一种新型基因工程重组trail融合蛋白及制备方法和用图

文档序号:10713863阅读:1038来源:国知局
一种新型基因工程重组trail融合蛋白及制备方法和用图
【专利摘要】本发明公开了一种利用腺病毒纤维蛋白片段作为三聚体模序与TRAIL融合表达,获得稳定性和活性提高的重组蛋白,作为抗肿瘤治疗药物。还提供融合蛋白表达纯化及活性检测的方法。具体为:第一步;设计并构建融合基因,利用大肠杆菌系统低温诱导表达;第二步:采用镍柱亲和层析的方法纯化目的蛋白,利用凝血酶酶切位点切除His标签,获得最终目的蛋白;第三步:体外检测融合蛋白对肿瘤细胞的杀伤活性和对正常细胞的毒性,第四步:不同条件下检测融合蛋白的稳定性,第五步:裸鼠模型上检测融合蛋白的体内抗肿瘤活性。有益效果:发明了2个腺病毒纤维蛋白片段作为三聚体模序的TRAIL融合蛋白。提供了一种简单,快速的获得高稳定性TRAIL蛋白的方法,可应用于TRAIL蛋白的抗肿瘤研究和应用。解决了TRAIL蛋白稳定性差,活性低的弊端。
【专利说明】
一种新型基因工程重组TRAIL融合蛋白及制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种融合蛋白及制备方法和用途,特别涉及一种新型基因工程重组 TRAIL融合蛋白及制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)是TNF超家族一员,具有广谱抗癌的功能,且其对与正常的组织和细胞几乎是无毒 的。有活性的TRAIL是三聚体状态,由三聚体中心的锌离子与各个单体上的半胱氨酸通过螯 合作用维持。但TRAIL本身半衰期短、稳定性差、生物活性不强、并且有研究表明引入标签后 可溶性TRAIL三聚体结构秩序会改变从而产生肝毒性。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的是为了解决TRAIL本身半衰期短、稳定性差以及生物活性不强的问 题而提供的一种新型基因工程重组TRAIL融合蛋白及制备方法和用途。
[0004] 本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白包含可溶性TRAIL蛋白片段和腺 病毒纤维蛋白片段,其中可溶性TRAIL蛋白片段进一步选自N端截短94个氨基酸的人TRAIL 蛋白,其核酸序列如SEQ ID N0:1所示,氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0005] 本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白中包含的腺病毒纤维蛋白片段分 别是人血清5型腺病毒和禽1型腺病毒纤维蛋白的Tail及Shaft片段,其包含人血清5型腺病 毒纤维蛋白片段的核酸序列如SEQ ID N0:3所示,氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示,其包含 禽1型腺病毒纤维蛋白片段的核酸序列如SEQ ID N0:5所示,氨基酸序列如SEQ ID N0:6所 示
[0006] 本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白的制备方法,其方法如下所述:
[0007] 步骤一、取工程菌接种于LB培养基,37 °C摇菌培养至0D600达到0.2-1.2时,加入诱 导剂(0.3-1.2mM IPTG)培养4-20h,诱导培养温度为20°C ;
[0008] 步骤二、收集菌体,裂解(用含有蛋白酶抑制剂的PBS重悬菌体沉淀,4 °C超声破碎 20min),收集上清,分离纯化,切除标签,分离纯化采用镍柱亲和层析,其中洗涤液是含有 50mM咪唑的基础液(NaH2P〇4 50mM;NaCl 500mM;pH=8.0),洗脱液是含有250mM咪唑的基础 液,消化His标签是利用载体上的凝血酶位点,将纯化的蛋白与凝血酶混合1-18小时,混合 比例为lmg蛋白使用1 -100U凝血酶,混合条件为4°C。
