具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法，属于医药生物工程领域，该具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白全长132个氨基酸，其中1～25为NLS序列，26～39为His?FLAG标签序列，42～121为N240序列，122～132为TAT序列，His?FLAG标签序列与N240序列之间用RS两个氨基酸进行连接；该具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白克服了现有技术中的小分子药物不能阻断TCF4与除β?catenin外其他癌基因的结合导致不能有效抑制肿瘤干细胞的问题，从而能够全方位的阻断TCF4与原癌基因的结合，有效抑制肿瘤干细胞，促进化疗药物的敏感性。
【专利说明】
具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医药生物工程领域，尤其涉及一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组 蛋白及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来肿瘤干细胞(tumor stem cells，TSCs)学说越来越受到关注。目前已经成 功在脑肿瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤中成功分离 出了肿瘤干细胞。肿瘤干细胞假说认为，经药物治疗后肿瘤复发和转移与肿瘤干细胞残存 有密切关系。肿瘤干细胞的提出为肿瘤发生和复发机制提供了合理解释，对于研发更有效 的抗肿瘤药物及干细胞和细胞生物学研究均具有重大意义。随着对TSCs研究的进一步深 入，发现TSCs和正常干细胞有很多相似之处，如耐药、DNA修复活性和抗调亡等，TSCs的耐药 特性帮助TSCs抵抗化疗药物的毒性作用，从而利于肿瘤增殖。
[0003] Wnt信号通路是调控细胞生长、运动和分化的关键途径，Wnt信号通路在胚胎和器 官发育以及维持干细胞的自我更新和防止细胞分化中起到至关重要的作用。近年研究表 明，Wnt/P-catenin通路的不恰当激活，参与了肿瘤的发生、侵袭和转移，与肿瘤干细胞的关 系尤为密切。
[0004] 在没有Wnt信号刺激时，细胞内新合成的β-catenin与APC、Axin、GSK-3f3形成复合 体相互作用，并促进β-catenin迅速被蛋白酶体降解，从而使β-catenin在胞质内保持低水 平;在Wnt信号刺激下，Wnt蛋白可与细胞表面的FZ受体和LRP组成的复合体结合，促使细胞 质中的Dsh聚集至细胞膜下，Dsh诱导GSK-30磷酸化，使其与Axin脱离，阻断β-catenin的磷 酸化和泛素化降解，使得大量游离的β-catenin在胞质聚集并进入细胞核，与TCF/LEF结合 成复合体，激活革G基因的转录，包括原癌基因 c-myc、cyclin Dl、sox2等。
[0005] 正常干细胞通过不对称分裂使其一个子代细胞保持干细胞特性，而另一个子代细 胞最终形成分化终末细胞。Wnt/P-catenin信号通路在维持干细胞池和防止细胞分化中起 到至关重要的作用，它的这种作用是通过稳定胞质中β-catenin的水平来维持的。在人类癌 症中，越来越多的证据表明肿瘤起源于干细胞的非对称分裂的失调。肿瘤干细胞与正常干 细胞的区别在于其对称分裂特性。Wnt/i3-catenin信号通路的调控失常是多种类型细胞发 生癌变的主要原因之一。Wnt/0-catenin信号通路的异常激活的一个标志是β-catenin在细 胞核内的高表达，这也被认为是肿瘤干细胞保持对称分裂的重要原因。最近研究显示，β_ catenin在核内的高表达还赋予TSCs耐药和耐福射损伤的能力。
[0006] 肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是临床肿瘤治疗中的主要障碍，TSCs是造成肿瘤耐 药的重要原因，因此针对T S C s的治疗将比针对整个肿瘤的治疗更为有效。针对W n t / β -catenin信号通路中的重要信号分子的靶向治疗是一类具有发展前景的策略。细胞核中的 β-catenin并不能独立发挥转录调控功能，必须与转录因子TCF4结合才能发挥对革E1基因的 转录。近年的研究证实肿瘤干细胞的存活和维持依赖于细胞核中0-catenin/TCF4的转录因 子复合体的异常高表达。一种有效干预肿瘤干细胞的途径是破坏两者之间的相互结合。
[0007] 目前，已筛选出多个小分子化合物或多肽可阻断β-catenin与TCF4的相互结合，对 肿瘤干细胞致瘤性有明显的抑制作用。目前，已知TCF4蛋白的N端80个氨基酸是β-catenin 结合的关键结构域，同时该结构域还能结合多个致癌基因如ATF2、GRi3等。上述的小分子药 物并不能阻断TCF4与除β-catenin的其他癌基因的结合。因此，如果单独表达TCF4的N端结 构域多肽，使之作为内源性TCF4的竞争性抑制剂将更为有效阻止i3-catenin/TCF4复合体的 形成并抑制TCF/LEF转录调控功能，从而抑制肿瘤干细胞并促进化疗药物的敏感性。
【发明内容】
