Sld5蛋白及其编码基因在抗流感病毒中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种SLD5蛋白及其编码基因在抗流感病毒中的应用。本发明所提供的应用具体为由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在制备抗流感病毒的药物或免疫增强剂中的应用。实验证明，本发明所提供的蛋白质能够与流感病毒基质蛋白M1进行相互作用，能够抑制流感病毒在宿主中的复制，达到清除病毒，治疗疾病的目的，适用于流感病毒的预防和治疗，易于大规模推广和应用。
【专利说明】
SLD5蛋白及其编码基因在抗流感病毒中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种SLD5蛋白及其编码基因在抗流感病毒中的应 用。
【背景技术】
[0002] 流感病毒对人类的健康造成极大危害，在已经过去的20世纪，人类发生过4次大规 模的流感流行，包括1918年的"西班牙流感"大流行、1957年的"亚洲流感"大流行、1968年的 "香港流感"大流行和1977年的"俄罗斯流感"大流行。这些流感的大流行使得人类生命财产 及经济发展遭受了巨大的打击。
[0003] 流感病毒属于正粘病毒科，是一类分节段、有包膜的单链负链RNA病毒，传染性强 且易发生变异，包括甲、乙、丙三型，可感染不同宿主。其中甲型流感病毒可以感染人类、禽 类及哺乳动物，是引起季节性流行性感冒的主要病原体;乙型、丙型流感病毒则主要感染人 类。甲型流感病毒又可依据其表面抗原血凝素（Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶 (Neuraminidase，NA)种类分为不同亚型，截止到目前为止已经发现了 17种亚型的HA和10种 亚型的NA。甲型流感病毒近年来在我国呈现季节性流行趋势。
[0004] 流感病毒颗粒的表面是来自于宿主细胞的脂质双层结构，其中的两种主要表面抗 原HA和NA以及一种离子通道蛋白M2。脂质双层内部为来自病毒的基质蛋白（Matrix 卩1'(^6；[11，]\11)。病毒粒子核心为8条核糖核蛋白复合体(1?；[1301111016(^1'0丨6；[11&311^)161，1^^ ：))。 在维持病毒形状与完整性上起重要作用。Ml蛋白参与病毒复制过程多个环节，具有调控病 毒的转录和被感染细胞的细胞核、细胞衆之间的物质运输作用，以及参与病毒的出芽过程， 是流感病毒的主要成分之一。鉴于在甲型和乙型流感中的高度保守性，Ml蛋白被认为是设 计新的抗病毒药物的理想靶点。因此，研究宿主中与Ml特异相互作用的蛋白有助于新药的 研发。
[0005] 酵母双杂交技术可以在组学水平鉴定互作蛋白。通过筛选小鼠肺部组织特异性的 酵母双杂交文库，我们鉴定到SLD5是Ml的互作蛋白。SLD5包含223个氨基酸，在真核生物中 高度保守，人和小鼠的SLD5蛋白氨基酸序列一致性为87.9% ALD5是GINS复合体的组成成 员，在GINS复合体组装过程中起中心作用。GINS复合体由四个蛋白组成，分别为Psfl、Psf2、 Plf3和SLD5。在DNA合成起始时期，GINS复合体与MCM复合体和⑶C45蛋白结合，形成CMG复制 叉解旋酶，启动DNA复制。敲低SLD5后的细胞系停滞在G0/G1期，细胞生长受到显著抑制。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种SLD5蛋白及其编码基因在抗流感病毒中的应用。
[0007] 本发明的一个方面，提供蛋白质或其编码基因在制备抗流感病毒的药物或免疫增 强剂中的应用；
[0008] 所述蛋白质为如下(a)或(b):
[0009] (a)由SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010] (b)将SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且具有抗流感病毒活性的衍生的蛋白质。
[0011] 本发明的另一个方面，提供蛋白质及其编码基因在如下(al)和/或(a2)和/或(a3) 中的应用：
[0012] (al)制备能够抑制流感病毒复制的药物；
[0013] (a2)制备能够抑制流感病毒复制的免疫增强剂；
[0014] (a3)制备能够结合并抑制流感病毒Ml蛋白的药物；
[0015] 为了便于蛋白（SLD5)的纯化，可在由SEQ ID N0:1的氨基酸残基序列组成的蛋白 质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0016] 表1:标签的序列
[0017] -
[0018]
