血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用，该抑制肽的氨基酸序列为：Asn?Thr?Leu?Thr?Leu?Ile?Asp?Thr?Gly?Ile?Gly?Met?Thr?Lys。本发明采用现代生化技术手段，对杂色蛤中的抑制血管紧张素转化酶的活性成分进行跟踪筛选和评价，通过酶解、乙醇沉淀、离子交换色谱、反相高效液相色谱法等纯化方法制备得到，实验结果表明，该抑制肽具有很好的抑制血管紧张素转化酶的作用，具有很好的抗高血压的功效，并且安全性能好，具有很好的应用前景。
【专利说明】
血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种活性多肽，具体涉及一种从杂色蛤软体酶解物中分离得到的具有 抑制ACE活性的多肽，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)是一种锌离子依赖型 的二肽羧基肽酶，广泛存在于哺乳动物组织中，能将血管紧张素 I (Angiotensin I)转化血 管紧张素 Π (Angiotensin Π )，后者为强烈的血管收缩剂，促使血压升高；另一方面，ACE可 以使具有血管舒张作用的舒缓激肽(bradykinin)转化为失活的片段，抑制降压系统一一激 肽释放酶-激肽系统(Kailikrein-Kinin System，KKS)，同样导致血压升高。因此，抑制ACE 的活性，可以达到缓解血压增高，具有治疗高血压的作用。
[0003] 现代研究表明，活性肽与蛋白质及单一氨基酸相比，具有更强的生物活性和营养 价值。活性肽专属性强、生物活性高、毒副作用小，易被消化吸收，具有多种功能，作为预防 和治疗疾病的医药产品进行研究有着巨大的开发潜力。而食源性的ACE抑制剂控制高血压 起效快、作用强、安全性高，目前己经在临床治疗高血压和心血管疾病中发挥了重要的作 用。
[0004] 杂色蛤(Ruditapes philippinarum)是广泛分布于江苏沿海的一种重要双壳经济 贝类。传统中医理论认为其贝壳和软体部份均可入药，蛤蜊肉咸、冷、无毒，归胃、肝、膀胱 经，宋代《嘉祐本草》中关于蛤蜊有记载："润五脏，止消渴，开胃，解酒毒。主老癖能为寒热 者，及妇人血块，宜煮食之"。现代研究表明蛤蜊酶解肽具有抗肿瘤、抗氧化等多种生物活 性。
【发明内容】
[0005] 发明目的:本发明的目的是在杂色蛤现有研究的基础之上，通过大量实验筛选，采 用现代生化技术手段，对杂色蛤中的抑制血管紧张素转化酶的活性成分进行跟踪评价，通 过酶解、乙醇沉淀、离子交换色谱、反相高效液相色谱法等纯化方法制备得到一种血管紧张 素转化酶抑制肽，该抑制肽具有很好的抑制血管紧张素转化酶的作用，具有很好的抗高血 压的功效。
[0006] 技术方案:为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
[0007] -种血管紧张素转化酶抑制肽，该抑制肽具有下述的氨基酸序列"抓-!!^-!^!!-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lys (天冬酰胺-苏氨酸-亮氨酸-苏氨酸-亮 氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-蛋氨酸-苏氨酸-赖氨酸）。
[0008] 本发明提供的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其包括以下步骤：
[0009] (1)杂色蛤酶解物的制备：
[0010] 将杂色蛤软体洗净泥沙，加入3至8倍量水煎煮1至3次，分离煎煮液与肉渣，沥干； 取肉渣，加3至8倍量水匀浆后，加入酶酶解，酶的加入重量为肉渣重量的0.01 %-2.0%，酶 解的温度为37至50 °C，酶解的pH为7至9,酶解反应时间为2至6h;酶解结束后，于沸水浴灭 活，然后加入无水乙醇进行醇沉，并在4°C下静置24小时，再取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到 冻干粉；
[0011] (2)离子交换色谱纯化：
[0012] 取步骤(1)酶解得到的冻干粉以去离子水溶解后，经过离子交换色谱分离，流动相 为:A相:水，B相：lmol/L的氯化钠溶液;洗脱条件为:0~40min内lmol/L氯化钠溶液体积比 为0%，40~140min内lmol/L氯化钠溶液体积比为0%~100% ;流速:3mL/min;检测波长： 220nm;酶解物被离子交换色谱分离成不同组分，分别测定各组分ACE抑制活性，取活性最好 的部分，冷冻干燥，得冻干粉；
