一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv?C27及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv?C27及其应用。所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.6所示。本发明成功构建了T1D scFv噬菌体库，筛选并鉴定了ZnT8特异性scFv，该ZnT8特异性scFv可用于1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂的制备。
【专利说明】
一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体SCFV-C27及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C27及其应用。
【背景技术】
[0002] 锌转运体(ΖηΤ)是一组将锌离子由胞内转运出胞外的跨膜蛋白，与ZIP家族蛋白共 同维护细胞内外锌离子的平衡。2004年，Cheimienti等首次在ΖηΤ家族中发现ZnT8蛋白，它 由SLC30A8基因编码，高度特异的表达在胰腺中，后进一步研究发现ΖηΤ8特异的表达在胰岛 β细胞上，在INS-1细胞中过表达ΖηΤ8可促使锌离子的聚集并增强糖刺激后的胰岛素释放。 这些研究表明ΖηΤ8在胰岛素的合成和分泌中发挥重要作用。
[0003] 1型糖尿病(T1D)是由Τ淋巴细胞介导，以选择性破坏胰岛辟田胞为特征的器官特异 性自身免疫性疾病。胰岛β细胞上存在着多种自身抗原，如胰岛素，谷氨酸脱羧酶(GAD)，酪 氨酸磷酸酶和ZnT8。其中，ZnT8被认为是T1DM的一个重要的自身抗原，Wenzlau等发现部分 T1D高危患者发病前2年即可检测到ZnT8自身抗体且长期维持在较高水平。我们前期研究发 现ΖηΤ8存在着多个抗原表位可被1型糖尿病患者自身反应性Τ细胞识别，且ΖηΤ8抗体水平与 T1D的发展存在着显著相关性。早期检测ΖηΤ8抗体和ΖηΤ8特异性CD8+T细胞是预测和诊断 T1D的重要手段。针对ΖηΤ8靶点的特异性治疗将成为阻止T1D进展的潜在方法。
[0004] 抗体研究迄今已有100多年历史，1975年Kohler和Mi lstein创立Β淋巴细胞杂交瘤 技术，鼠源单克隆抗体被广泛应用于疾病的诊断和治疗，但由于鼠源单克隆抗体对人体有 免疫原性，易产生人抗鼠抗体反应(human anti-mouse antibody，HAMA和超敏反应，且由于 其分子量较大，难以穿膜等缺点，限制了其在疾病治疗领域的应用。自20世纪八十年代中 期，随着分子生物学的技术进展，国外学者建立了噬菌体抗体库技术。由于噬菌体表达的 scFv抗体分子量较小，仅为完整抗体分子的六分之一，且具有较好的血管或组织屏障穿透 性、半衰期短、结构稳定、不含Fc段，减少了与体内Fc受体结合而带来的不利影响等优势，已 广泛地应用于分子生物学及免疫学、药理学等医学领域，是目前的研究热点。但目前尚未见 抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种抗1型糖尿病ΖηΤ8特异性单 链抗体。
[0006] 本发明的另一目的是提供该单链抗体的应用。
[0007] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0008] 抗1型糖尿病ΖηΤ8特异性单链抗体scFv_C27，包括重链和轻链，
[0009] 所述的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0010] 所述的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011] 所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.5所示。
[0012] 一种编码本发明所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体SCFV-C27的基因，其中，
[0013] 编码轻链的可变区的基因序列如SEQ ID N0.3所示；
[0014] 编码重链的可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0015] 编码本发明所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C27的基因的核苷酸序 列优选如SEQ ID N0.6所示。
[0016] 本发明所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C27在制备1型糖尿病诊断、 治疗和/或预后判断试剂中的应用。
[0017]本发明所述的编码编码权利要求1所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C27的基因在制备1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂中的应用。
[0018] 有益效果：
