抗呕吐毒素抗原?抗体免疫复合物的纳米抗体及其应用
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及抗呕吐毒素抗原?抗体免疫复合物(Immunocomplex)的纳米抗体(Variable domain of heavy chain of heavychain antibody,VHH)制备及其应用，其氨基酸序列SEQ ID NO.:1。本发明纳米抗体可特异性结合呕吐毒素抗原?抗体免疫复合物，可以代替传统的抗体，并应用于呕吐毒素的非竞争型免疫学分析。本发明所提供的氨基酸序列可作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质更好的突变体，用来发展进一步用于工业、食品安全领域的蛋白质或多肽。
【专利说明】
抗呕吐毒素抗原-抗体免疫复合物的纳米抗体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及单域重链抗体技术(又称为纳米抗体技术），以及基因工程抗体技术， 属于生物技术领域，具体涉及抗呕吐毒素抗原-抗体免疫复合物(Immunocomplex)的纳米抗 体(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody，VHH)制备及其应用。
【背景技术】
[0002] 免疫分析方法可分为竞争和非竞争型两种形式。非竞争型免疫分析以其灵敏度 高、步骤简单而广泛应用于微生物、病毒、蛋白等含有多个抗原表位的大分子物质的分析。 对于小分子物质而言，由于小分子物质分子量过小，不易被两个抗体同时结合，因此发展基 于双抗夹心的非竞争模式用于小分子物质的免疫分析就显得十分困难。然而，近年来也有 研究者基于新型免疫识别元件以及免疫分析组合新模式，发展出了一系列小分子物质的非 竞争性免疫分析模式，比如:基于抗独特性抗体的非竞争型免疫分析法、小分子肽的异双位 点复合物转移免疫分析法、非竞争型免疫复合物检测技术，基于化学修饰半抗原的非竞争 型分析、特殊分尚仪器、特殊抗体免疫分析法等，为小分子物质非竞争型免疫分析方法的发 展提供了有益的探索。
[0003] 脱氧雪腐镰刀菌稀醇(Deoxynivalneol，D0N)是一种单端孢霉稀族的小分子真菌 毒素，又名呕吐毒素，广泛存在于大麦、小麦、玉米、燕麦等农作物及其制品中。DON具有细胞 毒性、胚胎毒性和免疫毒性等，轻微中毒可引起厌食、呕吐、腹泻、发烧、血压升高等症状，严 重时会威胁到人类及动物的生命。由于DON的高污染率和高毒性，对食品中的DON进行快速 检测具有重要的现实意义。在众多的DON检测方法中，免疫学检测方法因其操作简单、特异 性和灵敏度高等特点，已广泛应用于食品中DON的大规模筛查。DON属于小分子物质，不能同 时被两个常规抗体所结合，导致目前DON的免疫学分析方法大多基于竞争型免疫分析。然 而，相比较于竞争型免疫分析，非竞争型免疫分析方法具有操作步骤少、灵敏度高、检测范 围广等优势，因此建立DON的非竞争型免疫分析方法就具有重要的现实意义。
[0004] 重链抗体(Heavy-chain antibody)是一种天然缺失轻链，仅由重链组成的抗体， 存在于胳盤、羊盤、藍鱼及软骨鱼类等动物中。单域重链抗体，即纳米抗体（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody,VHH)是指仅由重链抗体可变区 (Variable region)组成的基因工程抗体。与普通抗体相比，纳米抗体具有分子量小，水溶 性好，稳定性高等优点，目前已广泛应用于食品科学研究，医学诊断，药物研发等领域。抗 原-抗体免疫复合物(immunocomplex)，是指抗原与抗体结合后形成的一种复合物。
[0005] 本发明采用噬菌体展示纳米抗体库技术，以DON抗原-抗体免疫复合物为靶分子， 从驼源天然单域重链抗体库中淘选抗DON抗原-抗体免疫复合物的纳米抗体，在此基础上将 其应用于DON的非竞争型免疫分析体系。通过噬菌体展示纳米抗体库技术淘选可特异性结 合靶分子的纳米抗体，该方法避免了传统抗体制备所需的动物免疫过程，步骤简单，方便快 捷，筛选得到的纳米抗体可应用于DON的非竞争型免疫分析。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一种抗DON抗原-抗体免疫复合物的纳米抗体(包括含有所述纳 米抗体全部或部分功能区域的蛋白质或多肽)及其氨基酸序列，可以被用于真菌毒素 DON的 检测分析。
[0007] 本发明所提供的抗DON抗原-抗体免疫复合物的纳米抗体，具有SEQ ID N0. :1所示 的氨基酸序列。
[0008] 其氨基酸序列的頂GT编号和结构域的划分如图1所示。
[0009] 本发明所提及的纳米抗体包括四个框架区(Framework region，FR)和三个互补决 定区（Complementarity-determining region，CDR)。其中，框架区（FR1-FR4)分别选自 SEQ ID N0.:2，SEQ ID N0.:4，SEQ ID Ν0·:6和SEQ ID Ν0·:8,互补决定区（CDR1-CDR3)分别选 自SEQ ID NO. :3，SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :7。框架区结构相对保守，主要起着维持蛋白 质结构的作用;互补决定区结构相对多样化，主要负责抗原-抗体免疫复合物的识别。
[0010] 本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID N0.:2，SEQ ID N0.:4，SEQ ID N0.:6 和SEQ ID NO. :8中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有 90 %同源性。
[0011] 本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID N0.:3，SEQ ID N0.:5和SEQ ID N0.: 7中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有80%同源性。