[0013] (3)反向色谱分离纯化：
[0014] 取步骤(2)分离后的冻干粉以甲醇溶解，经过反相高效液相色谱分离，流动相为:A 相:0.1 %甲酸;B相：甲醇，洗脱程序为:B相甲醇体积由0 %至10 % (0~1 Omiη )，B相甲醇体积 由20%至40%(10~20111；[11)，13相甲醇体积由40%至100%(20~25111；[11);流速：101111^/111；[11;柱 温:30°C，检测波长为220nm，共分离收集到三组成分，然后进行冷冻干燥，经ACE抑制活性测 定后得到活性最好的血管紧张素转化酶抑制肽，其氨基酸序列为Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lyso
[0015] 作为优选方案，以上所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，所述的酶为胰 蛋白酶，所述胰蛋白酶活性为10000至50000U/g。
[0016] 作为优选方案，以上所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，所述的酶的加 入重量为肉渣重量的0.1-1%，酶解的温度为30~50°C，酶解的pH为6~9,酶解反应时间为 l-5h〇
[0017] 作为优选方案，以上所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，所述的酶的加 入重量为肉渣重量的〇. 6%，酶解的温度为45°C，酶解的pH为8.5，酶解反应时间为2h。本发 明通过大量试验筛选最佳的酶解工艺。
[0018] 酶解工艺的筛选实验：
[0019] 酶解温度考察:取杂色蛤软体肉渣称重，加3倍量水匀浆，分别加入胰蛋白酶，加酶 量为肉渣量的〇. 25%，以pH 8.5，酶解反应时间2h的条件下，考察温度因素对酶解产物ACE 抑制活性影响实验，分别考察40°C、45°C、50°C、55°C和60°C酶解得到的杂色蛤酶解物对ACE 的抑制率，结果见表1。结果表明，45°C条件下的杂色蛤酶解产物ACE抑制活性最佳。
[0020] 表1温度对胰蛋白酶酶解杂色蛤酶解物抑制ACE活性的影响
[0021]
[0022]酶解pH值的考察:取杂色蛤软体肉渣称重，加3倍量水匀浆，分别加入胰蛋白酶，加 酶量为肉渣重量的〇 . 25%，以温度45°C，酶解2h条件下，考察酶解反应pH对酶解产物抑制 ACE活性的影响实验，考察的pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.5和9.0时，酶解得到的杂色蛤酶解 物对ACE的抑制活性，结果见表2。结果表明，pH8.5时，杂色蛤酶解产物ACE抑制活性最佳。
[0023] 表2pH对胰蛋白酶酶解杂色蛤酶解物抑制ACE活性的影响
[0024]
[0025] 胰蛋白酶加入量的考察:取杂色蛤软体肉渣称重，加 3倍量水匀浆，分别加入胰蛋 白酶，在pH = 8.5、温度45°C条件下酶解2h，考察加酶量对酶解产物ACE抑制活性的影响实 验，考察酶-底物比（酶-底物比按加酶量占肉渣重量的百分比计）分别为0.05 %、0.1 %、 0.25%、0.5%和0.75 %时酶解得到的杂色蛤酶解物抑制ACE活性，结果见表3，加酶量0.5% 时，杂色蛤酶解产物ACE抑制活性最佳。
[0026] 表3加酶量对胰蛋白酶酶解杂色蛤酶解物抑制ACE活性的影响
[0027]
[0028] 酶解时间考察:取杂色蛤软体肉渣称重，加3倍量水匀浆，各取适量匀浆液加入胰 蛋白酶，加酶量为肉渣重量的〇. 5%，在pH 8.5，温度45°C下，考察酶解反应时间对酶解产物 抑制ACE活性的影响实验，分别考察1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3. Oh酶解得到的杂色蛤酶解物 的抑制ACE活性，结果见表4，结果表明，酶解时间2小时，得到的酶解物ACE抑制活性最强。 [0029] 表4不同酶解时间对胰蛋白酶酶解杂色蛤酶解物抑制ACE活性的影响
[0030]
[0032] 经过活性跟踪评价验证结果表明，采用胰蛋白酶作为水解酶，并且加入量为杂色 蛤肉渣重量的0.6 %，酶解的温度为45°C，酶解的pH为8.5，酶解反应时间为2h时，具有最佳 的酶解效果，可以将具有血管紧张素转化酶抑制活性的多肽分解出来，有利于后续进一步 纯化得到活性肽，具有很好的技术效果。
[0033] 本发明所述的血管紧张素转化酶抑制肽在制备防治高血压药物中的应用。
[0034] 有益效果：本发明提供的血管紧张素转化酶抑制肽和现有技术相比具有以下优 占.