[0009] 本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白稳定性的检测方法:取具有相同 杀伤活性融合蛋白,使用蛋白浓度为sTR: 100nM,FA1FT: 50nM,HA5ST: 50nM,包括以下方法: [0010] 1)将蛋白样品置于缓冲体系中〇h_24h,缓冲体系为4°C的PBS。
[0011 ] 2)将蛋白样品置于缓冲体系中0h-24h,缓冲体系为37°C的PBS。
[0012 ] 3)将蛋白样品置于血浆中0h-24h,血浆为37 °C裸鼠血浆。
[0013] 4)将蛋白样品反复冻融,冻融方法为循环置于37°C10min与-80°C10min。
[0014] 本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白在肿瘤或癌症治疗中的应用。
[0015] 本发明的有益效果:
[0016]本发明提供的新型基因工程重组TRAIL融合蛋白不依赖于锌原子的TRAIL三聚体, 方法简单,纯度高,无肝肾毒性,具有较好的抗肿瘤或癌细胞活性。
【附图说明】
[0017] 图1.新型基因工程重组TRAIL融合蛋白设计示意图。
[0018] 图2.表达重组TRAIL融合蛋白的质粒鉴定结果。
[0019] 图3.TRAIL融合蛋白诱导表达和纯化。
[0020] 图4.TRAIL融合蛋白切除His标签鉴定图。
[0021] 图5.切除标签后的TRAIL融合进行非还原性SDS-PAGE。
[0022]图6.不同浓度的TRAIL融合蛋白对多种肿瘤细胞的杀伤作用。
[0023]图7.不同浓度的TRAIL融合蛋白对正常细胞的杀伤作用。
[0024] 图8.Annexin V/PI检测细胞凋亡。
[0025] 图9. TRAIL融合蛋白的稳定性评价。
[0026] 图10.腹腔注射原位注射TRAIL融合蛋白的抗肿瘤效果比较。
【具体实施方式】
[0027] 本说明书和权利要求书所使用的缩写的含义如下所示:
[0028]
[0029] 本发明实施例中未说明来源的试剂和仪器均为普通市售品。
[0030] 下面以具体的实施例,对本发明的技术方案做进一步的技术说明;但本发明并不 限于这些实施例。
[0031] 实施例1腺病毒Fiber-TRAIL融合蛋白原核表达载体的构建
[0032] 1.目的基因的获得
[0033] 以实验室保存的带有TRAIL基因的质粒pDC316-TRAIL(人源,aa95-281)为模板进 行PCR,反应条件为:95°C预变性10min;95°C变性3〇8,56°(:退火3〇8,72°(:延伸11^11,30个循 环;72 °C延伸1 Omin。PCR产物经1.2 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化PCR 产物。用Vector NTI Suited 6软件根据Genebank提供的人TRAIL基因序列TRAIL引物如下:
[0034] 上游引物序列:5 ' -GCTAGCATGACCTCTGAGGAAACCATTTCTAC-3 ',含Nhe 頂每切位点。
[0035] 下游引物序列:5' -AAGCTTTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3',含Hind II1 酶切位点。
[0036] 2.表达载体的构建
[0037] 以实验室存有的禽类1型腺病毒(Fowl Adi)骨架质粒和上述获得的TRAIL基因为 模板进行〇verlap-PCR,将Fowl Adi基因的C端(包括tai 1基底蛋白和全长的shaft,不包括 knob蛋白)与TRAIL的N端连接(如图1,左图),用pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,为方便 将基因克隆入表达载体pET-28a,引物中添加相应的酶切位点。