[0008] 针对上述存在的问题，本发明提供一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白及 其制备方法，以克服现有技术中的小分子药物不能阻断TCF4与除β-catenin的其他癌基因 的结合导致不能有效抑制肿瘤干细胞的问题，从而能够全方位的阻断TCF4与原癌基因的结 合，有效的抑制肿瘤干细胞，促进化疗药物的敏感性。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0010] -种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，其中，将能与β-catenin结合的转录 因子TCF4的氨基端(N端）的80个氨基酸序列命名为N240,在N240的N端连接核定位肽NLS，在 N240的C端连接穿膜信号肽TAT，在NLS和N240之间加入His-FLAG标签，所述具有肿瘤抑制作 用的新型真核重组蛋白功能区代号为:NLS-His-FLAG-N240-TAT;
[0011] 所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白全长132个氨基酸，其中1~25为NLS 序列，26~39为His-FLAG标签序列，42~121为N240序列，122~132为TAT序列，所述His-FLAG 标签序列 与所述 N240序列之间用RS 两个氨基酸进行连接；
[0012] 所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的氨基酸序列为：
[0013]
[0014] 上述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，其中，所述具有肿瘤抑制作用的 新型真核重组蛋白对应的碱基序列为：
[0015]
[0016]
[0017] -种如上述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其中，包括：
[0018] (1) NLS-Hi S-FLAG-N240-TAT基因的克隆
[0019]以pcDNA/Myc-TCF4载体为模板用高保真PCR扩增试剂盒扩增含TCF4前80个氨基酸 的N240序列，在上下游引物中分别引入His-Flag序列和TAT序列，在N端引入NLS序列，得到 初级PCR产物，以所述初级PCR产物为模板扩增最终的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列，而后在 最终的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列两端分别引入内切酶Hind III和Κρη I酶切位点，得到 PCR产物，
[0020]用所述内切酶Hind III和Κρη I酶切所述PCR产物，再用胶回收试剂盒回收，得到 PCR酶切产物；
[0021]用所述内切酶Hind III和Κρη I酶切所述PCR产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳后用质 粒抽提试剂盒回收，得到质粒酶切产物pcDNA3.1质粒；
[0022] 在温度为3~5°C的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切 产物pcDNA3.1质粒连接过夜，而后转化至E. coli Dh5a感受态细胞后涂布到含50μg/ml氨苄 青霉素的LB固体培养基上，在温度为36~38°C的环境下培养过夜；
[0023] 挑取单菌落，LB固体培养基过夜培养后通过PCR初筛阳性克隆、质粒抽提试剂盒抽 提，得到阳性质粒:pcDNA3 · 1-NLS-His-FLAG-N240-TAT;
[0024] (2)HEK293细胞的转染与表达
[0025] 将pcDNA3 · 1-NLS-His-FLAG-N240-TAT通过脂质体转染试剂转染HEK293细胞48小 时后，加入新霉素进行加压筛选，构建表达NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的HEK293稳转细胞 株；
[0026] (3)NLS-His-FLAG-N240-TAT 重组蛋白的分离纯化
[0027]对所述HEK293稳转细胞株进行扩大培养，而后收集细胞并抽提细胞总蛋白，蛋白 抽提液用0.45μπι的滤器过滤，使用Ni柱纯化带有His标签的重组蛋白；
[0028] 具体过程如下:转移树脂到Ni柱，待完全沉淀后，用双蒸水洗涤镍亲和层析柱，并 防止下一步Ni 2+沉淀；用ddH20洗涤，除尽基质中的空气；10X柱体积的Binding buffer平 衡;上样；10 X柱体积的Binding buffer洗涤，收集流出液;Elution buffer洗脱，进一步超 滤浓缩后得到所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白。
[0029] 上述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其中，所述内切酶 Hind IΠ 酶切位点对应的碱基序列为:AAGCTT。
[0030] 上述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其中，所述内切酶Κρη 頂每切位点对应的碱基序列为:GGTACC。
[0031] 上述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其中，步骤（1)中，在 温度为4°C的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切产物pcDNA3.1质 粒连接过夜。
[0032] 上述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其中，步骤（1)中，在 温度为37°C的环境下培养过夜。