[0019] 上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID N0:2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨 基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0020] 在上述应用中，所述蛋白质的编码基因（SLD5编码基因）是如下（1)至(3)中任一所 述的DNA分子：
[0021] (l)SEQ ID从)：2所示的0嫩分子；
[0022] (2)在严格条件下与（1)所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0023] (3)与（1)或（2)中任一所述的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的 DNA分子。
[0024] 在上述应用中，所述流感病毒可为A型或B型流感病毒。
[0025]在本发明的一个实施例中，所述流感病毒具体为H1N1型流感病毒A/PR8/1934株 [0026]所述SLD5蛋白或其编码基因的抗流感病毒功能具体体现在如下:所述SLD5蛋白能 够结合流感病毒Ml蛋白，从而抑制流感病毒的复制。
[0027]本发明的再一个目的是提供含有SEQ ID N0:2所示的DNA分子的抗流感病毒的药 物或免疫增强剂。
[0028]本发明的另一个目的，提供含有SEQ ID N0:2所示的DNA分子且用于制备抗流感病 毒的药物或免疫增强剂的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
[0029] 本发明的又一个方面，提供含有SEQ ID NO: 1所示的蛋白质的抗流感病毒的药物 或免疫增强剂。
[0030] 本发明通过研究C57L/B6小鼠宿主与流感病毒基质蛋白Ml相互作用机制，运用酵 母双杂交技术寻找到了C57L/B6小鼠肺部蛋白中与甲型流感病毒PR8基质蛋白Ml相互作用 的靶蛋白SLD5,并通过实验验证了SLD5蛋白与流感病毒基质蛋白Ml的相互作用，并且发现 SLD5蛋白可以在流感病毒感染过程(24-48h)抑制流感病毒复制水平。本发明的研究结果为 开发基于宿主细胞基因靶点的抗病毒药物提供了新的途径。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明实施例1中酵母双杂交结果；
[0032] 图2为本发明实施例2中SLD5蛋白与流感病毒基质蛋白Ml免疫共沉淀结果；
[0033] 图3为本发明实施例3中过表达细胞系(A549-SLD5)与对照细胞系(A549-Vector) 免疫印迹结果；
[0034] 图4为本发明实施例3中过表达细胞系(A549-SLD5)与对照细胞系(A549-Vector) 感染流感病毒PR8病毒后病毒滴度对比图。
【具体实施方式】
[0035]以下结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】进行更加详细的说明，以便能 够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的【具体实施方式】和实 施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
[0036] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 实施例1通过酵母双杂交技术筛选特异性抗病毒蛋白
[0039] (1)使用酵母双杂交技术，筛选B6小鼠肺部组织中与流感病毒基质蛋白Ml相互作 用的蛋白，寻找B6小鼠宿主特异性抗病毒蛋白。
[0040] (2)取三只6-8周龄雌性B6小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）的肺 部组织液氮研磨，使用Tr i zo 1法提取总RNA。
[0041] (3)使用Clontech公司Make Your 0wn"Mate & Plate?"Library System试剂盒将 总RNA(l-2yg)反转录为cDNA，具体步骤如下：
[0042] 1)将如下试剂加到0.25ml离心管中，混合均匀，简短离心；
[0043] 试剂：1 - 2 μ 1 步骤（2 )中获得的 R N A ; 1 · 0 μ 1 的 C D S ΙΠ / 6 引物（5'_ ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-NNNNNN-3 '）； 1-2μ1;用去离子水补足体积至4. ΟμL。
[0044] 2)72°C温育2min;再放在冰上冷却2min;简短离心。