[0038] 上游引物:5 ' -GCTAGCATGGCTGACCAGAAAAGGAAGCTG-3 ',含Nhe 頂每切位点。
[0039] 下游引物:5 ' -AAGCTITTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3 ',含Hind IΠ 酶切位点。
[0040] 融合蛋白Fowl Adlfiber sTR(FAlFT)的核酸编码序列如SEQ ID N0:1,氨基酸序 列如SEQ ID N0:2。
[00411以实验室存有的人类5型腺病毒(Human Ad5)骨架质粒和上述获得的TRAIL基因 为模板进行0verlap-PCR,将Human Ad5的N端shaft(只包含Shaft的C端一个螺旋,不包含 knob)与TRAIL的N端连接(如图1 ),用pfu高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。
[0042] 上游引物:5 ' -GCTAGCATGGGTGCCATTACAGTAGGAAAC-3 ',含Nhe 頂每切位点。
[0043] 下游引物:5'-AAGCTITTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3',含Hind II1 酶切位点。
[0044] 融合蛋白HumanAd5fibersTR(HA5ST)的核算编码序列如SEQIDN0:3,氨基酸序 列如SEQ ID N0:4。
[0045] 将上述FA1FT和HA5ST的PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(图lhPCR产物用琼 脂糖胶回收试剂盒(TAKARA)回收,与平末端载体Peasy(北京全式金)连接,经测序正确后, 利用Nhe I和Hind III酶切位点,将融合基因进行双酶切,用琼脂糖胶回收试剂盒回收DNA 片段,再与经同样双酶切的pET28_a载体相连接,链接产物转化至DH5a感受态细胞,通过卡 纳抗性筛选和质粒双酶切鉴定(图2),阳性克隆进一步通过DNA序列分析进行验证,坚定正 确的质粒分别命名为pET-28a-sTR、pET-28a-FAl FT、pET-28a-HA5ST。
[0046] 实施例2腺病毒Fiber-TRAIL融合蛋白原核表达载体的构建
[0047] 1.原核表达
[0048]将上述3个原核表达质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(大连宝生物), 涂于含有卡纳青霉素(l〇〇ug/ml)的LB固体培养基上,置于37°C恒温箱中过夜培养。在上述 平板中挑取单菌落,接于1 OmLLB液体培养基中过夜培养。将得到的菌液接种于1L LB液体培 养基中,37°C振荡大量培养。菌体的0D600值达到0.8时,加入终浓度lmmol/L的诱导剂异丙 基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,北京鼎国),20°C诱导表达16小时。诱导前和诱导后的菌体留 样进行SDS-PAGE电泳,如图3。
[0049] 2.蛋白纯化
[0050] 将大量诱导后菌体在4°C下,以4000rpm离心30min收菌,超声破碎20min,在4°C下, 以12000rpm离心30min得上清、沉淀,分别取样电泳。上清经0.22μηι滤膜过滤后,进行镍离子 亲和柱(美国Invitrogen)纯化。先以基础液(NaH2P〇4 50mM;NaCl 500mM; ρΗ=8 · 0)平衡镍离 子亲和柱,再将滤后上清液挂柱。然后用基础液、含50mM咪唑的基础液、含250mM咪唑的基础 液、含300mM咪唑的基础液依次进行洗脱2个柱体积。每个梯度用1.5mL Ep管接样10个EP管 (每管lmL)。