一种结肠靶向重组毒素及制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种结肠靶向重组毒素及制备方法和应用，属于利用基因工程制备结肠靶向重组毒素。一种结肠靶向重组毒素，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，以pET28a为表达载体，BL21(DE3)为表达宿主，构建了BL21(DE3)(pET28a?rCCK96?104PE38KDEL)重组工程菌株，带6聚组氨酸标签，便于纯化。利用Ni?NTA金属螯合亲和层析柱，结合rTEV酶的特异性切割的方法，仅通过两步纯化，就获得了高活性、高纯度、无冗余序列的rCCK96?104PE38KDEL重组蛋白，纯度在95％以上；在体外细胞实验中，纯化后的rCCK96?104PE38KDEL重组免疫毒素能够特异性杀死高表达CCK2R的结肠癌细胞，抑制了癌细胞的增殖和扩散，对正常细胞和其它非CCK2R高表达肿瘤细胞没有杀伤作用，因此，rCCK96?104PE38KDEL符合作为肿瘤靶向药物的条件，为治疗结肠癌提供了新的方向。
【专利说明】
一种结肠靶向重组毒素及制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及的是利用基因工程制备结肠靶向重组毒素，具体是利用截短的人胆囊 收缩素 CCK96-1Q4与绿脓杆菌外毒素 A衍生的重组毒素 PE38KDEL连接形成的具有结肠癌靶向 的重组毒素;通过基因工程表达制备该重组毒素;并建立独特高效的纯化方法；以及在抑制 结肠癌细胞增殖中的应用。
【背景技术】
[0002] 结肠癌(Colorectal cancer，CRC)是人类高发恶性肿瘤之一，其发病率一直呈上 升趋势，全球每年患结肠癌的病例超过1亿人，在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位， 其死亡率居恶性肿瘤死因的第二位。在我国，结肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势，其 发病递增速度为世界平均数的两倍，已位于我国恶性肿瘤发病率的第四位，严重危害人类 健康。目前，结肠癌的治疗手段以手术治疗为主，辅以全身或局部化疗、放疗等治疗手段，但 术后肿瘤易复发，且化疗、放疗毒副作用大，易引起肿瘤细胞耐药。40年如，Moolten FL等提 出的重组毒素概念为癌症的诊疗带来一片光明。重组毒素的策略是基于抗原-抗体、激素-受体特异性结合的特性，以肿瘤细胞表面特有的标志物、特异受体或高表达的受体为靶标， 使毒素集中于肿瘤细胞周围，最终将肿瘤细胞杀死而对正常细胞无损害。近年来，随着基因 工程技术的发展，利用基因重组技术将负责细胞识别的抗体片段或激素基因与毒素活性片 段的基因进行融合，经表达及纯化制备得到新型重组毒素。新型重组毒素具有靶向性好、杀 伤能力强、毒性低、分子量小、免疫原性低、产生的分子均一、成本低易于改造、能够大量生 产等优点，具有良好的开发应用前景。
[0003] 近年来，诸多国内外学者开展大量涉及胃肠道肿瘤生长、侵袭、转移等发病机制或 信号传导通路的研究。随着研究的深入，人们发现胃肠道肿瘤细胞表达的胆囊收缩素受体 (Cholecystokinin receptor，CCKR)可通过自分泌或旁分泌途径促进肿瘤细胞的增生和转 移，即肿瘤细胞既合成分泌胆囊收缩素(Cholecystokinin，CCK)和胃泌素(Gastrin，GS)，又 表达CCKR，前者作为生长因子与分泌CCK和GS的细胞或周围细胞表面的CCKR结合，产生增殖 信号传入核内，引起肿瘤细胞生长，尤其是2型胆囊收缩素受体(CCK2R)在大多胃癌、结直肠 癌细胞及癌旁组织细胞膜上高表达，而正常组织表达量极低，与结肠癌的发生发展过程有 密切关系，是结直肠癌诊断和治疗的理想靶点。
[0004] 胆囊收缩素(Cholecystokinin，CCK)是十二指肠及近端空肠离散的肠内分泌细胞 (I型)和大脑神经元合成分泌的，其主要的生理学作用是刺激胰腺分泌、胆囊收缩、产能、抑 制胃酸分泌、肠能动性、促进细胞生长、基因表达、蛋白合成和饱腹感等。另外，CCK也能够促 进外分泌性胰腺的生长，大量实验证实，CCK与动物的进食、记忆、疼痛、焦虑等精神状态有 关。CCK在人体内以多种长短不同的分子形式存在，均由含115个氨基酸残基的CCK原加工剪 切形成的多肽，包括〇0(-83、00(-58、00(-39、00(-33、00(-25、00(-22、00(-18、00(-12、〇0(-8、CCK-7、CCK-6、CCK-5 以及 CCK-4。
