识别prame抗原短肽的t细胞受体的制作方法

文档序号:10713845阅读:601来源:国知局
识别prame抗原短肽的t细胞受体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种能够特异性结合衍生自PRAME抗原的短肽RYLFPPLFM的T细胞受体(TCR),所述抗原短肽RYLFPPLFM可与HLA A2402形成复合物并一起被呈递到细胞表面。本发明还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。另外,本发明还提供了转导本发明TCR的细胞。
【专利说明】
识别PRAME抗原短肽的T细胞受体
技术领域
[0001] 本发明涉及能够识别源自PRAME抗原短肽的TCR,本发明还涉及转导上述TCR来获 得的PRAME特异性的Τ细胞,及他们在预防和治疗PRAME相关疾病中的用途。
【背景技术】
[0002] PRAME 为黑色素瘤特异性抗原(preferentially expressed antigen of melanoma,PRAME), 在88%初发和95%转移黑色素瘤中都有表达(Ikeda H, et al. Iimmity, 1997, 6 (2) : 199-208),正 常皮肤组织和良性黑素细胞则不表达。PRAME在细胞内生成后被降解成小分子多肽,并与 MHC (主组织相容性复合体)分子结合形成复合物,被呈递到细胞表面。RYLFPPLFM是衍生自 PRAME抗原的短肽,是PRAME相关疾病治疗的一种靶标。除了黑色素瘤,PRAME还在多种肿 瘤表达,包括肺鳞状细胞癌、乳腺癌、肾细胞癌、头颈部肿瘤、霍杰金氏淋巴瘤、肉瘤及成神 经管细胞瘤等(van,t Veer LJ,et al. Nature, 2002, 415 (6871) :530-536 ;Boon K,et al. Oncogene, 2003, 22(48) :7687-7694)另外,其在白血病中PRAME亦有显著表达,急性淋巴细 胞白血病17%~42%,急性粒细胞白血病30%~64%(3七6;[1^&(3110,6七&1.0&1106166116七 Cytogene,2002, 138(1) :89-91)。对于上述疾病的治疗,可以采用化疗和放射性治疗等方 法,但都会对自身的正常细胞造成损害。
[0003] T细胞过继免疫治疗是将对靶细胞抗原具有特异性的反应性T细胞转入病人体 内,使其针对靶细胞发挥作用。T细胞受体(TCR)是T细胞表面的一种膜蛋白,其能够识别 相应的靶细胞表面的抗原短肽。在免疫系统中,通过抗原短肽特异性的TCR与短肽-主组织 相容性复合体(PMHC复合物)的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触, 然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用,引起一系列后续的细胞信 号传递和其他生理反应,从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。因 此,本领域技术人员致力于分离出对NY-ES0-1抗原短肽具有特异性的TCR,以及将该TCR转 导T细胞来获得对NY-ES0-1抗原短肽具有特异性的T细胞,从而使他们在细胞免疫治疗中 发挥作用。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种识别PRAME抗原短肽的T细胞受体。
[0005] 本发明的第一方面,提供了一种T细胞受体(TCR),所述TCR能够与RYLFPPLFM-HLA A2402复合物结合。
[0006] 在另一优选例中,所述TCR包含TCR α链可变域和TCR β链可变域,所述TCR α链 可变域的CDR3的氨基酸序列为VVNHFIDSGYALN(SEQ ID Ν0:12);和/或所述TCR0链可变 域的 CDR3 的氨基酸序列为 ATSPDASNEKLF(SEQ ID Ν0:15)。
[0007] 在另一优选例中,所述TCR α链可变域的3个互补决定区(⑶R)为:
[0008] a CDR1-NSASQS (SEQ ID NO:10)
[0009] a CDR2-VYSSGN (SEQ ID NO:11)
[0010] a CDR3-VVNHFIDSGYALN (SEQ ID NO:12);和 / 或
[0011] 所述TCRi3链可变域的3个互补决定区为:
[0012] β CDR1-KGHDR (SEQ ID NO:13)
[0013] β CDR2-SFDVKD (SEQ ID NO:14)
[0014] β CDR3-ATSPDASNEKLF (SEQ ID NO:15)。
[0015] 在另一优选例中,所述TCR包含TCRa链可变域和TCRf3链可变域,所述TCRa链 可变域为与SEQ ID NO: 1具有至少90%序列相同性的氨基酸序列;和/或所述TCRi3链可 变域为与SEQ ID N0 :5具有至少90%序列相同性的氨基酸序列。
[0016] 在另一优选例中,所述TCR包含a链可变域氨基酸序列SEQ ID N0:1。
[0017] 在另一优选例中,所述TCR包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO: 5。
[0018] 在另一优选例中,所述TCR为α β异质二聚体,其包含TCR a链恒定区TRAC*01 和 TCR0 链恒定区 TRBC1*01 或 TRBC2*01。
[0019] 在另一优选例中,所述TCR的a链氨基酸序列为SEQ ID NO :3和/或所述TCR的 β链氨基酸序列为SEQ ID N0:7。
[0020] 在另一优选例中,所述TCR是可溶的。
[0021] 在另一优选例中,所述TCR为单链。
[0022] 在另一优选例中,所述TCR是由a链可变域与β链可变域通过肽连接序列连接 而成。
[0023] 在另一优选例中,所述TCR在a链可变区氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或 第94位,和/或a链J基因短肽氨基酸倒数第3位、倒数第5位或倒数第7位中具有一个 或多个突变;和/或所述TCR在β链可变区氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94 位,和/或β链J基因短肽氨基酸倒数第2位、倒数第4位或倒数第6位中具有一个或多 个突变,其中氨基酸位置编号按MGT(国际免疫遗传学信息系统)中列出的位置编号。
[0024] 在另一优选例中,所述TCR的a链可变域氨基酸序列包含SEQ ID Ν0:32和/或 所述TCR的β链可变域氨基酸序列包含SEQ ID N0:34。
[0025] 在另一优选例中,所述TCR的氨基酸序列为SEQ ID NO: 30。
[0026] 在另一优选例中,所述TCR包括(a)除跨膜结构域以外的全部或部分TCRa链;以 及(b)除跨膜结构域以外的全部或部分TCRi3链;
[0027] 并且(a)和(b)各自包含功能性可变结构域,或包含功能性可变结构域和所述 TCR链恒定结构域的至少一部分。
[0028] 在另一优选例中,半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域之间形成人工二 硫键。
[0029] 在另一优选例中,在所述TCR中形成人工二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列 的一组或多组位点:
[0030] TRAO01 外显子 1 的 Thr48 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外显子 1 的 Ser57 ;
[0031] TRAO01 外显子 1 的 Thr45 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外显子 1 的 Ser77 ;
[0032] TRAO01 外显子 1 的 TyrlO 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外显子 1 的 Serl7 ;