再用基础液和双蒸水分别洗2个柱体积,然后以20 %乙醇洗一个柱体积,20 %乙 醇封柱,4 °C保存,取0.5mg/ml的纯化后样品进行SDS-PAGE电泳,鉴定浓缩后蛋白纯度较高 (图3)还原性SDS-PAGE电泳:向30yL收获的蛋白样品中加入10yL 4 X上样缓冲液(0.35M 1^8-!1(:1(?!1 = 6.8),3〇%甘油,1〇%3〇3,〇.〇12%溴酚蓝,6%0-巯基乙醇),充分混匀,1〇〇 。(:煮沸20min后,4°C 12000 X g,离心10min,取20yL离心上清加载至13 · 5%SDS-PAGE凝胶中, 120¥电泳1.511。
[0051] 表1.重组TRAIL蛋白单体分子质量的理论值与电泳结果比较
[0052]
[0053]切除His标签:将纯化后的蛋白浓缩除去咪唑,然后按照酶:蛋白=10U: lmg的比例 加入凝血酶(经科化学),4°C搅拌12h。再利用镍柱与His标签的亲和性除去切下来的片段。 切除标签后的蛋白进行western blot,分别使用TRAIL抗体和His标签抗体鉴定,anti TRAIL的结果显示,切除标签的重组TRAIL蛋白分子量略有减小,蛋白有约20 %的损失。anti His的结果显示,凝血酶处理后的蛋白不能被染出条带,证明成功去除标签,结果如图4。为 了更好的保护未经修饰重组TRAIL蛋白,即sTR的稳定性及活性,在最终得到的sTR蛋白样品 中,加入ZnCl 2加入比例为0.46mol锌/mol蛋白,同时为了避免蛋白发生高聚,每组蛋白样品 中加入ImM DTT。
[0054] 除标签后的融合蛋白进行非还原性⑶S-PAGE电泳鉴定Fiber-TRAIL融合蛋白在溶 液中呈三聚体状态(图5)。非还原性SDS-PAGE电泳:向30yL收获的蛋白样品中加入1 OyL 4 X 非还原性上样缓冲液(0.35M 1^8-!1(:1(?!1=6.8),30%甘油,10%303,0.012%溴酚蓝),充 分混匀,4°C,12000 X g,离心10min,取20yL离心上清加载至13.5 % SDS-PAGE凝胶中,120V电 泳1·5h。
[0055] 实施例3Fiber-TRAIL融合蛋白对肿瘤细胞杀伤作用的检测 [0056] 肿瘤细胞株:
[0057] 乳腺癌细胞:ZR-75-30,MCF7;肺癌细胞:A549;肝癌细胞:SMMC-7721;结肠癌细胞: SW480;宫颈癌细胞:Hela;乳腺正常细胞:MCF-10A;肝正常细胞:Chang Liver。
[0058] 1 )FA1FT和HA5ST对肿瘤细胞的杀伤作用
[0059] 实验方法:细胞培养在含10%小牛血清的,10(^8/1111链霉素和1001]/1111青霉素的培 养基中,37°C,5%C02条件下培养。将1 X 104个细胞接种于96孔板中,贴壁过夜,然后将培养 基换为含2 %小牛血清的培养基,加入不同浓度梯度(0.01,0.1,1,10和100nM)的实例2中 获得的融合蛋白。作用过夜后,加入20μ1的MTT溶液,反应4小时后,弃去上清液,加入150μ1 的DMS0溶解沉淀,然后用酶标仪测定490nm吸光值。以未经过蛋白处理的细胞存活率为 100%来计算蛋白处理的细胞存活率。
[0060]实验结果:如图6所示,随着蛋白浓度提高,FA1FT和HA5ST对肿瘤细胞的杀伤能力 逐渐增强,细胞存活率降低。ZR-75-30,SMMC-7721,Hela三种细胞对融合TRAIL蛋白均较敏 感,当蛋白浓度为1~1〇ηΜ时,细胞存活率在50 %左右。MCF-7,A549,SW480,对FA1FT和HA5ST 的敏感性稍弱,当蛋白浓度为10~l〇〇nM时,细胞存活率在50 %左右。正常肝细胞,乳腺细胞 对蛋白不敏感,即使蛋白浓度达到1 OOnM时,细胞存活率仍然在90 %以上。
[0061] 这些结果表明,FA1FT和HA5ST可以选择性的杀伤肿瘤细胞,如乳腺癌,肺癌,肝癌 细胞,结肠癌,宫颈癌,而对正常细胞无毒性(图7)。
[0062] 2)FA1FT和HA5ST对肿瘤细胞的杀伤途径的检测