[0005] 绿脓杆菌外毒素 (Pseudomonas Exotoxin，PE)是制备重组毒素的理想毒素分子， 其高效杀伤活性及细胞杀伤机制已得到详细阐明。对PE分子进行加工修饰，并与人工靶向 元件(如受体配基和抗体片段)结合，使其发挥细胞毒性潜能，可选择性消除某些特异性肿 瘤细胞。Ira Pas tan等证明一个毒素分子在35min内可成功的失活300个核糖体，理论上一 个重组毒素分子与肿瘤细胞结合后即可将该细胞杀死，但由于毒素内化效率、细胞内Furin 酶切割效率的影响（Furin酶对TO的切割效率为5%-15%)，杀死一个肿瘤细胞需要400-1000个毒素分子。这要求在杀死靶细胞时需要一定量的毒素分子，确保了少量非特异性结 合至正常细胞表面的毒素不能发挥细胞毒作用，从而保证了对正常细胞的安全性，因此在 抗癌药物的应用中具有很高的价值。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种结肠靶向重组毒素及制备方法和应用，目的是提供一种靶向结肠 癌的具有高度选择杀伤活性重组毒素及制备方法和应用。
[0007] 本发明一种结肠靶向重组毒素，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，由反向翻译的 胆囊收缩素9肽rCCK96-1()4为导向单元与绿脓杆菌外毒素 A衍生物PE38KDEL融合形成具有结 肠癌靶向的重组毒素 rCCK96-1(mPE38KDEL。
[0008] 编码所述的一种结肠癌靶向重组毒素的基因，其核苷酸序列SEQ ID No. 1所示。
[0009] 利用基因重组技术，将CCK(115个氨基酸)的第96至104位置的9个氨基酸序列Gly-Phe-Asp-Met-Trp-Gly-Met-Tyr-Asp 反向编译为：
[0010] Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Gly 的重组型rCCK96-1〇4，并利用柔性 linkerHMAEE连接在绿脓杆菌外毒素 A衍生物PE38KDEL毒素 N端，组合成为具有高效靶向细 胞毒性作用的重组毒素蛋白rCCK96-1(mPE38KDEL。
[0011] 重组基因序列通过NHe I和BamH I限制性内切酶位点插入pET-28a质粒载体，该载 体上的6聚组氨酸标签Hi s-Hi s-Hi s-Hi s-Hi s-Hi s会与rCCK96-1Q4PE38KDEL同时合成（即合成 6xHis-rCCK96-1(mPE38KDEL)，利用6聚组氨酸与Ni2+的高亲和性，使带有组氨酸标签的重组毒 素蛋白可以通过Ni-NTA金属螯合亲和层析柱(镍柱)进行纯化。
[0012] 设计添加了特定氨基酸序列 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln 于 rCCK96-1Q4PE38KDEL 的 N 端，使该序列与rCCK96-1(mPE38KDEL的N端首个氨基酸--甘氨酸(Gly)共同组成了烟草蚀纹 病毒蛋白酶（rTEV蛋白酶）特异性切割位点ENLYFQ/G，作为6聚组氨酸标签与rCCK 96一 1〇4PE38KDEL的连接linker，在重组蛋白纯化后，使用适量的rTEV蛋白酶将6聚组氨酸标签等 冗余序列切除。
[0013] 构建好的重组质粒，通过热激法转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有硫酸卡 纳青霉素的L B固体培养基进行单克隆的筛选。阳性克隆菌的菌液中加入甘油（终浓度 30%)，-80°C 冻存。
[0014] 将冻存甘油菌接入新鲜培养基中复苏，添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)进 行诱导表达，使用超声破碎仪对菌体进行破碎，释放出重组蛋白。
[0015] 优化培养条件，确定最优表达条件为LB培养基，1 %接菌量，37°C摇培2h后加入 0.1 mM诱导剂IPTG，在很稳培养箱中以140r，16°C摇培12-18h，所表达蛋白50 %以上为可溶 蛋白。
[0016] 建立两步纯化方法对表达的可溶rCCK96-1()4PE38KDEL进行纯化，纯度达到95%以 上。