[0033] TRAO01 外显子 1 的 Thr45 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外显子 1 的 Asp59 ;
[0034] TRAO01 外显子 1 的 Serl5 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外显子 1 的 Glul5 ;
[0035] TRAO01 外显子 1 的 Arg53 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外显子 1 的 Ser54 ;
[0036] TRAO01 外显子 1 的 Pro89 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外显子 1 的 Alal9 ;和
[0037] TRAO01 外显子 1 的 TyrlO 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外显子 1 的 Glu20。
[0038] 在另一优选例中,所述TCR的α链氨基酸序列为SEQ ID NO:26和/或所述TCR 的β链氨基酸序列为SEQ ID N0:28。
[0039] 在另一优选例中,所述TCR的α链可变区与β链恒定区之间含有人工链间二硫 键。
[0040] 在另一优选例中,其特征在于,在所述TCR中形成人工链间二硫键的半胱氨酸残 基取代了选自下列的一组或多组位点:
[0041] TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸;
[0042] TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61位氨基酸;
[0043] TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸;或
[0044] TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸。
[0045] 在另一优选例中,所述TCR包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以 外的全部或部分β链恒定域,但其不包含α链恒定域,所述TCR的α链可变域与β链形 成异质二聚体。
[0046] 在另一优选例中,所述TCR的α链和/或β链的C-或Ν-末端结合有偶联物。
[0047] 在另一优选例中,与所述Τ细胞受体结合的偶联物为可检测标记物、治疗剂、ΡΚ修 饰部分或任何这些物质的组合。优选地,所述治疗剂为抗-CD3抗体。
[0048] 本发明的第二方面,提供了一种多价TCR复合物,其包含至少两个TCR分子,并且 其中的至少一个TCR分子为本发明第一方面所述的TCR。
[0049] 本发明的第三方面,提供了一种核酸分子,所述核酸分子包含编码本发明第一方 面所述的TCR分子的核酸序列或其互补序列。
[0050] 在另一优选例中,所述核酸分子包含编码TCRa链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO:33。
[0051 ] 在另一优选例中,所述的核酸分子包含编码TCR β链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO :6 或 SEQ ID NO:35。
[0052] 在另一优选例中,所述核酸分子包含编码TCR a链的核苷酸序列SEQ ID NO :4和 /或包含编码TCRi3链的核苷酸序列SEQ ID N0:8。
[0053] 本发明的第四方面,提供了一种载体,所述的载体含有本发明第三方面所述的核 酸分子;优选地,所述的载体为病毒载体;更优选地,所述的载体为慢病毒载体。
[0054] 本发明的第五方面,提供了一种分离的宿主细胞,所述的宿主细胞中含有本发明 第四方面所述的载体或基因组中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子。
[0055] 本发明的第六方面,提供了一种细胞,所述细胞转导本发明第三方面所述的核酸 分子或本发明第四方面所述的载体;优选地,所述细胞为T细胞或干细胞。
[0056] 本发明的第七方面,提供了一种药物组合物,所述组合物含有药学上可接受的载 体以及本发明第一方面所述的TCR、本发明第二方面所述的TCR复合物、本发明第三方面所 述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本发明第六方面所述的细胞。
[0057] 本发明的第八方面,提供了本发明第一方面所述的T细胞受体、或本发明第二方 面所述的TCR复合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本 发明第六方面所述的细胞的用途,用于制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物。
[0058] 本发明的第九方面,提供了一种治疗疾病的方法,包括给需要治疗的对象施用适 量的本发明第一方面所述的T细胞受体、或本发明第二方面所述的TCR复合物、本发明第三 方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的载体、或本发明第六方面所述的细胞、或本发 明第七方面所述的药物组合物。
[0059] 优选地,所述的疾病为肿瘤,优选地所述肿瘤包括黑色素瘤、肺鳞状细胞癌、乳腺 癌、肾细胞癌、头颈部肿瘤、霍杰金氏淋巴瘤、肉瘤、成神经管细胞瘤、白血病(包括但不限 于,急性淋巴细胞白血病,急性粒细胞白血病)、胃癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、头颈部鳞状细 胞癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌等。
[0060] 应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0061] 图la、图lb、图lc、图ld、图le和图If分别为TCRa链可变域氨基酸序列、TCRa 链可变域核苷酸序列、TCR a链氨基酸序列、TCR a链核苷酸序列、具有前导序列的TCR a链 氨基酸序列以及具有前导序列的TCR a链核苷酸序列。
[0062] 图2a、图2b、图2c、图2d、图2e和图2f分别为TCR0链可变域氨基酸序列、TCR0 链可变域核苷酸序列、TCR0链氨基酸序列、TCRi3链核苷酸序列、具有前导序列的TCRi3链 氨基酸序列以及具有前导序列的TCR β链核苷酸序列。
[0063] 图3为单克隆细胞的⑶8+及四聚体-ΡΕ双阳性染色结果。
[0064] 图4a和图4b分别为可溶性TCR α链的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0065] 图5a和图5b分别为可溶性TCR β链的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0066] 图6为纯化后得到的可溶性TCR的胶图。最左侧泳道为还原胶,中间泳道为分子 量标记(marker),最右侧泳道为非还原胶。
[0067] 图7a和图7b分别为单链TCR的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0068] 图8a和图8b分别为单链TCRa链的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0069] 图9a和图9b分别为单链TCRi3链的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0070] 图10a和图10b分别为单链TCR连接序列(linker)的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0071 ] 图11为纯化后得到的可溶性单链TCR的胶图。左侧泳道为分子量标记(marker), 右侧泳道为非还原胶。