[0012] 本发明提供了一种核酸分子，其特征是编码SEQ ID N0.: 1，通过遗传密码子的可 以随时获得该核酸分子的具体序列。
[0013] 本发明所提供的纳米抗体可通过噬菌体扩增的方式进行大量制备。噬菌体扩增是 指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体 的菌体粒子。
[0014] 本发明所提供的纳米抗体可以通过噬菌体扩增获得的展示有纳米抗体的噬菌体 粒子直接用于分析检测；
[0015] 本发明所提供的核苷酸序列或部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以已 得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细 胞，植物细胞，或无细胞表达系统。
[0016] 本发明所提供的纳米抗体可以应用于免疫学检测分析。免疫学检测的类型包括酶 联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分 析检测类型。
[0017] 本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造， 更够获得性质水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，用来发展进一步用于 DON免疫分析的蛋白质或多肽。
[0018] 本发明中所叙述的一些术语具有如下含义：
[0019] 同源性:描述两个或多个氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨 基酸序列之间的同源性百分比可以通过【第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置 处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量】除以【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】再乘以 【100%】来计算，其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加(与第一氨 基酸相比）被认为是有差别。另外，同源性百分比也可以利用已知的用于序列比对的计算机 运算程序(如:NCBI Blast)获得。
[0020]结构域:蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。
[0021 ] IMGT编号：IMGT数据库（The International ImMunoGeneTics Database)中的一 种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献(Ehrenmann，F.， Q.Kaas，et al.(2010)."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a database and a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF."Nucleic Acids Res 38(Database issue):D301-307.Lefranc,M.P.，C.Pommie，et al·(2003)·"IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.^Dev Comp Immunol 27(1): 55-77.)中的描述。
[0022] 密码子(codon):亦称三联体密码(triplet code)，指对应于某种氨基酸的核苷酸 三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。
【附图说明】
[0023]图1为纳米抗体的氨基酸编号及结构域示意图。
[0024]图2为基于噬菌体展示纳米抗体的非竞争型ELISA分析DON曲线。检测范围为0~ 500ng/mL〇
【具体实施方式】
[0025]下面通过纳米抗体的淘选、分析以及应用，对本发明作进一步说明，这些具体实施 不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。
[0026]实施例1抗DON抗原-抗体免疫复合物纳米抗体的亲和淘选及其鉴定 [0027] 采用固相亲和淘选的方法从驼源天然重链抗体库中淘选针对DON抗原-抗体免疫 复合物的纳米抗体。采用亲和柱纯化抗DON单克隆抗体腹水，得到抗DON单克隆抗体；用PBS (pH 7.4)将抗DON单克隆抗体稀释至终浓度30yg/mL，加入到两个酶标板孔中，4°C包被过 夜；吸出包被液，用PBST(10mM PBS，1 ·5%Tween-20(v/v))洗涤5次后，加入5%BSA-PBS(或 3 % 0VA-PBS) 37 °C封闭2h;吸去封闭液，用TOST洗涤50次，一个孔(A孔)加入100yL驼源天然 单域重链抗体库（滴度约1.0 X l〇ncfu)，另一个孔(B孔)加入100yL 100ng/mL的DON标准品 以形成DON抗原-抗体复合物，37°C孵育2h;将A孔中未结合的噬菌体转移至形成DON抗原-抗 体复合物的B孔中，37°C孵育lh;弃去B孔中未结合的噬菌体，用PBST洗涤10次，加入100yL的 Glycine-HCl(0.2M，pH 2.2)洗脱8min后，立即用 15yL Tris-HCl(lM，pH 9.1)中和。取 10yL 洗脱噬菌体测定滴度，其余洗脱物扩增后用于下一轮淘选。在第二、第三和第四轮的淘选过 程中，用3%BSA和3%0VA交替封闭，其它步骤同上。