[0063]实验方法:取对数生长期的ZR-75-30细胞,调整细胞悬液浓度为5X105/ml,以每 孔2ml铺6孔板,过夜培养。调整蛋白样品终浓度为10nM,37°C,5%⑶2培养4h;胰酶消化细 胞。用lml预冷的PBS重悬细胞。用100~500μ1的Annexin-V(FITC)/PI试剂盒中的lXBiding buffer重悬,300目纱网过滤后上机检测。
[0064] 实验结果:如图8所示,10nM的FA1FT组中,有61.3%的细胞进入凋亡状态,说531'组 中有66.8 %的细胞进入凋亡状态,是sTR组(34.1 % )的2倍。
[0065] 综上,本发明通过对肿瘤细胞和正常细胞的存活率检测,FA1FT和HA5ST对肿瘤细 胞的杀伤活性是在凋亡水平实现的,并未导致细胞坏死。
[0066] 实施例4Fiber-TRAIL融合蛋白体外稳定性检测 [0067] 1)FA1FT和HA5ST在PBS中的稳定性
[0068]实验方法:取具有相同杀伤能力的各组蛋白作为起始点。即:sTR(100nM),FAlFT (50nM),HA5ST(50nM)。将各组蛋白用PBS稀释,放置于4°C或37°C环境中,在不同时间点取样 进行MTT实验,检测剩余活性。
[0069] 实验结果:如图9所示,37°C环境下,未经改造的sTR在2h时已经完全丧失了活性,4 °C环境中逐渐丧失活性。而FA1FT和HA5ST对ZR-75-30细胞的杀伤能力在24h内一直维持稳 定,几乎没有损失,与sTR相比有显著性差异(*,P〈0.1 ;#,P〈0.01;*#,P〈0.001)。
[0070] 2)FA1FT和HA5ST在血浆中的稳定性
[0071] 实验方法:将各组蛋白与裸鼠血浆混合孵育,置于37°C环境中,在不同时间点取样 进行剩余活性的检测。
[0072] 实验结果:如图9所示,在37°C血浆环境中,sTR在0.5h是活性降低一半,lh已经丧 失全部杀伤活性。FA1FT和HA5ST的杀伤能力在6h内维持稳定,随后蛋白活性逐渐降低,但在 24h时仍具有40%的杀伤力,与sTR相比有显著性差异。
[0073] 3)FA1FT和HA5ST反复冻融后的稳定性
[0074] 实验方法:将FA1FT和HA5ST融合蛋白分别置于-80 °C和37 °C反复冻融,取不同冻融 次数的蛋白样品进行剩余活性的检测。
[0075] 实验结果:如图9所示,sTR在一次冻融后就失去三聚体构象,不能诱导ZR-75-30细 胞凋亡。虽然FA1FT和HA5ST随冻融次数的增加逐渐失去杀伤活性,与sTR比较,在稳定性上 仍然有显著性差异(*,Ρ〈〇·1;#,Ρ〈〇·〇1;*#,Ρ〈〇·〇〇1)。
[0076]实施例5Fiber_TRAIL融合蛋白(实施例2制备)体内抗肿瘤检测 [0077] 1)腹腔注射FA1FT和HA5ST的抗肿瘤效果
[0078]实验方法:收集生长状态良好的ZR-75-30细胞,离心除去培养基,无菌PBS洗涤两 次,最后用适量的预冷的PBS重悬细胞,使细胞数为IX 107个/ml,冰上暂存。选7周龄的 BALB/c雌性裸鼠,在背部右后处皮下注入100μΙ的ZR-75-30细胞,1 X 106个/ml。约14天,月中 瘤体积长到约150mm3时,腹腔给药,0. lnmol/只,连续注射8天。对照组注射相同体积的PBS, 每天记录瘤体积。以治疗第1天的初始瘤体积为100%,计算每组每只鼠的相对瘤体积为纵 坐标。(每组8只鼠。*,Ρ〈0· 1 ;**,Ρ〈0·01 ;***,Ρ〈0·001)。
[0079] 结果如图10,PBS组肿瘤迅速增长,在成瘤后第12天,相对瘤体积已经超过2000,相 比于sTR,HA5ST能够有效抑制肿瘤生长,在开始治疗后第24天,sTR组相对瘤体积在1409 土 200,HA5ST组相对瘤体积在199 % ± 30 %,FA1FT组相对瘤体积在第13天时,相对瘤体积达到 1586% ±300%。
[0080] 2)原位注射FA1FT和HA5ST的抗肿瘤效果
