞。(2)依实验分组加 入不同浓度药物,2mL/孔,将6孔培养板放入C02培养箱中培养。(3)48h和72h后收集各孔细 胞于离心管中,lOOOrpm离心5min,弃上清。(4)用4°C预冷的PBS洗涤细胞两次,(1500rpm,离 心5min),弃上清,用200yL Binding Buffer悬浮细胞,并移入流式管中。(5)每管加入5yL Annexinv-FITC混合后,加入5yL PI,混匀。(6)室温,避光反应10min,用流式细胞仪检测。 [0043] 5、统计学处理
[0044] 实验组和对照组均重复3次操作,结果用(x±s表示,P〈0.05示有显著性差异。组间 比较采用单因素方差分析。所有数据用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。
[0045]三、结果及结论
[0046] 1、MTT法检测化合物(I)对K562细胞的增殖抑制作用
[0047] 化合物(I)作用K562细胞24h、48h、72h后,用酶标仪检测0D49Q显示:作用24h后D1和 D2实验组对细胞K562细胞抑制作用不明显(P>0.05,P>0.05),D3和D4可明显抑制562结果(P 〈0.05,?〈0.01),作用4811和7211后,不同浓度的化合物(1)均可抑制1(562细胞增殖,且随剂量 和时间的增加抑制细胞增殖的作用增强。结果见表1 (*:和对照比P〈〇. 05; :和对照KP〈 0·01)〇
[0048] 2、Annexinv-FITC/PI双染流式细胞仪分析结果
[0049] 磷脂酞丝氨酸(Phosphotidyl Serine,PS)外翻是细胞凋亡的早期事件。AnnexinV 是一种Ca2 +依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。先后标记了FITC和PI (Propidium Iodide)的双染细胞,可通过流式细胞仪将活细胞、早期凋亡细胞(双参数散点 图右下象限)、晚期凋亡细胞及坏死细胞区分开。结果表明不同浓度的化合物(I)作用K562 细胞48h和72h均可明显诱导K562细胞早期凋亡,这种效应随化合物(I)的浓度增加和作用 时间延长而明显增强。结果见表2(*:和对照比P〈0.05;#:和对照比P〈0.01)。
[0050] 结论,化合物(I)可直接抑制K562细胞的增殖,抑制能力随浓度的增加和作用时间 的延长而增强。同时,化合物(I)可诱导K562细胞凋亡,且这种促凋亡的效应随着浓度和时 间的增加而增加。研究结果显示,化合物(I)可能为慢性粒细胞白血病的治疗提供一种潜在 的手段。
[0051 ] 表1不同浓度的化合物(I)作用K562细胞后的MTT值(X土s,N=8)
[00521
[0053] 表2不同浓度化合物(I)作用K562细胞后早期凋亡率(X土s,N=3)
[0054]
[0055] 实施例3
[0056] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物(I),以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐,按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂,制粒压片。
[0057] 实施例4
[0058] 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物(I),以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐,按常规口服液制法制成口服 液。
[0059] 实施例5
[0060] 胶囊剂或颗粒剂的制备:按实施例1方法先制得化合物(I),以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐,按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂,制成胶囊或颗粒剂。
[0061 ] 实施例6
[0062] 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物(I),以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐,按常规加注射用水,精滤, 灌封灭菌制成注射液。
[0063] 实施例7
[0064] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物(I),以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐,将其溶于无菌注射用水 中,搅拌使溶,用抽滤漏斗过滤,无菌精滤,分装于安瓿中,低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针 剂。
[0065] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容,但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换, 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种巧樣苦素类化合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用,其特征在 于:具有下述结构式的化合物(I),2. 权利要求1所述的应用,其特征在于所述化合物(I)从吴荣英的干燥近成熟果实中分 离得到,具体包含W下操作步骤: (a) 将吴荣英的干燥近成熟果实粉碎,用80~90%乙醇热回流提取,合并提取液,浓缩 至无醇味,依次用石油酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取,分别得到石油酸萃取物、乙酸 乙醋萃取物和正下醇萃取物; (b) 步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂,先用15%乙醇洗脱8个柱体积,再用 75%乙醇洗脱12个柱体积,收集75%乙醇洗脱液,减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏; (C)步骤(b)中75%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离,依次用体积比为85:1、55:1、35: 1、15:1和1:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分; (d) 步骤k)中组分4用正相硅胶进一步分离,依次用体积比为20:1、15:1和10:1的二氯 甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分; (e) 步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离,用体积百分浓度为80%的 甲醇水溶液等度洗脱,收集8~10个柱体积洗脱液,洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的应用,其特征在于:步骤(a)中,用85%乙醇热回流提取,合并 提取液。4. 根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。5. -种药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用,其特征在于:该药 物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
【文档编号】A61P35/02GK106083975SQ201610392074
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月3日 公开号201610392074.3, CN 106083975 A, CN 106083975A, CN 201610392074, CN-A-106083975, CN106083975 A, CN106083975A, CN201610392074, CN201610392074.3
【发明人】吴芊葭
【申请人】吴芊葭
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