[0019] 本发明首次从T1D病人外周血基因中构建了一个库容达IX 108的scFv噬菌体抗体 库。我们招募了 50例初发的T1D患者以保证库的特异性、多样性和代表性。从该库中，我们可 以筛选T1D的各种自身抗体。
[0020] ZnT8抗原是T1D的重要自身抗原，具有六次跨膜结构，它由SCL30A8基因编码，定位 于人第8号染色体q24.11上，包含8个外显子，编码369个氨基酸。ΖηΤ8自身抗体在T1D的发生 发展中发挥了重要作用。目前，ΖηΤ8蛋白的氨基末端（l-74aa)和羧基末端(268-369aa)被认 为是自身反应性T细胞识别的主要区域。由于ZnT8蛋白影响着胰岛素的合成与分泌，所以对 其抗体作用机制的深了解对治疗T1D具有重大意义。本发明成功筛选了 ΖηΤ8特异性scFv。为 保证筛选结果的多样性，我们选择了 ZnT8蛋白的氨基羧基融合肽进行scFv的筛选。已经有 大量报道发现T1D患者中ZnT8抗原325位氨基酸存在着点突变，由精氨酸(Arg)突变为酪氨 酸（T r p )，该位点突变与Ζ η T 8抗体的识别密切相关，Ζ η T 8羧基末端的突变二聚体 (Arg325Trp)对检测ΖηΤ8抗体具有高度的特异性和敏感性。所以我们进一步使用ΖηΤ8羧基 末端的二聚体(Arg325Trp)鉴定了 scFv-C27,结果表明scFv-C27能与该二聚体结合。免疫组 化结果进一步显示scFv能特异性识别胰岛细胞，具有良好的生物学活性。
[0021] 本发明成功构建了T1D scFv噬菌体库，筛选并鉴定了ZnT8特异性scFv，该ZnT8特 异性scFv可用于1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂的制备。
【附图说明】
[0022]图1.重组ZnT8基因构建.M:核酸标准品；泳道1: ZnT8氨基末端基因（l-74aa)约 250bp;泳道2: ZnT8羧基末端基因（268-369aa)约350bp;泳道3: ZnT8氨基羧基融合基因（1-74aa，268-369aa)约550bp;泳道4: ΖηΤ8羧基端二聚突变体基因（Arg325Trp)约650bp。图2 · 重组ZnT8蛋白的表达纯化及鉴定.
[0023] Α:ΖηΤ8氨基羧基融合蛋白的Western blotting检测（泳道1:蛋白纯化前；泳道2: 纯化后的蛋白；泳道3:流穿）；B: ZnT8氨基羧基融合蛋白的SDS-PAGE检测(M:蛋白标准品；泳 道1:蛋白纯化前；泳道2:纯化后的蛋白；泳道3:流穿）；C:ZnT8羧基端二聚突变体蛋白 Western blotting检测（泳道1:蛋白纯化前;泳道2:纯化后的蛋白；泳道3:流穿）；D:ZnT8羧 基端二聚突变体蛋白SDS-PAGE检测(M:蛋白标准品；泳道1:蛋白纯化前;泳道2:纯化后的蛋 白；泳道3:流穿）。
[0024] ZnT8氨基羧基融合蛋白和羧基端二聚突变体蛋白分子量分别约20kD和25kD。
[0025] 图3 .ELISA检测氨基羧基融合蛋白与商品化ZnT8抗体的结合能力。
[0026] 图4. T1D scFv基因扩增.Μ:核酸标准品；泳道1: VAPCR产物（~350bp);泳道2: Vk PCR产物（~350bp);泳道3: VH PCR产物（~450bp);泳道4: scFv PCR产物（~800bp)。
[0027] 图5.scFv-C27的纯化及鉴定·
[0028] A. SDS-PAGE检测scFv(M:蛋白标准品；泳道1: scFv-C27纯化前；泳道2 :纯化后的 scFv_C27;泳道3: scFv_C27流穿）；B.Western blotting analyze检测scFv(泳道 1: scFv-C27纯化前;泳道2:纯化后的scFv-C27;泳道3: scFv-C27流穿）。
[0029] 图6.Western blotting检测scFv与ZnT8氨基羧基融合蛋白的结合能力·
[0030] 泳道1 :SCFv-C27检测ΖηΤ8氨基羧基融合蛋白；泳道2:阴性对照。
[0031] 图7 · SCFV-C27与ΖηΤ8氨基羧基融合蛋白的亲和力检测。
[0032]图8上1^13六检测8〇?￥-027对21^8羧基端二聚突变体蛋白的结合能力。
[0033]图9.免疫组化检测scFv抗体对人胰腺组织的识别能力(Α:胰岛细胞HE染色结果； B: C27检测胰岛细胞结果。行1:放大40倍;行2:放大200倍）
【具体实施方式】
[0034] 实施例1重组ZnT8原核表达质粒的构建与表达
[0035]设计引物ZF和LR(表1)，以ΖηΤ8质粒（购自北京义翘神州生物技术有限公司， HG11621-M)为模板，扩增人ΖηΤ8氨基末端（l-74aa)基因，设计引物LF和CR(表1)，以ΖηΤ8质 粒为模板，扩增人ΖηΤ8羧基末端（269-368aa)基因，，PCR产物胶回收后用引物ZF和CR通过 overlap构建氨基羧基融合基因。
[0036] 参考US9023984(B2)序列表中的SEQ ID如.55设计21^8羧基末端二聚突变体基 因，如SEQ ID No.7所示，并委托生物公司合成，该二聚体含2个人ZnT8羧基末端基因，第一 个在325为氨基酸为精氨酸(Arg)，第二个在325位为酪氨酸(Trp)，该二聚体中2个人ΖηΤ8羧 基末端基因通过一段柔性肽链接。设计引物CF和CR用于扩增ΖηΤ8羧基端二聚突变体基因。 [0037] 表1.引物序列
[0038]