[0081 ] 实验方法:选7周龄的BALB/c雌性裸鼠,在背部右后处皮下注入100μΙ的ZR-75-30 细胞,1 X 1〇6个/ml。约14天,肿瘤体积长到约400mm3时,原位注射蛋白,注入体积不超过50μ 1,0.5nmol/只,连续注射8天。对照组注射相同体积的PBS,每天记录瘤体积。以治疗第1天的 初始瘤体积为1 〇〇 %,计算每组每只鼠的相对瘤体积为纵坐标。(每组8只鼠。*,P〈0.1 ;**,P〈 〇·〇1;***,Ρ〈〇·〇〇1)。
[0082]结果如图10,PBS组在成瘤后第9天,相对瘤体积超过平均值在405%,治疗结束时 sTR组相对瘤体积平均值在200 %,FA1FT组相对瘤体积平均值在134 %
[0083]综上,本发明成功获得了腺病毒fiber-TRAIL融合蛋白,其三聚体构象的维持不依 赖于结构中心的锌离子,与天然的可溶性TRAIL蛋白相比,其稳定性显著提升,体内外抗肿 瘤活性也显著增强,并且没有对正常组织细胞造成毒性。
【主权项】
1. 一种新型基因工程重组TRAIL融合蛋白,其特征在于:包含可溶性TRAIL蛋白片段和 腺病毒纤维蛋白片段。2. 权利要求1的重组TRAIL融合蛋白,其中所述可溶性TRAIL蛋白片段选自人TRAIL蛋白 可溶性胞外区。3. 权利要求2的重组TRAIL融合蛋白,其中所述可溶性TRAIL蛋白片段进一步选自N端截 短94个氨基酸的人TRAIL蛋白,其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示,氨基酸序列如SEQ ID N0:2 所示。4. 权利要求1的重组TRAIL融合蛋白,其中所述腺病毒纤维蛋白片段选自人腺病毒、禽 腺病毒和猴、马、牛、羊、猪、狗、鼠等哺乳类动物腺病毒。5. 权利要求4的重组TRAIL融合蛋白,其中所述腺病毒纤维蛋白片段进一步选自人血清 5型腺病毒和禽1型腺病毒。6. 权利要求1的重组TRAIL融合蛋白,其中所述腺病毒纤维蛋白片段进一步包含Tail和 Shaft结构。7. 权利要求1的重组TRAIL融合蛋白,其包含人血清5型腺病毒纤维蛋白片段的核酸序 列如SEQ ID N0:3所示,氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示,其包含禽1型腺病毒纤维蛋白片段 的核酸序列如SEQ ID N0:5所示,氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。8. 权利要求1的重组TRAIL融合蛋白,其包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9的核酸序 列和选自SEQIDN0:8、SEQIDN0:10的氨基酸序列。9. 一种新型基因工程重组TRAIL融合蛋白的制备方法,其方法如下所述: 步骤一、取工程菌接种于LB培养基,37°C摇菌培养至0D600达到0.2-1.2时,加入诱导剂 (0.3-1.2mM IPTG)培养4-20h,诱导培养温度为20°C; 步骤二、收集菌体,超声裂解,收集上清,分离纯化,切除标签,分离纯化采用镍柱亲和 层析,其中洗涤液是含有50mM咪唑的基础液(NaH2P04 50mM;NaCl 500mM;pH=8.0),洗脱液 是含有250mM咪唑的基础液,消化His标签是利用载体上的凝血酶位点,将纯化的蛋白与凝 血酶混合1-18小时,混合比例为lmg蛋白使用1-100U凝血酶,混合条件为4°C。10. -种新型基因工程重组TRAIL融合蛋白在肿瘤或癌症治疗中的应用。
【文档编号】A61K38/16GK106084063SQ201610356325
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】于彬, 于湘晖, 孔维, 闫晶怡, 王真
【申请人】吉林大学
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