[0072] 图12为本发明可溶性TCR与RYLFPPLFM-HLA A2402复合物结合的BIAcore动力 学图谱。
【具体实施方式】
[0073] 本发明人经过广泛而深入的研究,找到了与PRAME抗原短肽RYLFPPLFM(SEQ ID N0:9)能够特异性结合的TCR,所述抗原短肽RYLFPPLFM可与HLA A2402形成复合物并一起 被呈递到细胞表面。本发明还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载 体。另外,本发明还提供了转导本发明TCR的细胞。
[0074] 术语
[0075] MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白质,可以是I类或II类MHC分子。因此,其对 于抗原的呈递具有特异性,不同的个体有不同的MHC,能呈递一种蛋白抗原中不同的短肽到 各自的APC细胞表面。人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体。
[0076] T细胞受体(TCR),是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一 受体。在免疫系统中,通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递 细胞(APC)直接的物理接触,然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作 用,这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应,从而使得不同抗原特异性的T 细胞对其靶细胞发挥免疫效应。
[0077] TCR是由α链/β链或者γ链/δ链以异质二聚体形式存在的细胞膜表面的糖 蛋白。在95%的Τ细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成,而5%的Τ细胞具有由γ和 δ链组成的TCR。天然α β异质二聚TCR具有α链和β链,α链和β链构成α β异源 二聚TCR的亚单位。广义上讲,α和β各链包含可变区、连接区和恒定区,β链通常还在 可变区和连接区之间含有短的多变区,但该多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含 嵌合在框架结构(framework regions)中的3个⑶R(互补决定区),Q)R1、Q)R2和⑶R3〇 ⑶R区决定了 TCR与pMHC复合物的结合,其中⑶R3由可变区和连接区重组而成,被称为超 变区。TCR的α和β链一般看作各有两个"结构域"即可变域和恒定域,可变域由连接的 可变区和连接区构成。TCR恒定域的序列可以在国际免疫遗传学信息系统aMGT)的公开数 据库中找到,如TCR分子α链的恒定域序列为"TRAC*01",TCR分子β链的恒定域序列为 "TRBC1*01"或"TRBC2*01"。此外,TCR的α和β链还包含跨膜区和胞质区,胞质区很短。
[0078] 在本发明中,术语"本发明多肽"、"本发明的TCR"、"本发明的Τ细胞受体"可互换 使用。
[0079] 天然链间二硫键与人工链间二硫键
[0080] 在天然TCR的近膜区C α与C β链间存在一组二硫键,本发明中称为"天然链间二 硫键"。在本发明中,将人工引入的,位置与天然链间二硫键的位置不同的链间共价二硫键 称为"人工链间二硫键"。
[0081] 为方便描述二硫键的位置,本发明中TRAO01与TRBC1*01或TRBC2*01氨基酸序 列的位置编号按从N端到C端依次的顺序进行位置编号,如TRBC1*01或TRBC2*01中,按从 N端到C端依次的顺序第60个氨基酸为P(脯氨酸),则本发明中可将其描述为TRBC1*01 或TRBC2*01外显子1的Pro60,也可将其表述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位 氨基酸,又如TRBC1*01或TRBC2*01中,按从N端到C端依次的顺序第61个氨基酸为Q (谷 氨酰胺),则本发明中可将其描述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Gln61,也可将其表 述为TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸,其他以此类推。本发明中,可变区 TRAV与TRBV的氨基酸序列的位置编号,按照頂GT中列出的位置编号。如TRAV中的某个氨 基酸,頂GT中列出的位置编号为46,则本发明中将其描述为TRAV第46位氨基酸,其他以此 类推。本发明中,其他氨基酸的序列位置编号有特殊说明的,则按特殊说明。
[0082] 发明详述
[0083] TCR 分子
[0084] 在抗原加工过程中,抗原在细胞内被降解,然后通过MHC分子携带至细胞表面。T 细胞受体能够识别抗原呈递细胞表面的肽-MHC复合物。因此,本发明的第一方面提供了一 种能够结合RYLFPPLFM-HLA Α2402复合物的TCR分子。优选地,所述TCR分子是分离的或 纯化的。该TCR的α和β链各具有3个互补决定区(⑶R)。
[0085] 在本发明的一个优选地实施方式中,所述TCR的α链包含具有以下氨基酸序列的 CDR :
[0086] a CDR1-NSASQS (SEQ ID NO:10)
[0087] a CDR2-VYSSGN (SEQ ID NO:11)
[0088] a CDR3-VVNHFIDSGYALN (SEQ ID NO:12);和 / 或
[0089] 所述TCR β链可变域的3个互补决定区为:
[0090] β CDR1-KGHDR (SEQ ID NO:13)
[0091] β CDR2-SFDVKD (SEQ ID NO:14)
[0092] β CDR3-ATSPDASNEKLF (SEQ ID NO:15)。
[0093] 可以将上述本发明的CDR区氨基酸序列嵌入到任何适合的框架结构中来制备嵌 合TCR。只要框架结构与本发明的TCR的CDR区兼容,本领域技术人员根据本发明公开的 CDR区就能够设计或合成出具有相应功能的TCR分子。因此,本发明TCR分子是指包含上述 α和/或β链CDR区序列及任何适合的框架结构的TCR分子。本发明TCRa链可变域为 与SEQ ID NO: 1具有至少90%,优选地95%,更优选地98%序列相同性的氨基酸序列;和/ 或本发明TCRI3链可变域为与SEQ ID N0:5具有至少90%,优选地95%,更优选地98 %序 列相同性的氨基酸序列。
[0094] 在本发明的一个优选例中,本发明的TCR分子是由α与β链构成的异质二聚 体。具体地,一方面所述异质二聚TCR分子的α链包含可变域和恒定域,所述α链可变域 氨基酸序列包含上述 α 链的 CDR1(SEQ ID N0:10)、CDR2(SEQ ID N0:11)和 CDR3(SEQ ID NO: 12)。优选地,所述TCR分子包含a链可变域氨基酸序列SEQ ID NO: 1。更优选地,所 述TCR分子的α链可变域氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。另一方面,所述异质二聚TCR分子 的β链包含可变域和恒定域,所述β链可变域氨基酸序列包含上述β链的⑶R1(SEQ ID NO: 13)、CDR2 (SEQ ID NO :14)和 CDR3 (SEQ ID NO: 15)。优选地,所述 TCR 分子包含 β 链可 变域氨基酸序列SEQ ID NO: 5。更优选地,所述TCR分子的β链可变域氨基酸序列为SEQ ID N0:5〇
[0095] 在本发明的一个优选例中,本发明的TCR分子是由α链的部分或全部和/或β 链的部分或全部组成的单链TCR分子。有关单链TCR分子的描述可以参考文献Chung et al (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,12654-12658。根据文献中所述,本领域技术人员能 够容易地构建包含本发明⑶Rs区的单链TCR分子。具体地,所述单链TCR分子包含V α、 V β和C β,优选地按照从Ν端到C端的顺序连接。