[0039]引物ZF和LR用于扩增ΖηΤ8氨基末端基因（l-74aa)，引物LF和CR用于扩增ΖηΤ8羧基 末端基因（268-369aa)，引物ZF和CR用于overlap扩增ΖηΤ8氨基羧基融合基因，引物CF和CR 用于扩增ΖηΤ8羧基端二聚突变体基因。
[0040] 上述两个重组基因分别经SacI和Xbal双酶切后插入pcoldll质粒中。连接产物转 化入大肠杆菌BL21(DE3)培养后挑选阳性克隆进行测序。将测序正确的克隆在LB培养基中 37°C扩增至D(600)值达1.0后加入IPTG诱导剂至终浓度为ImM/L，15°C诱导表达2处。4°(：，10 000Xg离心后收集菌体-80°C保存。
[0041 ]将纯化的人ZnT8氨基羧基融合蛋白包被ELISA板，从1.6ug/孔倍比稀释至0. lug/ 孔，检测融合蛋白与商品化的ZnT8抗体结合的量效变化。
[0042] ΖηΤ8氨基羧基融合基因约550bp，羧基二聚突变体基因约650bp，PCR产物电泳结果 见图1，均成功插入pcold Π 载体，测序结果与理论相符。
[0043]抗原经表达纯化复性后电泳结果见图2,可见纯化后ZnT8氨基羧基融合肽分子量 约20kD，羧基二聚突变体分子量约25kD。
[0044] ELISA检测显示ZnT8氨基羧基融合蛋白能与商品化的ZnT8抗体特异性结合，可用 于ΖηΤ8特异性scFv的筛选(图3)。
[0045] 实施例2T1D scFv噬菌体抗体库的构建
[0046]实验标本为50位初发的T1D志愿者的外周血。其中31位志愿者血清ZnT8抗体阳性。 血清ΖηΤ8抗体水平通过放射免疫配体法进行检测（详细方法参见Gu Y，Zhang Μ，Chen Η， Wang Z,Xing C,Yang H,et al.Discordant association of islet autoantibodies with high-risk hla genes in Chinese type ldiabetes.Diabetes/metabolism research and reviews 2011;27:899-905)。所有患者均签署知情同意书。分选T1D志愿者 外周血PBMC。提取T1D志愿者外周血PBMC RNA，接着反转录合成cDNA，具体操作步骤按说明 书进行。通过RT-PCR方法，用人源单链抗体（scFv)通用引物（表2)扩增重链和轻链，通过 overlap PCR链接成scFv,经Sfi I酶切后插入pcomb3XSS质粒(购自BioVector NTCC保藏中 心）中。连接产物经过多次电转化入大肠杆菌XLl-Blue(购自Stratagene，Cat · #200228)，用 SB培养基扩大培养后加辅助噬菌体VCSM13超感染。次日收集上清经PEG-8000/NaCl沉淀后 获得T1D scFv噬菌体抗体库。
[0047] 表2.人源scFv通用引物序列
[0048]
[0049；
[0050] 注：R = A or G Y = C or C M = A or C K = G or T S = C or G W = A or T H = A or C or T B = C or G or T V=A or C or G D=A or G or T N=A or C or G or T
[0051] 扩增VH链引物组合如下：
[0058]上述经RT-PCR后成功扩增抗体重链及轻链，大小约400bp，单链抗体基因条带在 750bp左右（图4)，胶回收后插入pcomb3XSS载体中，电转化入大肠杆菌XLl-Blue，经VCSM13 超感染后获得噬菌体抗体库，经检测库容为1 X 1〇8。
[0059] 1 · 2 · 4ZnT8 特异性 scFv 的筛选
[0060] 将纯化的ZnT8氨基羧基融合蛋白按lyg/孔包被ELISA板，经过4轮的"吸附"、"洗 脱"、"扩增"后（Zhang X，Qi X，Zhang Q，Zeng X，Shi Z，Jin Q，et al.Human 4f5single_ chain fv antibody recognizing a conserved halepitope has broad neutralizing potency against h5nlinfluenza a viruses of different clades.Antiviral research 2013; 99:91-9)，phage-ELISA进行检测。挑选0D值高的阳性克隆提取质粒并送测 序，测序结果与人类免疫球蛋白序列（IMGT数据库）（Ehrenmann F，Kaas Q，Lefranc MP.Imgt/3dstructure~db and imgt/domaingapalign:A database and a tool for immunoglobulins or antibodies ,T cell receptors,mhc,igsf and mhcsf.Nucleic acids research 2010 ； 38 : D301-7.Lefranc MP,Giudicel1i V,Duroux P,Jabad〇-Michaloud J,Folch G,Aouinti S,et al.Imgt(r),the international immunogenetics information system(r)25years on.Nucleic acids research 2015;43:D413_22.)进行 比对并进行CDR区的划分。