[0033] 上述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其中，步骤（1)中，在 得到阳性质粒:pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT后，对所述阳性质粒进行测序，以验证基 因克隆的正确性。
[0034] 上述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其中，步骤(2)中，在 构建表达NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的HEK293稳转细胞株后，还通过Western blot检测 NLS-His-FLAG-N240-TAT 蛋白的表达。
[0035] 上述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其中，还包括:将所述 具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜后，通过His单抗对所述具有 肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白进行鉴定。
[0036] 上述技术方案具有如下优点或者有益效果：
[0037] 本发明提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白全长132个氨基酸，其中1~ 25为NLS序列，26~39为His-FLAG标签序列，42~121为N240序列，122~132为TAT序列，His-FLAG标签序列与N240序列之间用RS两个氨基酸进行连接;该具有肿瘤抑制作用的新型真核 重组蛋白克服了现有技术中的小分子药物不能阻断TCF4与除β-catenin外的其他癌基因的 结合导致不能有效抑制肿瘤干细胞的问题，从而能够全方位的阻断TCF4与原癌基因的结 合，有效的抑制肿瘤干细胞，促进化疗药物的敏感性。
【附图说明】
[0038] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明及其特征、外 形和优点将会变得更加明显。
[0039] 图1是本发明实施例1提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法 中阳性质粒pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT的构建原理示意图；
[0040] 图2是本发明实施例1提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法 中对步骤(3)得到的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白进行12%SDS-PAGE电泳检测的 结果示意图；
[0041] 图3是本发明实施例1提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法 中利用His单克隆抗体通过Western blot鉴定步骤(3)得到的具有肿瘤抑制作用的新型真 核重组蛋白的结果示意图；
[0042] 图4是本发明实施例2提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白免疫荧光双 染显示细胞定位情况示意图；
[0043] 图5是本发明实施例3提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白抑制胶质瘤 干细胞标志物⑶133表达的示意图；
[0044] 图6是本发明实施例3提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白抑制胶质瘤 干细胞中c-Myc表达的示意图；
[0045] 图7是本发明实施例4提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白促进胶质瘤 干细胞对替莫唑胺的敏感性的示意图；
[0046] 图8是本发明实施例5提供的采用具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白时裸鼠 皮下荷瘤生存期分析的示意图。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合附图和具体的实施例对本发明作进一步的说明，但是不作为本发明的限 定。
[0048] 实施例1:
[0049] 本发明实施例1提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，将能与β-catenin 结合的转录因子TCF4的氨基端(N端）的80个氨基酸序列命名为N240,在N240的N端连接核定 位肽NLS，在N240的C端连接穿膜信号肽TAT，在NLS和N240之间加入His-FLAG标签，具有肿瘤 抑制作用的新型真核重组蛋白功能区代号为:NLS-His-FLAG-N240-TAT;具有肿瘤抑制作用 的新型真核重组蛋白全长132个氨基酸，其中1~25为NLS序列，26~39为His-FLAG标签序 列，42~121为N240序列，122~132为TAT序列，His-FLAG标签序列与N240序列之间用RS两个 氨基酸进行连接;该具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的氨基酸序列为：
[0050]
[0052] 本发明实施例1提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白对应的碱基序列 为：
[0053]