[0096] 所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列包含上述α链的⑶R1(SEQ ID Ν0 : 10)、CDR2 (SEQ ID NO :11)和 CDR3 (SEQ ID NO :12)。优选地,所述单链 TCR 分子包含 α 链 可变域氨基酸序列SEQ ID NO: 1。更优选地,所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列 为SEQ ID Ν0:1。所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列包含上述β链的⑶R1(SEQ ID NO :13)、CDR2 (SEQ ID NO :14)和 CDR3 (SEQ ID NO: 15)。优选地,所述单链 TCR 分子包 含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO: 5。更优选地,所述单链TCR分子的β链可变域氨基 酸序列为SEQ ID NO:5。
[0097] 在本发明的一个优选例中,本发明的TCR分子的恒定域是人的恒定域。本领域 技术人员知晓或可以通过查阅相关书籍或MGT(国际免疫遗传学信息系统)的公开数 据库来获得人的恒定域氨基酸序列。例如,本发明TCR分子α链的恒定域序列可以为 "TRAC*01",TCR分子β链的恒定域序列可以为"TRBC1*01"或"TRBC2*01"。頂GT的TRAO01 中给出的氨基酸序列的第53位为Arg,在此表示为:TRAO01外显子1的Arg53,其他以此 类推。优选地,本发明TCR分子α链的氨基酸序列为SEQ ID N0:3,和/或β链的氨基酸 序列为 SEQ ID Ν0:7。
[0098] 天然存在的TCR是一种膜蛋白,通过其跨膜区得以稳定。如同免疫球蛋白(抗体) 作为抗原识别分子一样,TCR也可以被开发应用于诊断和治疗,这时需要获得可溶性的TCR 分子。可溶性的TCR分子不包括其跨膜区。可溶性TCR有很广泛的用途,它不仅可用于研 究TCR与pMHC的相互作用,也可用作检测感染的诊断工具或作为自身免疫病的标志物。类 似地,可溶性TCR可以被用来将治疗剂(如细胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)输送到 呈递特异性抗原的细胞,另外,可溶性TCR还可与其他分子(如,抗-CD3抗体)结合来重新 定向T细胞,从而使其靶向呈递特定抗原的细胞。本发明也获得了对PRAME抗原短肽具有 特异性的可溶性TCR。
[0099] 为获得可溶性TCR,一方面,本发明TCR可以是在其α和β链恒定域的残基之间 引入人工二硫键的TCR。半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域间形成人工链间二硫 键。半胱氨酸残基可以取代在天然TCR中合适位点的其他氨基酸残基以形成人工链间二硫 键。例如,取代TRAO01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57 的半胱氨酸残基来形成二硫键。引入半胱氨酸残基以形成二硫键的其他位点还可以是: TRAO01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77 ;TRAO01外显子1的 TyrlO 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外显子 1 的 Serl7 ;TRAO01 外显子 1 的 Thr45 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外显子 1 的 Asp59 ;TRAO01 外显子 1 的 Serl5 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外 显子 1 的 Glul5 ;TRAO01 外显子 1 的 Arg53 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外显子 1 的 Ser54 ; TRAO01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Alal9 ;或TRAO01外显子 1的TyrlO和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。即半胱氨酸残基取代了上述α与 β链恒定域中任一组位点。可在本发明TCR恒定域的一个或多个C末端截短最多50个、或 最多30个、或最多15个、或最多10个、或最多8个或更少的氨基酸,以使其不包括半胱氨 酸残基来达到缺失天然二硫键的目的,也可通过将形成天然二硫键的半胱氨酸残基突变为 另一氨基酸来达到上述目的。
[0100] 如上所述,本发明的TCR可以包含在其α和β链恒定域的残基间引入的人工二 硫键。应注意,恒定域间含或不含上文所述的引入的人工二硫键,本发明的TCR均可含有 TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2 恒定域序列可通过存在于TCR中的天然二硫键连接。
[0101] 为获得可溶性TCR,另一方面,本发明TCR还包括在其疏水芯区域发生突变的TCR, 这些疏水芯区域的突变优选为能够使本发明可溶性TCR的稳定性提高的突变,如在公开号 为W02014/206304的专利文献中所述。这样的TCR可在其下列可变域疏水芯位置发生突变: (α和/或β链)可变区氨基酸第11,13,19,21,53,76,89,91,94位,和/或<1链1基因 (TRAJ)短肽氨基酸位置倒数第3, 5, 7位,和/或β链J基因(TRBJ)短肽氨基酸位置倒 数第2, 4,6位,其中氨基酸序列的位置编号按国际免疫遗传学信息系统aMGT)中列出的位 置编号。本领域技术人员知晓上述国际免疫遗传学信息系统,并可根据该数据库得到不同 TCR的氨基酸残基在頂GT中的位置编号。
[0102] 本发明中疏水芯区域发生突变的TCR可以是由一柔性肽链连接TCR的a与β链 的可变域而构成的稳定性可溶单链TCR。应注意,本发明中柔性肽链可以是任何适合连接 TCRa与β链可变域的肽链。如在本发明实施例4中构建的单链可溶性TCR,其a链可变 域氨基酸序列为SEQ ID N0:32,编码的核苷酸序列为SEQ ID Ν0:33;β链可变域氨基酸序 列为SEQ ID Ν0:34,编码的核苷酸序列为SEQ ID Ν0:35。
[0103] 另外,对于稳定性而言,专利文献201510260322. 4还公开了在TCR的a链可变区 与β链恒定区之间引入人工链间二硫键能够使TCR的稳定性显著提高。因此,本发明的高 亲和力TCR的a链可变区与β链恒定区之间还可以含有人工链间二硫键。具体地,在所述 TCR的a链可变区与β链恒定区之间形成人工链间二硫键的半胱氨酸残基取代了:TRAV 的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的第60位氨基酸;TRAV的第47位氨 基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的61位氨基酸;TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01 或TRBC2*01外显子1的第61位氨基酸;或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01 外显子1的第60位氨基酸。优选地,这样的TCR可以包含(i )除其跨膜结构域以外的全 部或部分TCRa链,和(ii )除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRi3链,其中(i )和 (? )均包含TCR链的可变域和至少一部分恒定域,a链与β链形成异质二聚体。更优选 地,这样的TCR可以包含a链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分 β链恒定域,但其不包含a链恒定域,所述TCR的a链可变域与β链形成异质二聚体。