[0017] (1)将超声后的菌液高速离心（4°(：，1200(^，111)，取上清液，用0.22以111滤器过滤除 杂，利用并缓慢注入Ni-NTA金属螯合亲和层析柱，160mM咪唑缓冲液洗去杂蛋白，375mM咪唑 将重组蛋白洗脱，收集洗脱液。
[0018] (2)在回收到的洗脱液中加入适量rTEV蛋白酶，16 °C水浴锅中静置6h，取出后透析 除盐，再次注入Ni-NTA金属螯合亲和层析柱，收集流穿液，获得高纯度、高活性的rCCK96-i〇4PE38KDEL重组蛋白。
[0019]将纯化的rCCK96-1(mPE38KDEL重组蛋白溶液中，加入5%甘露醇作为冻干保护剂，使 用真空冻干机冻干后保存在-80 °C冰箱中。
[0020] 将冻干的rCCK96-1Q4PE38KDEL重组蛋白用无菌水溶解稀释至2000ng/mL，体外作用 于结肠癌细胞，显著的抑制了结肠癌细胞的增殖。
[0021 ]根据本发明的目的，利用PE毒素的强细胞毒性和胆囊收缩素 CCK与结肠癌细胞高 表达的CCK2R的高亲和力，利用基因工程技术将二者结合，重新构建成为一种新型的、高效 的、结肠癌靶向的重组免疫毒素。重组毒素作为一种异源性蛋白，容易在患者体内引起免疫 系统的强烈应答，降低治疗效果，一直以来都是重组免疫毒素发展的难点；为减少毒素在体 内的免疫原性，去除了PE毒素非功能基团，对功能基团进行了修饰，改造为PE38KDEL，并截 取全长CCK中的9个氨基酸CCK 96-1(M作为重组免疫毒素的导向分子;通过这种方式，显著降低 了重组免疫毒素的免疫原性。以pET28a为表达载体，BL21(DE3)为表达宿主，构建了 BL21 (DE3) (pET28a-rCCK96-1(mPE38KDEL)重组工程菌株，该菌株培养简单，表达量高，表达出的重 组蛋白活性好，带6聚组氨酸标签，便于纯化。利用Ni-NTA金属螯合亲和层析柱，结合rTEV酶 的特异性切割的方法，仅通过两步纯化，就获得了高活性、高纯度、无冗余序列的rCCK 96-1〇4PE38KDEL重组蛋白，纯度在95 %以上；在体外细胞实验中，纯化后的rCCK96-1(mPE38KDEL重 组免疫毒素能够特异性杀死高表达CCK2R的结肠癌细胞，抑制了癌细胞的增殖和扩散，对正 常细胞和其它非CCK2R高表达肿瘤细胞没有杀伤作用，因此，rCCK 96-1(mPE38KDEL符合作为肿 瘤靶向药物的条件，为治疗结肠癌提供了新的方向。
【附图说明】
[0022] 图1 ·重组表达质粒pET-rCCK96-1(mPE38图谱示意图；
[0023] 图2.rCCK96-1(mPE38在大肠杆菌中的表达效果图；
[0024] Μ:即用型蛋白分子量标准(宽）；
[0025] l:lmM IPTG诱导的BL21(DE3)(pET28a)空载体对照；
[0026] 2:lmM IPTG诱导的BL21(DE3)(pET-rCCK96-i〇4PE38)结果；
[0027]图3.rCCK96-1(mPE38重组蛋白在优化前的表达情况图；
[0028] Μ:即用型蛋白分子量标准(宽）；
[0029] 1 :rCCK96-1(μΡΕ38重组蛋白37°C诱导表达包涵体蛋白；
[0030] 2:rCCK96-1(mPE38重组蛋白37°C诱导表达可溶性蛋白；
[0031] 3:rCCK96-1(mPE38重组蛋白37Γ诱导表达全蛋白；
[0032]图 4. western-blotting 验证 rCCK96-i〇4PE38 重组蛋白的表达图；
[0033] Μ:彩虹 180光谱蛋白Marker(11 -180KD);
[0034] 1:未经IPTG诱导的菌液样品；
[0035] 2:经IPTG诱导的菌液样品；
[0036]图5.rCCK96-1(mPE38重组蛋白在优化后的表达情况图；
[0037] Μ:即用型蛋白分子量标准(宽）；
[0038] l:rCCK96-1(μΡΕ38重组蛋白16°C诱导表达可溶性蛋白；
[0039] 2:rCCK96-1(mPE38重组蛋白16°C诱导表达包涵体蛋白；
[0040] 图6.rCCK96-1(mPE38重组蛋白利用Ni-NTA金属螯合亲和层析柱纯化效果
[0041] M:即用型蛋白分子量标准(宽）；
[0042] 1:流穿；
[0043] 2-11:50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM 咪唑浓 度洗脱收集液；
[0044] 图7.rTEV切割重组蛋白效果图；