[0054] 本发明实施例1提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白中，对照具有肿瘤 抑制作用的新型真核重组蛋白，以TCF4蛋白N端前8-27位氨基酸乱序对照序列 (SKIDLGDGFGLEGNEDQDEA)取代N240序列，其他链接方案不变，由于序列较小不便于通过质 粒表达，故采用多肽合成方法直接合成融合蛋白，命名为NLS-N240sc。
[0055] 图1是本发明实施例1提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法 中阳性质粒pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT的构建原理示意图；图2是本发明实施例1提 供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法中对步骤(3)得到的具有肿瘤抑制 作用的新型真核重组蛋白进行12%SDS-PAGE电泳检测的结果示意图；图3是本发明实施例1 提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法中利用His单克隆抗体通过 Western blot鉴定步骤(3)得到的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的结果示意图； 如图所示，一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，包括：
[0056] (1 )NLS-His-FLAG-N240-TAT 基因的克隆
[0057]以pcDNA/Myc-TCF4载体为模板用高保真PCR扩增试剂盒扩增含TCF4前80个氨基酸 的N240序列，在上下游引物中分别引入His-Flag序列和TAT序列，在N端引入NLS序列，得到 初级PCR产物，以初级PCR产物为模板扩增最终的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列，而后在最终 的NLS-His-FLAG-N240-TAT序列两端分别引入内切酶Hind III和Κρη頂每切位点（参见图 1)，得到PCR产物；
[0058]用内切酶Hind III和Κρη I酶切PCR产物，再用胶回收试剂盒回收，得到PCR酶切产 物；
[0059]用内切酶Hind III和Κρη I酶切PCR产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳后用质粒抽提试 剂盒回收，得到质粒酶切产物pcDNA3.1质粒；
[0060] 在温度为4°C的环境下采用T4DNA连接酶将PCR酶切产物和质粒酶切产物PCDNA3.1 质粒连接过夜，而后转化至E.coli Dh5a感受态细胞后涂布到含50μg/ml氨节青霉素的LB固 体培养基上，在温度为37 °C的环境下培养过夜；
[0061] 挑取单菌落，LB固体培养基过夜培养后通过PCR初筛阳性克隆、质粒抽提试剂盒抽 提，得到阳性质粒:pcDNA3 · 1-NLS-His-FLAG-N240-TAT;
[0062] 对阳性质粒pcDNA3.1-NLS-His-FLAG-N240-TAT送至上海生工进行测序，测序结果 经软件比对，验证基因克隆的正确性；
[0063] (2)HEK293细胞的转染与表达
[0064] 将pCDNA3 · 1-NLS-His-FLAG-N240-TAT通过脂质体转染试剂转染HEK293细胞48小 时后，加入新霉素进行加压筛选，构建表达NLS-His-FLAG-N240-TAT基因的HEK293稳转细胞 株，通过Western blot检测NLS-His-FLAG-N240-TAT蛋白的表达；
[0065] (3)NLS-His-FLAG-N240-TAT 重组蛋白的分离纯化
[0066]对HEK293稳转细胞株进行扩大培养，而后收集细胞并抽提细胞总蛋白，蛋白抽提 液用0.45μπι的滤器过滤，使用Ni柱纯化带有His标签的重组蛋白；
[0067] 具体过程如下:转移树脂到Ni柱，待完全沉淀后，用双蒸水洗涤镍亲和层析柱，并 防止下一步Ni 2+沉淀；用ddH20洗涤，除尽基质中的空气；10X柱体积的Binding buffer平 衡;上样；10 X柱体积的Binding buffer洗涤，收集流出液;Elution buffer洗脱，进一步超 滤浓缩后得到具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，命名为NLS-N240(参见图2);
[0068] (4)NLS_N240的Western blot鉴定
[0069] 将具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜后，通过His单抗 对具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白进行鉴定，鉴定结果参见图3。
[0070]在本发明实施例1提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法中， 内切酶Hind III酶切位点对应的碱基序列为:AAGCTT;内切酶Κρη I酶切位点对应的碱基序 列为:GGTACC。
[0071] 实施例2:
[0072]培养的C0S-7细胞加入500μΜ的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白NLS-N240， 随机乱序多肽NLS-N24〇SC，和无 NLS序列的Ν240真核重组蛋白，6h后用4 %多聚甲醛固定以 备后续免疫荧光染色，其中，NLS-N240SC是对照具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，以 TCF4蛋白N端前8-27位氨基酸乱序对照序列（SKIDLGDGFGLEGNEDQDEA)取代N240序列，其他 链接方案不变，由于序列较小不便于通过质粒表达，故采用多肽合成方法直接合成融合蛋 白；