[0104] 本发明的TCR也可以多价复合体的形式提供。本发明的多价TCR复合体包含两 个、三个、四个或更多个本发明TCR相结合而形成的多聚物,如可以用ρ53的四聚结构域来 产生四聚体,或多个本发明TCR与另一分子结合而形成的复合物。本发明的TCR复合物可 用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞,也可用于产生具有此类应用的其他多价 TCR复合物的中间体。
[0105] 本发明的TCR可以单独使用,也可与偶联物以共价或其他方式结合,优选以共 价方式结合。所述偶联物包括可检测标记物(为诊断目的,其中所述TCR用于检测呈递 RYLFPPLFM-HLA Α2402复合物的细胞的存在)、治疗剂、ΡΚ(蛋白激酶)修饰部分或任何以 上这些物质的组合结合或偶联。
[0106] 用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于:焚光或发光标记物、放射性标记物、 MRI (磁共振成像)或CT (电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产 物的酶。
[0107] 可与本发明TCR结合或偶联的治疗剂包括但不限于:1.放射性核素(Koppe等, 2005,癌转移评论(Cancer metastasis reviews) 24, 539) ;2·生物毒(Chaudhary 等, 1989,自然(Nature) 339, 394 ;Epel 等,2002,癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology and Immunotherapy) 51,565) ;3·细胞因子如 IL-2 等(Gillies 等,1992,美国国家科学 院院刊(PNAS)89,1428 ;Card 等,2004,癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology and Immunotherapy)53,345;Halin 等,2003,癌症研究(Cancer Research)63,3202) ;4·抗体 Fc 片段(Mosquera 等,2005,免疫学杂志(The Journal Of Immunology) 174,4381) ;5·抗 体 scFv 片段(Zhu 等,1995,癌症国际期刊(International Journal of Cancer)62, 319); 6.金纳米颗粒 / 纳米棒(Lapotko 等,2005,癌症通信(Cancer letters) 239, 36 ;Huang 等, 2006,美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society) 128,2115) ;7·病 毒颗粒(Peng 等,2004,基因治疗(Gene therapy) 11,1234) ;8·脂质体(Mamot 等,2005,癌 症研究(Cancer research)65,11631) ;9.纳米磁粒;10.前药激活酶(例如,DT-心肌黄酶 (DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL)) ;11.化疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米 颗粒等。
[0108] 另外,本发明的TCR还可以是包含衍生自超过一种物种序列的杂合TCR。例如,有 研究显示鼠科TCR在人T细胞中比人TCR能够更有效地表达。因此,本发明TCR可包含人 可变域和鼠的恒定域。这一方法的缺陷是可能引发免疫应答。因此,在其用于过继性T细 胞治疗时应当有调节方案来进行免疫抑制,以允许表达鼠科的T细胞的植入。
[0109] 应理解,本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母或三英文字母表示,氨基 酸名称的单英文字母与三英文字母的对应关系如下:Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、 Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、 Ser (S)、Thr (T)、Trp (W)、Tyr (Y)、Val (V)。
[0110] 核酸分子
[0111] 本发明的第二方面提供了编码本发明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子,所 述部分可以是一个或多个CDR,α和/或β链的可变域,以及α链和/或β链。
[0112] 编码本发明第一方面TCR分子α链⑶R区的核苷酸序列如下:
[0113] a CDRl-aacagtgcttctcagtct (SEQ ID NO:16)
[0114] a CDR2_gtatactccagtggtaat (SEQ ID NO:17)
[0115] a CDR3-RtRRtRaaccattttataRattccRRRtatRcactcaac (SEQ ID NO:18)
[0116] 编码本发明第一方面TCR分子β链⑶R区的核苷酸序列如下:
[0117] β CDRl-aagggtcatgataga (SEQ ID NO:19)
[0118] β CDR2_tcctttgatgtcaaagat (SEQ ID NO :20)
[0119] β CDR3-gccaccagtcccgacgcttctaatgaaaaactgttt (SEQ ID NO:21)
[0120] 因此,编码本发明TCR α链的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18,和/或编码本发明TCR β链的本发明核酸分子的核苷酸序 列包括 SEQ ID N0:19、SEQ ID Ν0:20 和 SEQ ID Ν0:21。
[0121] 本发明核酸分子的核苷酸序列可以是单链或双链的,该核酸分子可以是RNA或 DNA,并且可以包含或不包含内含子。优选地,本发明核酸分子的核苷酸序列不包含内含子 但能够编码本发明多肽,例如编码本发明TCRa链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列 包括SEQ ID N0:2和/或编码本发明TCRi3链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括 SEQ ID N0:6。或者,编码本发明TCRa链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID N0:33和/或编码本发明TCRi3链可变域的本发明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID N0:35。更优选地,本发明核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID N0:4和/或SEQ ID N0:8。 或者,本发明核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID N0:31。
[0122] 应理解,由于遗传密码的简并,不同的核苷酸序列可以编码相同的多肽。因此,编 码本发明TCR的核酸序列可以与本发明附图中所示的核酸序列相同或是简并的变异体。以 本发明中的其中一个例子来说明,"简并的变异体"是指编码具有SEQ ID N0:1的蛋白序列, 但与SEQ ID N0:2的序列有差别的核酸序列。
[0123] 核苷酸序列可以是经密码子优化的。不同的细胞在具体密码子的利用上是不同 的,可以根据细胞的类型,改变序列中的密码子来增加表达量。哺乳动物细胞以及多种其他 生物的密码子选择表是本领域技术人员公知的。