[0035] 本发明通过大量试验对杂色蛤中具有抑制血管紧张素转化酶活性的多肽成分进 行跟踪筛选，通过优选工艺的酶解，离子交换色谱和反相高效液相色谱分离纯化方法，获得 具有很好的抑制血管紧张素转化酶活性的多肽。并且本发明对活性多肽进行氨基酸序列分 析，确定氨基酸序列为 Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lys。本 发明工艺设计合理，可操作性强，为低值贝类开发新的临床用途，具有很好的应用前景。
【附图说明】
[0036] 图1为本发明提供的血管紧张素转化酶抑制肽的质谱图。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形 式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0038] 实施例1
[0039] 血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其包括以下步骤：
[0040] (1)杂色蛤酶解物的制备：
[0041 ]将杂色蛤软体洗净泥沙，加入3倍量水煎煮2次，每次40分钟，分离煎煮液与肉渣， 沥干;取肉渣，加3倍量水匀浆后，加入酶活性为30000U/g的胰蛋白酶酶解，胰蛋白酶的加入 重量为肉渣重量的〇. 60 %，酶解的温度为45°C，酶解的pH为8.50，酶解反应时间为2h;酶解 结束后，于沸水浴灭活，然后加入一定量的无水乙醇进行醇沉，最终形成70%的醇溶液，并 在4 °C下静置24小时，再取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉；
[0042] (2)离子交换色谱纯化：
[0043] 取步骤（1)酶解得到的冻干粉以去离子水溶解后，通过AKTA 900FPLC系统进行离 子交换分离纯化，流动相为:A相:水，B相：lmol/L的氯化钠溶液;洗脱条件为：lmol/L氯化钠 溶液0%(0~40111；[11)，11]1〇1凡氯化钠溶液0%~100%(40~140111；[11);流速:31]1]^/111；[11;检测波 长:220nm。酶解物被分离成不同组分，按实施例4方法分别测定各组分ACE抑制活性，取活性 最好的部分，冷冻干燥，得冻干粉。
[0044] (3)反向色谱分离纯化：
[0045] 取步骤(2)分离后的冻干粉以甲醇溶解，经过反相高效液相色谱分离，流动相为:A 相:0.1 %甲酸;B相：甲醇，洗脱程序为:B相甲醇体积由0 %至10 % (0~1 Omiη )，B相甲醇体积 由20%至40%(10~20111；[11)，13相甲醇体积由40%至100%(20~25111；[11);流速：101111^/111；[11;柱 温:30°C，检测波长为220nm，共分离收集到三组成分，然后进行冷冻干燥，得到血管紧张素 转化酶抑制肽。
[0046] 实施例2血管紧张素转化酶抑制肽的序列分析
[0047]取实施例1制备得到的血管紧张素转化酶抑制肽，采用Nano-LC-ESI-MS/MS分析多 肽的氨基酸序列，质谱条件为:ESI源，扫描方式:正离子模式，质量扫描范围：50~1000m/z; 分析得到活性多肽分子量为1477.80Da，质谱检测图如图1所示，测定得到氨基酸序列为： Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lyso
[0048] 实施例3血管紧张素转化酶抑制肽的合成
[0049] 根据实施例2获得的氨基酸序列，采用固相合成的方法，合成血管紧张素转化酶抑 制肽 Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-I le-Asp-Thr-Gly-I le-Gly-Met-Thr-Lys，合成后的多肽通过 HPLC分析纯度为98%，质谱测定分子量为1477.80Da，与纯化多肽分子量一致，二级质谱碎 片与纯化多肽碎片一致。
[0050] 实施例4血管紧张素转化酶抑制肽活性测试
[0051] 本发明采用高效液相色谱法测定血管紧张素转化酶抑制活性，具体步骤如下：取 实施例1和实施例3分别制备得到的抑制肽溶于O.lmol/L硼酸缓冲液(含0.3mol/L NaCl，pH 8.3)制成相应的样品液。血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)分别用 0.1mol/L硼酸缓冲液(含0.3mol/L NaCl，pH 8.3)配成 100mU/mL ACE溶液和5mmol/L HHL溶 液。将30yL HHL和10yL样品（或缓冲溶液)混匀后，于37°C保温5min，再加入20yL的ACE启动 反应，混匀后继续于37°C下反应lh，迅速加入70yL HC1 (lmol/L)终止反应，用高效液相色谱 分析结果。同时用硼酸缓冲液代替样品溶液做空白对照。