[0045] M:即用型蛋白分子量标准(宽）；
[0046] 1: rTEV 切割前；
[0047] 2: rTEV 切割后；
[0048] 图8.rCCK96-1(mPE38对过表达CCK2R细胞的体外杀伤实验
[0049] A1: SW116大肠癌细胞加入rCCK96-1(mPE38蛋白实验组;A2: SW116大肠癌细胞加入空 载体蛋白对照；
[0050] B1:HCT 8结肠癌细胞加入rCCK96-1(mPE38蛋白实验组;B2:HCT 8结肠癌细胞加入空 载体蛋白对照；
[0051 ] Cl: SW480结肠癌细胞加入rCCK96-1(mPE38蛋白实验组;C2: SW480结肠癌细胞加入空 载体蛋白对照；
[0052] D1: SW620结肠癌细胞加入rCCK96-1(mPE38蛋白实验组;D2: SW620结肠癌细胞加入空 载体蛋白对照；
[0053]图9.受体免疫荧光检测图，间接免疫荧光检测rCCK96-1(μΡΕ38在靶细胞上的定位： Α1-Α4: SW116细胞加入rCCK96-1(μΡΕ38蛋白实验组;Β1-Β4: SW116细胞加入空载体蛋白对照； [0054] 1:自然光成像;2:hochest 33342染色蓝色荧光;3:Dylight 488染色绿色荧光；
[0055] 4:2图与3图叠加。
【具体实施方式】
[0056] 实施例1
[0057] 表达rCCK96-1Q4PE38KDEL重组菌株的构建
[0058] (1)以pET-rG17PE38KDEL为模板，利用PCR方法将反向的CCK96- 1Q4片段基因与 PE38KDEL基因进行融合，并引入了rTEV特异性切割位点，人工合成引物为：
[0059] FI：TTCGACATGTGGGGCATGTATGACCATATGGCCGAAGAGGGC
[0060] F2：GCTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGCTTCGACATGTGGGGCATG [0061 ] R：GGATCCTTACAGCTCGTCCTTCGGCG
[0062] PCR 条件：94°C 预变性 5min，94°C 变性 45s，62°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin，72°C 延伸 10min，32个循环。
[0063] (2)扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在接近lOOObp上方出现明亮条带，使 用胶回收试剂盒将该条带回收，置于_20°C保存。
[0064] (3)克隆载体的构建：将回收基因与pMD-18T载体按4 :1混合，再加入等体积的 Solution I，放入水浴锅中16°C过夜连接，将连接产物加入到50yL感受态细胞DH5a中，轻轻 缓慢混匀，冰上放置45min，42°C水浴90s，冰浴3min。加入lmL LB培养基，将其置于37 °C的全 温震荡培养箱中，培养lh，涂布于加100yg/mL氨苄的LB平板，放入37°C恒温培养箱中，倒置 培养12-16h，待长出菌落后，挑取单克隆进行摇菌培养，取用该菌液为模板，用原引物进行 PCR鉴定，将阳性克隆用30%甘油保种后，送至测序公司，经测序鉴定，结果与预期相符，SEQ ID No.l；
[0065] (4)表达载体的构建:提取重组质粒和pET_28a质粒，将上述质粒分别进行双酶切， 限制性内切酶为NHe I和BamH I，通过1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切效果，并使用胶回收 试剂盒回收目的基因和载体，然后用T4连接酶将其16°C过夜连接；
[0066]把连接产物全部加入到100此事先准备好的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，轻 轻混匀，冰上放置45min，42°C水浴90s，冰浴3min。加入lmL LB培养基，将其置于37°C的全温 震荡培养箱中，培养lh。涂布于含有100yg/mL卡纳抗性的LB平板，放入37°C恒温培养箱中， 倒置培养12-16h，待长出菌落后，挑取单克隆进行摇菌培养，取用该菌液为模板，用原引物 进行PCR鉴定，将阳性克隆用30 %甘油保种，置于-80°C冰箱保存待用。
[0067] 实施例2
[0068]原核表达与诱导条件优化 [0069] (1)原核表达