[0124] 本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或 人工合成的方法获得。目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明TCR(或其片 段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA 分子(或如载体)和细胞中。DNA可以是编码链或非编码链。
[0125] 载体
[0126] 本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体,包括表达载体,即能够在体内或体 外表达的构建体。常用的载体包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。
[0127] 病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、 逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。
[0128] 优选地,载体可以将本发明的核苷酸转移至细胞中,例如T细胞中,使得该细胞表 达PRAME抗原特异性的TCR。理想的情况下,该载体应当能够在T细胞中持续高水平地表 达。
[0129] 细胞
[0130] 本发明还涉及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主 细胞中含有本发明的载体或染色体中整合有本发明的核酸分子。宿主细胞选自:原核细胞 和真核细胞,例如大肠杆菌、酵母细胞、CH0细胞等。
[0131] 另外,本发明还包括表达本发明的TCR的分离的细胞,特别是T细胞。该T细胞可 衍生自从受试者分离的T细胞,或者可以是从受试者中分离的混合细胞群,诸如外周血淋 巴细胞(PBL)群的一部分。如,该细胞可以分离自外周血单核细胞(PBMC),可以是CD4 +辅 助T细胞或⑶8+细胞毒性T细胞。该细胞可在⑶4 +辅助T细胞/⑶8 +细胞毒性T细胞的 混合群中。一般地,该细胞可以用抗体(如,抗-CD3或抗-CD28的抗体)活化,以便使它们 能够更容易接受转染,例如用包含编码本发明TCR分子的核苷酸序列的载体进行转染。
[0132] 备选地,本发明的细胞还可以是或衍生自干细胞,如造血干细胞(HSC)。将基因转 移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR,因为干细胞表面不表达CD3分子。然而,当干细胞 分化为迀移至胸腺的淋巴前体(lymphoid precursor)时,CD3分子的表达将启动在胸腺细 胞的表面表达该引入的TCR分子。
[0133] 有许多方法适合于用编码本发明TCR的DNA或RNA进行T细胞转染(如,Robbins 等.,(2008) J. Immunol. 180:6116-6131)。表达本发明TCR的T细胞可以用于过继免疫治 疗。本领域技术人员能够知晓进行过继性治疗的许多合适方法(如,Rosenberg等.,(2008) Nat Rev Cancer8(4) :299-308)。
[0134] PRAME抗原相关疾病
[0135] 本发明还涉及在受试者中治疗和/或预防与PRAME相关疾病的方法,其包括 过继性转移PRAME特异性T细胞至该受试者的步骤。该PRAME特异性T细胞可识别 RYLFPPLFM-HLA Α2402 复合物。
[0136] 本发明的PRAME特异性的Τ细胞可用于治疗任何呈递PRAME抗原短肽 RYLFPPLFM-HLA A2402复合物的PRAME相关疾病,如肿瘤。所述肿瘤包括但不限于黑色素 瘤、肺鳞状细胞癌、乳腺癌、肾细胞癌、头颈部肿瘤、霍杰金氏淋巴瘤、肉瘤、成神经管细胞 瘤、白血病(包括但不限于,急性淋巴细胞白血病,急性粒细胞白血病)、胃癌、肺癌、食道 癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌等。
[0137] 治疗方法
[0138] 可以通过分离患有与PRAME抗原相关疾病的病人或志愿者的T细胞,并将本发明 的TCR导入上述T细胞中,随后将这些基因工程修饰的细胞回输到病人体内来进行治疗。 因此,本发明提供了一种治疗PRAME相关疾病的方法,包括将分离的表达本发明TCR的T细 胞,优选地,该T细胞来源于病人本身,输入到病人体内。一般地,包括(1)分离病人的T细 胞,⑵用本发明核酸分子或能够编码本发明TCR分子的核酸分子体外转导T细胞,⑶将 基因工程修饰的T细胞输入到病人体内。分离、转染及回输的细胞的数量可以由医师决定。
[0139] 本发明的主要优点在于:
[0140] (1)本发明的TCR能够与PRAME抗原短肽复合物RYLFPPLFM-HLA A2402结合,同时 转导了本发明TCR的细胞能够被特异性激活并且对靶细胞具有很强的杀伤作用。
[0141] 下面的具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常 规条件,例如(Sambrook和Russell等人,分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)(2001) CSHL出版社)中所述的条件,或按照制造厂商所建议 的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。除非另外说明,否则百分比和份数 按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0142] 实施例1克隆PRAME抗原短肽特异性T细胞
[0143] 利用合成短肽RYLFPPLFM(SEQ ID N0. :9 ;北京赛百盛基因技术有限公司)刺激来 自于基因型为HLA-A2402的健康志愿者的外周血淋巴细胞(PBL)。将RYLFPPLFM短肽与带 有生物素标记的HLA-A2402复性,制备pHLA单倍体。这些单倍体与用PE标记的链霉亲和 素(BD公司)组合成PE标记的四聚体,分选该四聚体及抗-CD8-APC双阳性细胞。扩增分 选的细胞,并按上述方法进行二次分选,随后用有限稀释法进行单克隆。单克隆细胞用四聚 体染色,筛选到的双阳性克隆如图3所示。
[0144] 实施例2获取PRAME抗原短肽特异性T细胞克隆的TCR基因与载体的构建
[0145] 用Quick-RNA? MiniPrep (ΖΥΜ0 research)抽提实施例1中筛选到的抗原短肽 RYLFPPLFM特异性、HLA-A2402限制性的T细胞克隆的总RNA。cDNA的合成采用clontech 的SMART RACE cDNA扩增试剂盒,采用的引物是设计在人类TCR基因的C端保守区。将序 列克隆至T载体(TAKARA)上进行测序。应注意,该序列为互补序列,不包含内含子。经测 序,该双阳性克隆表达的TCR的α链和β链序列结构分别如图1和图2所示,图la、图lb、 图lc、图ld、图le和图If分别为TCRa链可变域氨基酸序列、TCRa链可变域核苷酸序列、 TCR a链氨基酸序列、TCR a链核苷酸序列、具有前导序列的TCR a链氨基酸序列以及具有 前导序列的TCRa链核苷酸序列;图2a、图2b、图2c、图2d、图2e和图2f分别为TCRi3链 可变域氨基酸序列、TCRi3链可变域核苷酸序列、TCRi3链氨基酸序列、TCRi3链核苷酸序 列、具有前导序列的TCRi3链氨基酸序列以及具有前导序列的TCRi3链核苷酸序列。
[0146] 经鉴定,α链包含具有以下氨基酸序列的⑶R:
[0147] a CDR1-NSASQS (SEQ ID NO:10)
[0148] a CDR2-VYSSGN (SEQ ID NO:11)
[0149] a CDR3-WNHFIDSGYALN (SEQ ID NO: 12)
[0150] β链包含具有以下氨基酸序列的⑶R:
[0151] β CDR1-KGHDR (SEQ ID NO:13)
[0152] β CDR2-SFDVKD (SEQ ID NO:14)
[0153] β CDR3-ATSPDASNEKLF (SEQ ID NO:15)