[0045] 3)离心管放置在室温下，加入下列试剂后，轻敲混匀，简短离心。
[0046] 试剂：2·0μ1 5X First-Strand Buffer; Ι.ΟμΙ DTT(20mM);1.0yl dNTP Mix (lOmM); 1. ΟμL MMLV逆转录酶；用去离子水补足体积至9. ΟμL。
[0047] 4)在25-30°C的室温下，温育lOmin;再在42°C温育10min。
[0048] 5)加入 1·ΟμL BD SMART III寡核苷酸。
[0049] 6)在空气培养箱或者热盖PCR仪上，42°C温育一个小时。
[0050] 7)放置反应试管75°C、10min，终止首链合成。
[0051 ] 8)室温下冷却，在加1.0μ1(3个单位)RNase H;在37°C温育20min。
[0052] 9)从首链合成物取2μ1液体并加入到一个干净的、预冷的、0.5ml试管中，放置在冰 上备用。
[0053] (4)通过LD-PCR扩增首链合成获得的ds cDNA。
[0054] (5)将(4)中获得的ds cDNA与pGADT7质粒(购自Clontech公司）共转化Y187酵母 (购自Clontech公司）感受态细胞，建立B6小鼠肺部组织酵母cDNA文库。
[0055] 1)用ds cDNA和pGADT7-Rec(购自Clontech公司）转化Y187酵母菌株（购自 Clontech公司）准备酵母的感受态细胞;在无菌预冷的15ml离心管加入下列试剂:20μ1 ds cDNA；6ul pGADT7-Rec；20ul Herring Testes Carrier DNA〇
[0056] 转移46μ1 Herring DNA到一个离心管中并在100°C加热5min。立即把试管放在冰 浴中冷却DNA。加 DNA到15ml反应试管前再进行一次加热及冷却步骤。加600μ1 Y187酵母感 受态细胞到Herring DNA中，轻轻涡旋震荡混合，加入2.5ml PEG/LiAc溶液，轻轻涡旋震荡 混合;30°C温育45min，每隔15min混合一次细胞;加入160μ1 DMS0，混合，再放置试管到42°C 水浴，20min。隔lOmin混合一次细胞；700 X g离心5min，弃掉上清，用3mlYPD Plus液体培养 基重新悬浮。30°C温育，摇动gOminJOOXg离心5min，弃掉上清，用30ml NaCl(0.9%)溶液 重新悬浮。
[0057] 2)在SD/_Leu平板上选择转化子
[0058] 将1)获得的Y187酵母菌株悬浮液铺平板，每个150mm平板上铺展150μ1悬浮液。 (注:检测转化效率，铺1〇〇μ1 1:10,1:100,1:1，〇〇〇，andl: 10,000稀释液在100-mm SD/-Leu 平板上。）
[0059] 上面向下30°C温育平板直到克隆出现(3-4天）。
[0060] 计算转化效率。期望结果：多1 X 106transformants/3yg pGADT7_Rec。
[0061] 3)收集转化子
[0062] 4°C冷却平板3-4小时，每个平板加入5ml冷冻培养基;使用无菌的玻璃棒轻轻的搅 动使细胞进入液体;汇集所有的液体到烧瓶中，混合均匀。使用记数计计算细胞的密度。每 lml等份保存在-80°C下。
[0063] (6)将H1N1甲型流感病毒PR8株的MlcDNA连接到pGBKT7载体(购自Clontech公司） EcoRI与Sail酶切位点间作为诱t耳质粒(使用Promega公司的T4DNA ligase试剂盒，根据试 剂盒的说明书具体操作），利用MATCHMAKER Two-Hybrid System筛选与流感病毒Ml蛋白相 互作用的小鼠宿主蛋白，具体步骤如下：
[0064] 1)融合文库宿主菌和诱饵菌株：
[0065] a)将诱饵质粒pGBKT7-Ml转化Y2H GOLD菌株(购自Clontech公司），铺SD/-Trp平板 30 °C培养2-3天。
[0066] b)挑一个直径2-3mm克隆至50毫升SD/-Trp液体培养基中，250-270rpm，30°C培养 至0D值为0.8(16-20小时）。离心收集菌体，用4-5毫升SD/-Trp液体培养基重悬。
[0067] c)取lml步骤(5)中获得的B6小鼠肺部组织酵母cDNA文库放置30°C水浴锅里解冻。 将解冻后的cDNA酵母文库与上一步得到的Y2H GOLD菌液混合加入2L的三角瓶中。
[0068] d)加入45ml 2X YPDA/Kan(50μg/ml)。轻轻摇动。
[0069] 6)45印111转速，30。(：温育20-24小时。
[0070] f)20个小时融合后，在显微镜下检查一滴融合培养物，如果合子存在，进行下一步 操作。如果合子不存在，继续培养4个小时。