[0061] 经过4轮的筛选，ZnT8特异性scFv得以富集。每一轮噬菌体滴度见表3。将最后一轮 洗脱的噬菌体感染大肠杆菌XLl-Blue后，随机选择160个克隆。Phage ELISA结果显示有23 个阳性克隆，其中有11个克隆0D值较高，经测序得至1」7株scFv。我们对这7株scFv进行了⑶R 区的划分，均符合人源scFv抗体特征。其中，scFv-C27和C220D值最高，因此我们选择scFv-C27进行了进一步研究。
[0062]表3. ZnT8特异性噬菌体抗体的富集
[0063]
[0064]得率（％ )=洗脱后的噬菌体密度(pfu) X 100/吸附前的噬菌体密度(pfu)
[0065] 将测序正确的阳性克隆转化入大肠杆菌ToplOF'，挑单克隆菌落接种于含20mM MgC12的SB培养基中，37°C振摇8h后加入IPTG至终浓度lmM，37°C诱导表达2处。4°(：，10 000* g离心后收集菌体-80°C保存。
[0066] 细菌沉淀用含8M尿素的磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上，用超声破碎细胞仪进行裂 解。10000*g 4°C离心30min，上清经0.22μηι滤膜过滤后用HisTrap亲和层析柱纯化蛋白。洗 脱下的目的蛋白通过浓度梯度透析复性至尿素小于〇. 125mM，超滤浓缩后得到高浓度蛋白。 Western与SDS-PAGE结果表明我们成功表达并纯化了 scFv-C27，其分子量约30kD(图5) [0067] 实施例3ZnT8特异性scFv的特性分析
[0068] Western blot检测：将纯化的重组ZnT8氨基羧基融合蛋白经12%蛋白质胶电泳后 转至PVDF膜上，5%牛奶封闭后，用纯化的scFv作为一抗，HRP标记的ΗΑ抗体作为二抗，检测 scFv-C27与ZnT8的结合活性。结果显示scFv-C27可检测到氨基羧基融合蛋白，在20kD左右 可见明显条带，与预期相符，而阴性对照未见条带，说明scFv-C27与ZnT8蛋白具有良好的结 合能力（图6)。
[0069] 亲和力检测：由苏州百拓生物技术有限公司完成。亲和力结果显示scFv-C27与 ZnT8氨基羧基融合蛋白具有较高的亲和力，亲和力为5 · 397 X l(T8kD(M)(图7)。
[0070] ELISA检测：将纯化的ZnT8羧基末端二聚突变体蛋白按0.5yg/孔包被ELISA板， scFv-C27从1:10倍比稀释至1:20480，检测scFv-C27与ZnT8结合的量效变化。如图8所示，随 着scFv-C27浓度的倍比稀释，其与ΖηΤ8羧基端二聚突变体蛋白的结合能力逐渐降低，说明 scFv-C27以浓度依赖方式与ΖηΤ8抗原肽结合。
[0071] 免疫组化:我们将C27抗体作为一抗，通过间接标记的方法进行免疫组化实验，抗 体孵育后的人胰腺组织切片的胰岛细胞呈强阳性，说明C27抗体具有良好的生物活性，能够 特异的识别人胰岛辟田胞表达的ΖηΤ8蛋白。
[0072]以上结果均表明scFv_C27能够与人ΖηΤ8特异性结合。
【主权项】
1. 抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体SCFV-C27，包括轻链和重链，其特征在于： 所述的轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述的重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 根据权利要求1所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C27,其特征在于所述 的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。3. -种编码权利要求1所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C27的基因，其特 征在于： 编码轻链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示； 编码重链的可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4. 根据权利要求3所述的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。5. 权利要求1或2所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C27在制备1型糖尿病 诊断、治疗和/或预后判断试剂中的应用。6. 权利要求3或4所述的编码权利要求1所述的抗1型糖尿病ZnT8特异性单链抗体scFv-C27的基因在制备1型糖尿病诊断、治疗和/或预后判断试剂中的应用。
【文档编号】C12N15/13GK106084051SQ201610523803
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】张梅, 张晓 , 杨涛, 吴倩, 陈恒, 秦瑶
【申请人】张梅