[0154] 通过重叠(overlap)PCR分别将TCRa链和β链的全长基因克隆至慢病毒表 达载体pLenti (addgene)。具体为:用overlap PCR将TCRa链和TCR0链的全长基因进 行连接得到TCRa-2A_TCRi3片段。将慢病毒表达载体及TCRa-2A_TCRi3酶切连接得到 pLenti-TRA-2A-TRB-IRES-NGFR质粒。作为对照用,同时也构建表达eGFP的慢病毒载体 pLenti-eGFP。之后再用293T/17包装假病毒。
[0155] 实施例3 PRAME抗原短肽特异性可溶TCR的表达、重折叠和纯化
[0156] 为获得可溶的TCR分子,本发明的TCR分子的a和β链可以分别只包含其可变 域及部分恒定域,并且a和β链的恒定域中分别引入了一个半胱氨酸残基以形成人工链 间二硫键,引入半胱氨酸残基的位置分别为TRAO01外显子1的Thr48和TRBC2*01外显子 1的Ser57 ;其a链的氨基酸序列与核苷酸序列分别如图4a和图4b所示,其β链的氨基 酸序列与核苷酸序列分别如图5a和图5b所示,引入的半胱氨酸残基以加粗和加下划线字 母表示。通过《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三 版,Sambrook和Russell)中描述的标准方法将上述TCRa和β链的目的基因序列经合成 后分别插入到表达载体pET28a+(Novagene),上下游的克隆位点分别是Ncol和Notl。插入 片段经过测序确认无误。
[0157] 将TCR α和β链的表达载体分别通过化学转化法转化进入表达细菌BL21 (DE3), 细菌用LB培养液生长,于0D6QQ= 0. 6时用终浓度0. 5mM IPTG诱导,TCR的α和β链表 达后形成的包涵体通过BugBuster Mix (Novagene)进行提取,并且经BugBuster溶液反 复多次洗涤,包涵体最后溶解于6M盐酸胍,10mM二硫苏糖醇(DTT),10mM乙二胺四乙酸 (EDTA),20mM Tris(pH 8. 1)中。
[0158] 溶解后的TCR α和β链以1 :1的质量比快速混合于5M尿素,0. 4M精氨酸,20mM Tris(pH 8. 1),3. 7mM cystamine,6· 6πιΜβ-mercapoethylamineGO )中,终浓度为 60mg/ mL。混合后将溶液置于10倍体积的去离子水中透析(4°C ),12小时后将去离子水换成缓冲 液(20mM Tris,pH 8. 0)继续于4°C透析12小时。透析完成后的溶液经0. 45 μ Μ的滤膜过 滤后,通过阴离子交换柱(HiTrap Q HP,5ml,GE Healthcare)纯化。洗脱峰含有复性成功的 α和β二聚体的TCR通过SDS-PAGE胶确认。TCR随后通过凝胶过滤层析(HiPrep 16/60, Sephacryl S_100HR,GE Healthcare)进一步纯化。纯化后的 TCR 纯度经过 SDS-PAGE 测定 大于90%,浓度由BCA法确定。本发明得到的可溶性TCR的SDS-PAGE胶图如图6所示。
[0159] 实施例4 PRAME抗原短肽特异性的可溶性单链TCR的产生
[0160] 根据专利文献W02014/206304中所述,利用定点突变的方法将实施例2中TCRa 与β链的可变域构建成了一个以柔性短肽(linker)连接的稳定的可溶性单链TCR分子。 该单链TCR分子的氨基酸序列及核苷酸序列分别如图7a和图7b所示。其a链可变域的 氨基酸序列及核苷酸序列分别如图8a和图8b所示;其β链可变域的氨基酸序列及核苷酸 序列分别如图9a和图9b所示;其linker序列的氨基酸序列及核苷酸序列分别如图10a和 图10b所示。
[0161] 将目的基因经Nco I和Not I双酶切,与经过Nco I和Not I双酶切的pET28a载 体连接。连接产物转化至E. coli DH5 α,涂布含卡那霉素的LB平板,37°C倒置培养过夜,挑 取阳性克隆进行PCR筛选,对阳性重组子进行测序,确定序列正确后抽提重组质粒转化至 E. coli BL21(DE3),用于表达。
[0162] 实施例5 PRAME抗原短肽特异性的可溶性单链TCR的表达、复性和纯化
[0163] 将实施例4中制备的含有重组质粒pET28a_模板链的BL21 (DE 3)菌落全部接 种于含有卡那霉素的LB培养基中,37°C培养至0D600为0. 6-0. 8,加入IPTG至终浓度为 0.5mM,37°C继续培养4h。5000rpm离心15min收获细胞沉淀物,用Bugbuster Master Mix(Merck)裂解细胞沉淀物,6000rpm离心15min回收包涵体,再用Bugbuster(Merck)进 行洗涤以除去细胞碎片和膜组分,6000rpm离心15min,收集包涵体。将包涵体溶解在缓冲 液(20mM Tris-HCl pH 8.0,8M尿素)中,高速离心去除不溶物,上清液用BCA法定量后进 行分装,于_80°C保存备用。
[0164] 向5mg溶解的单链TCR包涵体蛋白中,加入2. 5mL缓冲液(6M Gua-HCl,50mM Tris-HCl pH 8.1,lOOmM NaCl,10mM EDTA),再加入 DTT 至终浓度为 10mM,37°C处理 30min。 用注射器向125mL复性缓冲液(lOOmM Tris-HClpH 8. 1,0. 4M L-精氨酸,5M尿素,2mM ED ΤΑ, 6· 5πιΜβ -mercapthoethylamine, 1. 87mM Cystamine)中滴加上述处理后的单链TCR,4°C 搅拌l〇min,然后将复性液装入截留量为4kDa的纤维素膜透析袋,透析袋置于1L预冷的 水中,4°C缓慢搅拌过夜。17小时后,将透析液换成1L预冷的缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8. 0),4°C继续透析8h,然后将透析液换成相同的新鲜缓冲液继续透析过夜。17小时后,样 品经0. 45 μ m滤膜过滤,真空脱气后通过阴离子交换柱(HiTrap Q HP, GE Healthcare),用 20mM Tris-HCl pH 8.0配制的0-1M NaCl线性梯度洗脱液纯化蛋白,收集的洗脱组分进行 SDS-PAGE分析,包含单链TCR的组分浓缩后进一步用凝胶过滤柱(Superdex 75 10/300,GE Healthcare)进行纯化,目标组分也进行SDS-PAGE分析。
[0165] 用于BIAcore分析的洗脱组分进一步采用凝胶过滤法测试其纯度。条件为:色谱 柱 Agilent Bio SEC-3(300A,Φ7. 8X300mm),流动相为 150mM 磷酸盐缓冲液,流速 0. 5mL/ min,柱温25°C,紫外检测波长214nm〇
[0166] 本发明获得的可溶性单链TCR的SDS-PAGE胶图如图11所示。
[0167] 实施例6结合表征
[0168] BIAcore 分析
[0169] 本实施例证明了可溶性的本发明TCR分子能够与RYLFPPLFM-HLA A2402复合物特 异性结合。
[0170] 使用BIAcore T200实时分析系统检测实施例3和实施例5中得到的TCR分子与 RYLFPPLFM-HLA A2402复合物的结合活性。将抗链霉亲和素的抗体(GenScript)加入偶联 缓冲液(lOmM醋酸钠缓冲液,pH 4. 77),然后将抗体流过预先用EDC和NHS活化过的CM5芯 片,使抗体固定在芯片表面,最后用乙醇胺的盐酸溶液封闭未反应的活化表面,完成偶联过 程,偶联水平约为15,000RU。
[0171] 使低浓度的链霉亲和素流过已包被抗体的芯片表面,然后将RYLFPPLFM-HLA A2402复合物流过检测通道,另一通道作为参比通道,再将0. 05mM的生物素以10yL/min的 流速流过芯片2min,封闭链霉亲和素剩余的结合位点。
[0172] 上述RYLFPPLFM-HLA A2402复合物的制备过程如下:
[0173] a.纯化