[0071] g)把融合混合物转移到一个无菌100ml的离心管底部。l，000Xg离心10min。用 0.5X YPDA/Kan (50μg/ml)冲洗融合烧瓶两次(每次用50ml冲洗）。汇集冲洗液并用它重新悬 浮细胞。
[0072] h)l，000Xg离心10min。加入 10ml 0.5XYPDA/Kan(50μg/ml)培养基。
[0073] 2)选择表达相互作用蛋白的酵母二倍体：
[0074] 测定融合效率，铺100μΙ的1:10，000，1:1，000，1:100，和1:10稀释的融合培养物于 三个培养基（100mm平板）：30/-1^11、30/-1'印和30/-1^11/-1'印。铺展剩余的融合培养物于丁00 或者QD0平板(200μ1 cells/150mm平板）。在TD0或QD0平板上生长的酵母单克隆即为可能与 流感病毒Ml蛋白相互作用的宿主蛋白，继续测序鉴定。
[0075] 3)将2)中筛选出的表达相互作用蛋白的酵母菌株克隆进行质粒DNA提取，并转化 大肠杆菌DH5a细胞，而后再进行测序。测序结果在http: //blast. ncbi . nlm. nih. gov网站进 行序列比对，结果发现提交的基因序列为SLD5。
[0076] 如图1所示，Ml和SLD5共同转化的酵母菌能在添加 Aba和X-a-Gal的四缺培养基上 生长并变蓝，表明两者能相互作用。而单独转化Ml和SLD5与空白质粒的酵母菌在添加 Aba和 X-a-Gal的四缺培养基上都不能生长。
[0077]实施例2免疫共沉淀验证互作
[0078] 将甲型流感病毒PR8株基质蛋白Ml与SLD5蛋白（核苷酸序列见SEQ ID N0:1)全长 cDNA分别构建到真核表达质粒pcDNA_FLAG、pCI_GFP中（0gawa，K.，Tanaka，Y.，Uruno，T.， Duan,X.F.,Harada,Y.,Sanematsu,F.,Yamamura,K.,Terasawa,M.,Nishikimi,A.,Cote, J.F.,et al. (2014).D0CK5functions as a key signaling adaptor that links Fc epsilon RI signals to microtubule dynamics during mast cell degranulation.Journal of Experimental Medicine 211,1401-1413·质粒pcDNA-FLAG、 pCI-GFP公众自本申请的申请日起二十年可从中国科学院微生物研究所获得），具体步骤包 括：
[0079] (1)设计甲型流感病毒PR8株基质蛋白Ml全长引物，左右两端添加酶切位点EcoRI、 Xhol 酶切位点（Ml-F: 5'-GCCGAATTCatgagtcttctaaccga_3' ；M1_R: 5'-CAGCTCGAGcttgaaccgttgcat-3'），连接到pCI-FLAG质粒中，获得pCI-Ml-FLAG。
[0080] (2)设计SLD5蛋白全长引物，左右两端分别添加 EcoRI、Xho頂每切位点（引物序列： SLD5-F:5 '-cgGAATTCatgacggaggttctg-3 '；SLD5-R:5 ' _tg aCTCGAGttatattagctgaac-3 '）， 连接到pCI-GFP质粒中，获得pCI-GFP-SLD5。
[0081 ]将构建好的分别含有Ml和SLD5蛋白的cDNA序列的两个质粒共同转染293T细胞： 48h 后裂解细胞提取蛋白，使用 ANTI-FLAG^MAffinity Gel purified immunoglobulin(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)进行免疫共沉淀（IP)，将IP产物与 总蛋白使用SLD5抗体进行western blot，验证SLD5是否与流感病毒Ml蛋白具有相互作用；
[0082]结果:如图2所示，当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白 质一蛋白质间的相互作用被保留了下来，如果用蛋白质FLAG (Ml)的抗体免疫沉淀FLAG (Ml)，那么与SLD5在体内结合的蛋白质SLD5也能沉淀下来(见泳道4)。反之，阴性对照组没 有转染Ml，因此SLD5无法被沉淀下来(见泳道3)。
[0083]实施例3 SLD5稳定表达细胞系的构建及感染实验
[0084] 使用慢病毒表达载体pCDH-CMV(购自System Biosciences，Inc公司）构建SLD5稳 定表达细胞系，具体步骤如下：
[0085] (1)在SLD5两端设计XbaI、EcoRI酶切位点，插入pCDH-CMV载体中，获得载体pCDH- SLD5；