[0070] 筛选出的单克隆重组工程菌株以1%接菌量接种到LB培养基(Kana)中，37°C180r 摇培至菌液0D6Q()为0.4时加入诱导剂IPTG至终浓度1M，相同条件继续培养5h后，取lmL菌液 于4°C，10000r离心 15min，加入80yL PBS，20yL 5 XSDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴 1 Omin，通过10 % SDS-PAGE电泳验证表达(重组蛋白分子量39kDa，附图2);
[0071 ] (2)重组蛋白的 western-blotting 分析
[0072] 配置10 %的SDS-PAGE电泳凝胶，每孔加入1 OyL上述制备菌样，进行SDS-PAGE电泳； 将转膜装置从下至上一次按正极板、海绵垫、滤纸、PVDF膜（提前用转膜液浸泡30min)、凝 胶、滤纸、海绵垫、负极板的顺序摆放整齐，每一步都要去除气泡，恒定电流200mA湿转2h;转 膜结束后，取出PVDF膜用5 % (w/v)的脱脂奶粉室温封闭lh; TBST洗膜3次，每次5min;按1: 1000加入PE38单克隆抗体(本实验室制备）37°C富裕lh或者4°C孵育过夜;TBST洗膜3次，每 次10min;按1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，37 °C孵育lh; TBST洗膜3次，每次10min;加 入新鲜配置的ECL显色液，室温避光显色lmin，化学发光成像系统分析拍照（附图3);
[0073] (3)发酵条件优化
[0074]初次诱导表达的重组蛋白为包涵体表达(附图4)，复性过程复杂，且对活性影响较 大。通过摸索获得最佳诱导条件，
[0075] a.发酵温度优化
[0076] 过夜摇培的BL21 (DE3) (rCCK96-104PE38KDEL)菌液以1 %的接菌量接种到5mLLB液 体培养基(Kana)中，180r，37 °C培养至0D600值为0.4，接入终浓度为1. OmM的IPTG，分别在16 °C、20°C、25°C、30°C、37°C条件下180r继续培养12h，将各温度下的菌液离心15min(4°C， lOOOOr)，弃去上清液，用PBS重悬，在冰浴条件下超声破碎30min，然后4°C lOOOOr离心lh，取 上清液80yL，加入20yL的5 X SDS-PAGE Loading Buf f er，沸水浴lOmin，通过10 % SDS-PAGE 凝胶电泳鉴定，发现在16 °C时上清表达量最高，因此选择发酵温度为16 °C ;
[0077] b.诱导时机的优化
[0078] 过夜摇培的BL21(DE3)(rCCK96-1Q4PE38KDEL)菌液以1%的接菌量接种到5mL LB液 体培养基(Kana)中，180r 37°C培养至0 · 5h、1 · Oh、1 · 5h、2h、2 · 5h、3 · Oh、3 · 5h时分别加入终 浓度为l.OmM的IPTG，16°C140r继续培养12h，将菌液离心15min(4°C，10000r)，弃去上清液， 用PBS重悬，在冰浴条件下超声破碎30min，然后4°C lOOOOr离心lh，取上清液80yL，加入20yL 的5 X SDS-PAGE Loading Buf f er，沸水浴10min，通过10 % SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，发现上 清表达量随37°C摇培时间的增加而增加，但在2h之后增加不显著，故选择在37°C摇培2h后 进行诱导；
[0079] c诱导剂量的优化
[0080] 过夜摇培的BL21(DE3)(rCCK96-1Q4PE38KDEL)菌液以1%的接菌量接种到5mL LB液 体培养基(Kana)中，180r 37 °C培养2h后，接入终浓度为0.1、0.4、0.7、1. OmM的IPTG，16 °C 140r继续培养12h。将菌液离心15min(4°C，10000r)，弃去上清液，用PBS重悬，在冰浴条件下 超声破碎30min，然后在4°C，10000r离心lh。取上清液80yL，加入20yL的5XSDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴10min，通过10% SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，发现添加 IPTG的浓度越 高，上清表达量反而降低，推测是高浓度的IPTG不仅影响细菌的生长，而且使重组蛋白的合 成加速，没有充足时间进行正确折叠，所以重组蛋白更多的是以包涵体形式合成。为了使上 清表达量尽量高，所以选择〇. ImM IPTG作为诱导剂量；