[0028]经过四轮淘选后，采用辅助噬菌体KM13对随机挑选的单克隆进行救援，分别得到 展示抗体可变区的噬菌体颗粒，再用非竞争phage-ELISA法测定噬菌体颗粒的结合活性，实 验设定背景对照，具体加样步骤见表1。
[0029] 表1非竞争phage-ELISA加样表
[0030]
[0031] 将ELISA阳性克隆送测序公司进行序列测定，得到插入片段的DNA序列，其中纳米 抗体的编码序列如下：
[0032] CCATGGCCCAGGTGCAGCTCGTGGAGTCAGGCGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCT CCTGTGTAGCCTCTGGACGCGCCTTTCGTAGATATACCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAG TTTGTAGCAACAATTAACTGGAGTGGTCGTAATACAGCGTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAG AGACAGCCGCAAAAACACCGCGTATCTCCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAAGATACGGCCGTTTATTATTGTGCAC AATCGCGAGCGATTACAGGTGGCACAGTTCCCGCCGGTTATAACATCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCC TCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGCGGCCGC
[0033](下划线表示限制性内切酶识别位点）
[0034] 根据密码子，相对应的氨基酸系列如SEQ ID N0.: 1。
[0035]实施例2抗DON抗原-抗体复合物纳米抗体噬菌粒的扩增
[0036]将展示有阳性纳米抗体的噬菌体加入至20mL接种有E.coli TG1的培养物中，30°C 220rpm振荡培养6h;将培养物转入另一离心管中，4°C、8000rpm离心15min，将上清转入一新 鲜的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4°C静置4h后，4°C、8000rpm离心10min，弃上清； lmL PBS重悬噬菌体，加入1/6体积的PEG/NaCl，4°C静置lh后，4°C lOOOOrpm离心10min，弃上 清，加入500yL PBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。
[0037]实施例3抗DON抗原抗体免疫复合物纳米抗体在大肠杆菌中的表达。
[0038] 采用限制性内切酶Notl/Ncol，对噬菌粒pHENl进行不完全酶切，琼脂糖凝胶回收 目的片段。
[0039]将得到的纳米抗体双酶切的基因片段克隆至表达载体pET_25b。
[0040]将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta中，并进行诱导表达。将单菌落接种至5mL液 体LB/Amp培养基中，于37 °C、200rpm摇床震荡培养10h;将上述培养液以1 %的接种量接种于 50mL液体LB培养基中，37 °C、200rpm震荡培养至0D为0.5后，加入终浓度为0.05mM IPTG，于 30°C、180rpm摇床诱导培养8h。
[0041 ] 诱导培养物通过8000rpm离心10min后，用15mL PBS重悬菌体并超声破碎，超声条 件为220W，破碎2s，间歇3s，共50个循环;将破碎后的菌体于4°C、8000rpm离心15min，收集上 清并进行亲和柱纯化获得可溶性纳米抗体。
[0042]通过优化诱导表达条件(如宿主菌、表达载体、IPTG浓度及诱导温度等），可以进一 步提高纳米抗体的表达量，为大量制备特异性结合DON抗原-抗体复合物纳米抗体提供了途 径。
[0043]实施例4基于噬菌体展示纳米抗体的非竞争型ELISA分析DON曲线的建立 [0044] 用roS(pH 7.4)将抗0(^单克隆抗体稀释至1(^/1^并加至酶标板孔中，10(^17孔， 4 °C包被过夜；弃去包被液，用0.05 % TOST洗涤3次，加入300yL的3 %脱脂乳，37 °C封闭2小 时;弃封闭液，用〇. 05洗板3次，每孔加入一系列不同浓度的DON标准品，lOOyL/孔，37 °C孵育1小时，形成DON抗原-抗体免疫复合物;弃孔内液体，用0.05 % PBST洗板3次后，每孔 投入100yL展示有纳米抗体的菌体（1.0 X 109cfu)/可溶性表达纳米抗体（10yg/mL)，37°C 孵育1小时;加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗/抗组氨酸标签二抗，37°C孵育1小 时。然后用TMB底物显色，读取0D45Q。以DON浓度对数为横坐标，0D45Q为纵坐标，建立基于噬菌 体展示纳米抗体的非竞争型ELISA分析DON曲线（图2)。结果表明，淘选获得的纳米抗体对 DON抗原-抗体复合物具有结合活性和响应度。
【主权项】
1. 一种抗呕吐毒素抗原-抗体免疫复合物的纳米抗体，具有SEQ ID NO. :1所示的氨基 酸序列。2. -种核酸分子，其特征是编码权利要求1中所述的的氨基酸序列。3. 根据权利要求1所述纳米抗体的应用，其特征在于通过噬菌体扩增或基因工程重组 表达的方式进行大量制备;所述噬菌体扩增是指将展示有该纳米抗体的噬菌体，通过生物 扩增的方式，大量繁殖生产展示有该纳米抗体的噬菌体粒子;所述基因工程重组表达的方 式是指将编码该纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行该纳米抗 体的大量制备。
【文档编号】G01N33/569GK106084060SQ201610512993
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】何庆华, 许杨
【申请人】南昌大学