[0174] 收集100ml诱导表达重链或轻链的E. coli菌液,于4°C8000g离心10min后用10ml PBS 洗涤菌体一次,之后用 5ml BugBuster Master Mix Extraction Reagents (Merck)剧烈 震荡重悬菌体,并于室温旋转孵育20min,之后于4°C,6000g离心15min,弃去上清,收集包 涵体。
[0175] 将上述包涵体重悬于5ml BugBuster Master Mix中,室温旋转孵育5min ;加 30ml稀释10倍的BugBuster,混勾,4°C 6000g离心15min ;弃去上清,加30ml稀释10倍的 BugBuster 重悬包涵体,混勾,4°C 6000g 离心 15min,重复两次,加 30ml 20mM Tris-HCl pH 8. 0重悬包涵体,混匀,4°C 6000g离心15min,最后用20mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵体, SDS-PAGE检测包涵体纯度,BCA试剂盒测浓度。
[0176] b.复性
[0177] 将合成的短肽RYLFPPLFM(北京赛百盛基因技术有限公司)溶解于DMS0至20mg/ ml的浓度。轻链和重链的包涵体用8M尿素、20mM Tris pH 8. 0、10mM DTT来溶解,复性前 加入3M盐酸胍、10mM醋酸钠、10mM EDTA进一步变性。将RYLFPPLFM肽以25mg/L (终浓度) 加入复性缓冲液(〇. 4M L-精氨酸、100mM Tris pH 8. 3、2mM EDTA、0. 5mM氧化性谷胱甘肽、 5mM还原型谷胱甘肽、0. 2mM PMSF,冷却至4°C ),然后依次加入20mg/L的轻链和90mg/L的 重链(终浓度,重链分三次加入,8h/次),复性在4°C进行至少3天至完成,SDS-PAGE检测 能否复性成功。
[0178] c.复性后纯化
[0179] 用10体积的20mM Tris pH 8. 0作透析来更换复性缓冲液,至少更换缓冲液两次 来充分降低溶液的离子强度。透析后用〇. 45 μ m醋酸纤维素滤膜过滤蛋白质溶液,然后加 载到HiTrap Q HP(GE通用电气公司)阴离子交换柱上(5ml床体积)。利用Akta纯化仪 (GE通用电气公司),20mM Tris pH 8. 0配制的0-400mM NaCl线性梯度液洗脱蛋白,pMHC 约在250mM NaCl处洗脱,收集诸峰组分,SDS-PAGE检测纯度。
[0180] d.生物素化
[0181] 用Mi 11 ipore超滤管将纯化的pMHC分子浓缩,同时将缓冲液置换为20mM Tris pH 8.0,然后加入生物素化试剂 0.05M Bicine pH 8.3、10mM ATP、10mM Mg0Ac、50yM D-Biotin、100 μ g/ml BirA酶(GST-BirA),室温孵育混合物过夜,SDS-PAGE检测生物素化 是否完全。
[0182] e.纯化生物素化后的复合物
[0183] 用Millipore超滤管将生物素化标记后的pMHC分子浓缩至1ml,采用凝胶过滤 层析纯化生物素化的pMHC,利用Akta纯化仪(GE通用电气公司),用过滤过的PBS预平衡 HiPr^)? 16/60S200HR柱(GE通用电气公司),加载lml浓缩过的生物素化pMHC分子,然后 用PBS以lml/min流速洗脱。生物素化的pMHC分子在约55ml时作为单峰洗脱出现。合并 含有蛋白质的组分,用Millipore超滤管浓缩,BCA法(Thermo)测定蛋白质浓度,加入蛋白 酶抑制剂cocktail (Roche)将生物素化的pMHC分子分装保存在-80°C。
[0184] 利用BIAcore Evaluation软件计算动力学参数,得到本发明可溶性的TCR分子以 及本发明构建的可溶性单链TCR分子与RYLFPPLFM-HLA A2402复合物结合的动力学图谱如 图12所示。图谱显示,本发明得到的可溶性TCR分子以及可溶性单链TCR分子都能够与 RYLFPPLFM-HLA A2402复合物结合。同时,还利用上述方法检测了本发明可溶性的TCR分子 与其他几种无关抗原短肽与HLA复合物的结合活性,结果显示本发明TCR分子与其他无关 抗原均无结合。
[0185] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种T细胞受体(TCR),其特征在于,所述TCR能够与RYLFPPLFM-HLA A2402复合物 结合;优选地,所述的TCR包含TCR α链可变域和TCR β链可变域,其特征在于,所述TCR α 链可变域的CDR3的氨基酸序列为VVNHFIDSGYALN(SEQ ID Ν0:12);和/或所述TCR0链可 变域的CDR3的氨基酸序列为ATSPDASNEKLF(SEQ ID Ν0:15); 更优选地,所述TCR α链可变域的3个互补决定区(⑶R)为: aCDRl-NSASQS (SEQ ID NO: 10) aCDR2-VYSSGN (SEQ ID NO: 11) a CDR3-VVNHFIDSGYALN (SEQ ID NO:12);和 / 或 所述TCR β链可变域的3个互补决定区为: eCDRl-KGHDR (SEQ ID NO: 13) 0CDR2-SFDVKD (SEQ ID NO: 14) β CDR3-ATSPDASNEKLF (SEQ ID NO:15)。2. 如权利要求1所述的TCR,其特征在于,其包含TCR a链可变域和TCR β链可变域, 所述TCR a链可变域为与SEQ ID NO: 1具有至少90%序列相同性的氨基酸序列;和/或所 述TCRi3链可变域为与SEQ ID N0:5具有至少90%序列相同性的氨基酸序列。3. 如权利要求1所述的TCR,其特征在于,所述TCR的a链和/或β链的C-或N-末 端结合有偶联物;优选地,与所述Τ细胞受体结合的偶联物为可检测标记物、治疗剂、ΡΚ修 饰部分或任何这些物质的组合;优选地,所述治疗剂为抗-CD3抗体。4. 一种多价TCR复合物,其特征在于,包含至少两个TCR分子,并且其中的至少一个 TCR分子为上述权利要求中任一项所述的TCR。5. -种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子包含编码上述任一权利要求所述的TCR 分子的核酸序列或其互补序列; 优选地,所述的核酸分子包含编码TCRa链可变域的核苷酸序列SEQ ID Ν0:2或SEQ ID NO:33 ;和 / 或 所述的核酸分子包含编码TCRf3链可变域的核苷酸序列SEQ ID NO :6或SEQ ID N0:35〇6. -种载体,其特征在于,所述的载体含有权利要求25-28中任一所述的核酸分子;优 选地,所述的载体为病毒载体;更优选地,所述的载体为慢病毒载体。7. -种分离的宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞中含有权利要求26中所述的载 体或染色体中整合有外源的权利要求25-28中任一所述的核酸分子。8. -种细胞,其特征在于,所述细胞转导权利要求25-28中任一所述的核酸分子或权 利要求29中所述载体;优选地,所述细胞为T细胞或干细胞。9. 一种药物组合物,其特征在于,所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求 1-23中任一项所述的TCR、权利要求24中所述的TCR复合物、权利要求25-28中任一所述 的核酸分子、或权利要求28中所述的细胞。10. 权利要求1-23中任一项所述的T细胞受体、或权利要求24中所述的TCR复合物 或权利要求31中所述的细胞的用途,其特征在于,用于制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药 物。
【文档编号】C12N15/867GK106084036SQ201510741810
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2015年11月2日
【发明人】李懿, 区裕升, 吴万里, 林燕梅, 李思韵
【申请人】广州市香雪制药股份有限公司
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