[0081] d诱导时间的优化
[0082] 过夜摇培的BL21(DE3)(rCCK96-1Q4PE38KDEL)菌液以1%的接菌量接种到5mL LB液 体培养基(Kana)中，180r 37 °C培养2h后，接入终浓度为0 . ImM的IPTG，16 °C 140r继续培养 6h、12h、18h、22h、28h、34h、40h、48h。将菌液离心 15min (4°C，10000r)，弃去上清液，用PBS重 悬，在冰浴条件下超声破碎30min，然后在4°C，lOOOOr离心lh。取上清液80yL，加入20yL的5 X SDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴 10min，通过10 % SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，发现在 12h 时，上清表达量达到最大值，超过12h后上清的表达量增加不显著。因此，选择12h作为诱导 时间。
[0083] 最终，确定了最优的表达rCCK96-1(mPE38KDEL重组蛋白的条件为：过夜摇培的BL21 (DE3) (rCCK96-1(mPE38KDEL)菌液以1 %的接菌量接种到LB液体培养基(Kana)中，180r，37°C 摇培2h后，加入IPTG至终浓度0.1mM，140r 16°C摇培12h。该条件下表达的可溶性蛋白占 50%以上（附图5)。
[0084] 实施例4 [0085]蛋白纯化策略 [0086] (1)超声破碎
[0087]按照优化后的发酵条件进行诱导表达，将菌液低温高速离心15min(10000r，4°C)， 弃去上清，加入等量roS重悬，离心去上清（10000r，4°C，15min)，重复两次以洗涤菌体。按每 lg菌加入15mL PBS比例用roS(含lmg/mL溶菌酶)重悬，然后使用超声破碎仪进行菌体破碎 (超声总时间30min，功率380W，工作时间Is，间隔时间4s)超声破碎后低温高速离心 (lOOOOr，4°C，lh)，弃去沉淀，上清用0.22μπι滤器过滤后，置于4°C短期保存；
[0088] (2)Ni-NTA 亲和层析
[0089] 使用AKTA purifier 100纯化仪进行纯化，首先打开AKTA purifier 100纯化系 统，连接层析柱；用5-10个柱体积的Ni-NTA亲和层析平衡缓冲液Buffer A充分平衡Ni-NTA 亲和层析柱(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑，10 %甘油，pH = 7.0);将超声上清注入 上样阀，以lmL/min的流速上样，上样后用平衡缓冲液洗脱5个柱体积，收集流穿峰，再用Ni-NTA亲和层析洗脱缓冲液Buffer B(50mM Tris-HC1，0.5M NaCl，500mM咪唑，10%甘油，pH= 7.0)调节混合液咪唑浓度至50111]\1、100111]\1、1501111、2001111、2501111、3001111、3501111、4001111、4501111、 500mM，收集各浓度洗脱液，SDS-PAGE分析(附图6)。
[0090] 分析后确定了 Ni-NTA亲和层析柱rCCK96-1Q4PE38KDEL重组蛋白最佳纯化策略为：将 总蛋白上样后，使混合缓冲液咪唑浓度升至150mM，洗去杂蛋白；再将混合缓冲液咪唑浓度 升至350mM，收集洗脱液蛋白，通过此步纯化，带六聚组氨酸标签的目的蛋白纯度可达到 90%以上；
[0091 ] (3)rTEV切割六聚组氨酸标签条件优化
[0092] 考虑到重组毒素作为抗癌药物的高活性、低免疫原性、以及安全性，需要将六聚组 氨酸标签等非rCCK96- 1Q4PE38KDEL基因序列的冗余序列切除，所以在表达载体构建之初，就 设计添加了rTEV酶的特异性酶切位点。在通过第一步Ni-NTA亲和层析柱纯化后，将回收的 蛋白液透析除盐，加入rTEV酶进行切割，10% SDS-PAGE凝胶电泳分析酶切效果（附图7)，利 用rTEV酶本身带有六聚组氨酸标签的特点，通过第二步Ni-NTA亲和层析柱除去rTEV酶，目 的蛋白的纯度达到95 %以上；