[0086] (2)使用TOI转染试剂将pCDH-CMV与PCDH-SLD5分别转染至A549细胞（Liu，D.， Sheng，C.J.，Gao，S.J.，Yao，C.，Li，J.D.，Jiang，W.，Chen，H.M.，Wu，J.X.，Pan，C.C.，Chen， S.,et al.(2015).S0CS3Drives Proteasomal Degradation of TBKland Negatively Regulates Antiviral Innate Immunity.Molecular and Cellular Biology 35,2400-2413.公众自本申请的申请日起二十年可从中国科学院微生物研究所获得）中，具体操作如 下：
[0087] a)准备40%-80%的A549细胞(6-well，5 X 105/well)，阴性对照（pCDH-CMV)和目 的基因（PCDH-SLD5)各一个孔；
[0088] b)在400ul无血清DMEM培养液中加入2yg质粒，混合均匀；
[0089] c)在b)的混合液中加入4μ 1的PEI转染试剂（lmg/ml)，混合均匀;室温静置10分钟；
[0090] d)向c)的混合液中加入1. 1ml的2%FBS/DMEM液体培养基，混合均匀；
[0091] e)吸干细胞培养液，将混合液全部加入；
[0092] f)在37°C培养3小时，而后换成正常培养基（10%FBS/DMEM);在24-48小时后检测 基因表达。
[0093] (3)出现绿色荧光后，使用puromycin(5μg/ml)筛选阳性细胞，大约2周。而后使用 流式细胞仪分选GFP高表达细胞，即为A549-SLD5 (过表达)及A549-CMV (对照)细胞系。
[0094]利用蛋白印迹实验验证SLD5蛋白水平，如图3所示，在过表达细胞系中，SLD5蛋白 水平明显升高。
[0095] 分别将SLD5表达细胞系A549-SLD5与对照细胞系A549-CMV感染PR8病毒（Μ0Ι = 0.01)后，在感染后24小时和48小时通过空斑分析法(Plaque assay)测定病毒滴度，从图中 可以看出感染24和48小时后SLD5过表达的细胞系病毒滴度相较于对照组下降了约50%。结 果:如图4所示，显示SLD5可以抑制流感病毒复制水平。
[0096]最后应说明的是:显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并 非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做 出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引 申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
【主权项】
1. 蛋白质或其编码基因在制备抗流感病毒的药物或免疫增强剂中的应用，其特征在 于： 所述蛋白质为如下(a)或(b): (a) 由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 将SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有抗流感病毒活性的衍生的蛋白质。2. 蛋白质及其编码基因在如下(al)和/或(a2)和/或(a3)中的应用： (al)制备能够抑制流感病毒复制的药物； (a2)制备能够抑制流感病毒复制的免疫增强剂； (a3)制备能够结合并抑制流感病毒Ml蛋白的药物。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述蛋白质的编码基因是如下（1)至 (3)中任一所述的DNA分子： (1) SEQ ID勵:2所示的0嫩分子； (2) 在严格条件下与（1)所述的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子； (3) 与（1)或(2)中任一所述的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分 子。4. 含有SEQ ID NO:2所示的DNA分子的抗流感病毒的药物或免疫增强剂。5. 含有SEQ ID N0:2所示的DNA分子且用于制备抗流感病毒的药物或免疫增强剂的重 组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。6. 含有SEQ ID NO: 1所示的蛋白质的抗流感病毒的药物或免疫增强剂。
【文档编号】A61K38/17GK106084025SQ201610440135
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】方敏, 赵文明, 朱莉
【申请人】中国科学院微生物研究所