[0052] 色谱条件：Xbridge_Ci8 柱（4.6X250mm，5ym，美国 Waters 公司）；流动相：甲醇-0.05 %三氟乙酸水溶液，流速：1. OmL/min;检测波长:228nm;柱温:30 °C ;进样量：10yL。梯度 条件：甲醇25%~70%(0~30min)。
[0053] ACE抑制率（％ ) = [ l-(Ai/Aj) ] X 100
[0054] 式中:Ai为样品组马尿酸峰面积，Aj为空白组的马尿酸峰面积。
[0055] 测定得到本发明实施例1和实施例3制备得到的血管紧张素转化酶抑制肽的体外 ACE抑制IC50均为5.75μΜ，和现有技术相比取得了很好的预料不到的技术效果。
[0056] 本发明从杂色蛤中提取纯化制备得到具有血管紧张素转化酶抑制活性的多肽，具 有很好的抗高血压活性，并且安全性能高，具有广阔的应用前景。
[0057] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种血管紧张素转化酶抑制肽，其特征在于，该抑制肽具有下述的氨基酸序列:Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lyso2. 权利要求1所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 杂色蛤酶解物的制备： 将杂色蛤软体洗净泥沙，加入3至8倍量水煎煮1至3次，分离煎煮液与肉渣，沥干;取肉 渣，加3至8倍量水匀浆后，加入酶酶解，酶的加入重量为肉渣重量的0.01 %-2.0%，酶解的 温度为37至50°C，酶解的pH为7至9，酶解反应时间为2至6h;酶解结束后，于沸水浴灭活，然 后加入无水乙醇进行醇沉，静置，再取上清液，浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉； (2) 离子交换色谱纯化： 取步骤(1)酶解得到的冻干粉以去离子水溶解后，经过离子交换色谱分离，流动相为:A 相为水，B相为lmol/L的氯化钠溶液;洗脱条件为:0~40min内lmol/L氯化钠溶液体积比为 0%，40~140min内lmol/L氯化钠溶液体积比为0 %~100 % ;流速：3mL/min;检测波长： 220nm;经过离子交换色谱分离得到不同组分的酶解物，分别测定各组分ACE抑制活性，取活 性最好的部分，冷冻干燥，得冻干粉； (3) 反向色谱分离纯化： 取步骤(2)分离后的冻干粉以甲醇溶解，经过反相高效液相色谱分离，流动相为:A相为 体积浓度0.1 %甲酸;B相为甲醇，洗脱程序为:0~1 Omin内B相甲醇体积由0 %至10 %，10~ 20min内B相甲醇体积由20 %至40 %，20~25min B相甲醇体积由40 %至100 % ;流速：10mL/ min;柱温:30°C，检测波长为220nm，分离收集到氨基酸序列为Asn-Thr-Leu-Thr-Leu-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gly-Met-Thr-Lys的血管紧张素转化酶抑制肽。3. 根据权利要求2所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，所述的酶 为胰蛋白酶，所述胰蛋白酶活性为10000至50000U/g。4. 根据权利要求2所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，所述的酶 的加入重量为肉渣重量的0.1~1%，酶解的温度为30~50 °C，酶解的pH为6~9,酶解反应时 间为1~5h。5. 根据权利要求4所述的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于，所述的酶 的加入重量为肉渣重量的0.6%，酶解的温度为45°C，酶解的pH为8.5，酶解反应时间为2h。6. 权利要求1所述的血管紧张素转化酶抑制肽在制备防治高血压药物中的应用。
【文档编号】C12P21/06GK106084013SQ201610740899
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月26日
【发明人】刘睿, 盛乃娟, 吴体智, 王倩, 陈晓钰, 李晓芳, 吴皓
【申请人】南京中医药大学