[0093] a rTEV剂量优化
[0094] 每l〇〇〇yg蛋白中分别加入2μL、4μL、6μL、8μL、10μLrTEV酶，4μL 250 XrTEV Buffer，用定容缓冲液(50mM NaH2P〇4，pH = 7.4)定容至1000yL，16°C水浴锅中静置6h，通过 10%SDS-PAGE凝胶电泳分析最佳切割效率的rTEV剂量为每1000yg蛋白中加入4yL rTEV酶；
[0095] b rTEV切割时间优化
[0096] 每l〇〇〇yg蛋白中加入4yL rTEV酶，4yL 250XrTEV Buffer，用定容缓冲液（50mM 恥出？04 411 = 7.4)定容至100(^1^16°(：水浴锅中静置611、811、1011、1211、1411。通过10%505-PAGE凝胶电泳分析最佳切割效率的rTEV切割时间为12h，
[0097] (4)重组蛋白的保存
[0098] 纯化后的蛋白加入终浓度为5 % (m/v)的甘露醇溶液，使用真空冻干机冻干后放 入-80 °C冰箱中保存。
[0099] 实施例5
[0100]体外肿瘤细胞杀伤活性检测
[0101] 将生长状态良好的HCT-8、SW116、SW480、SW620肿瘤细胞分别经胰酶消化后，通过 细胞计数板计数，约5X10 3个细胞/孔铺在96孔细胞培养板中，37°CC02培养箱中孵育4h以 上，待细胞贴壁后加入终浓度为2000ng/mL的rCCK 96-1(mPE38KDEL重组蛋白，放回培养箱中继 续孵育，42h后定时观察细胞形态变化及凋亡情况(附图8)。
[0102] 实施例6
[0103]受体免疫荧光检测
[0104]生长状态良好的HCT-8细胞用胰酶消化后计数，以105个细胞/孔铺入放有细胞爬 片的24孔板。37°C培养过夜，加入4%的多聚甲醛固定30min;PBST(0.05%Tween 20)洗涤3 次，30min内完成；PBST+5 %胎牛血清封闭30min ;加入终浓度为2000ng/mL的rCCK96- 1〇4PE38KDEL重组蛋白，37°C孵育10min，PBST洗涤3次，加入PE38单克隆抗体室温孵育lh; PBST洗涤4次；加入荧光二抗Dylight 488和hochest 33342，孵育30min;PBST洗涤3次；荧光 显微镜观察(附图9)。
[0105]
[0106]
[0107]
【主权项】
1. 一种结肠癌靶向重组毒素，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，由反向 翻译的胆囊收缩素9肽rCCK96-1Q4为导向单元与绿脓杆菌外毒素 A衍生物PE38KDEL融合形成 具有结肠癌靶向的重组毒素 rCCK96-1(mPE38KDEL。2. 编码如权利要求1所述的一种结肠癌靶向重组毒素的基因，其特征在于，其核苷酸序 列SEQ ID No.l所示。3. 如权利要求1所述的一种结肠癌靶向重组毒素的制备方法，其特征在于包括下列步 骤：以含PE38KDEL基因的克隆载体为模板，通过PCR方法扩增出rCCK 96-1(mPE38KDEL基因，并 加入了rTEV酶特异性切割位点，将该重组基因片段插入pET-28a表达载体，引入了六聚组氨 酸标签，转化入BL21 (DE3)诱导表达。4. 根据权利要求3的一种结肠癌靶向重组毒素的制备方法，其特征在于:还包括重组毒 素蛋白的纯化:原核表达的重组毒素带有六聚组氨酸标签，利用组氨酸标签与镍离子亲和 性，通过两步Ni-NTA层析柱纯化法纯化重组毒素，使用rTEV酶切掉六聚组氨酸标签，重组毒 素蛋白的纯度达到95%以上。5. 如权利要求1所述的结肠癌靶向重组毒素在制备的抑制结肠癌的药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK106084065SQ201610394140
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月6日 公开号201610394140.0, CN 106084065 A, CN 106084065A, CN 201610394140, CN-A-106084065, CN106084065 A, CN106084065A, CN201610394140, CN201610394140.0
【发明人】胡盼, 柳增善, 任洪林, 卢士英, 李岩松, 周玉, 张嵩, 柳溪林, 李萌, 常江
【申请人】吉林大学