[0073] 使用抗His小鼠单抗和抗tubulin兔多抗进行免疫荧光双染，参见图4,图4是本发 明实施例2提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白免疫荧光双染显示细胞定位情况 示意图，结果显示所有重组蛋白均能进入细胞，但仅带有NLS序列的重组蛋白能定位于细胞 核，表明我们的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白不仅能进入细胞，而且能顺利定位 于细胞核并发挥作用。
[0074] 实施例3:
[0075] 用神经干细胞培养液(D/F12+EGF+bFGF+N2)培养人胶质瘤细胞U251和A172,同时 加入NLS-N240具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白和对照蛋白NLS-N24〇SC，浓度为500μ Μ，同时设溶剂对照组，培养至5d溶剂对照组形成直径约100μπι的干细胞球时收集培养液中 悬浮的细胞球，部分细胞用来抽提RNA后进行PCR检测，部分细胞抽提蛋白用来进行Western blot检测靶基因 c-Myc的表达量，其中，NLS-N240sc是对照具有肿瘤抑制作用的新型真核重 组蛋白，以TCF4蛋白N端前8-27位氨基酸乱序对照序列（SKIDLGDGFGLEGNEDQDEA)取代N240 序列，其他链接方案不变，由于序列较小不便于通过质粒表达，故采用多肽合成方法直接合 成融合蛋白。
[0076]通过CD133特异性引物对收集到的胶质瘤干细胞RNA进行PCR检测并相对定量，以 GAPDH为内参，参见图5,图5是本发明实施例3提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋 白抑制胶质瘤干细胞标志物⑶133表达的示意图，结果表明NLS-N240可显著抑制肿瘤干细 胞标志物⑶133的表达。
[0077] 通过Western blot对收集到的胶质瘤干细胞中TCF/LEF革E1蛋白c-Myc进行检测，以 actin为内参，参见图6,图6是本发明实施例3提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋 白抑制胶质瘤干细胞中c-Myc表达的示意图，结果表明NLS-N240可显著抑制肿瘤干细胞中 促癌基因 c-Myc的表达。
[0078] 实施例4:
[0079]采用贴壁培养方式培养胶质瘤干细胞(GSC)，加入不同浓度的胶质瘤化疗药物替 莫唑胺（TMZ，50、125、250、500、ΙΟΟΟμΜ)联合NLS-N240(500μΜ)，分组：（1)TMZ; (2)TMZ+NLS-N240sc;(3)TMZ+NLS-N240;连续培养5d，其中，NLS-N240sc是对照具有肿瘤抑制作用的新型 真核重组蛋白，以TCF4蛋白N端前8-27位氨基酸乱序对照序列（SKIDLGDGFGLEGNEDQDEA)取 代N240序列，其他链接方案不变，由于序列较小不便于通过质粒表达，故采用多肽合成方法 直接合成融合蛋白。
[0080]用Promega公司生产的LDH检测试剂盒检测细胞毒性，参见图7，图7是本发明实施 例4提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白促进胶质瘤干细胞对替莫唑胺的敏感性 的示意图，结果显示加入NLS-N240真核重组蛋白后显著促进胶质瘤干细胞对TMZ的敏感性。 [0081 ] 实施例5:
[0082]用神经干细胞培养液培养胶质瘤细胞系U87形成胶质瘤干细胞球，用Accutase消 化成单细胞，继续用神经干细胞培养液培养使之再次形成干细胞球，用Accutase消化呈单 细胞，用D/F12培养液与Matr i ge 1 (BD公司产品）按1:1重悬用于裸鼠皮下成瘤实验。
[0083] 按每只balb/c裸鼠2xl06/100ul浓度皮下注射建立胶质瘤干细胞裸鼠皮下模型。1 周后皮下形成明显肿瘤包块后，随机分组"DDMSOiOTMZdS^LS-m^dOTMZ+NLS-mdO, 每组 10 只 ，分别给予腹腔注射 DMS0-PBS 缓冲液、替莫唑胺 （50mg/kg/d，dl-5)、NLS-N240(10yg/只，2天一次，持续14天）、TMZ(方案同前)+NLS-N240(方案同前），给药停止后继 续正常饮食饲养，持续观察裸鼠生存期，通过log-rank法比较各组动物的生存期，参见图8， 图8是本发明实施例5提供的采用具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白时裸鼠皮下荷瘤 生存期分析的示意图，结果显示，NLS-N240单独治疗对裸鼠荷瘤后生存期无明显影响，而 TMZ单独治疗有利于裸鼠荷瘤后的生存期，而两者联合治疗则较TMZ单独治疗有更明显的延 长生存期的效果。
[0084] 综上所述，本发明实施例提供的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白全长132 个氨基酸，其中1~25为NLS序列，26~39为His-FLAG标签序列，42~121为N240序列，122~ 132为TAT序列，His-FLAG标签序列与N240序列之间用RS两个氨基酸进行连接;该具有肿瘤 抑制作用的新型真核重组蛋白克服了现有技术中的小分子药物不能阻断TCF4与除β-catenin的其他癌基因的结合导致不能有效抑制肿瘤干细胞的问题，从而能够全方位的阻 断TCF4与原癌基因的结合，有效的抑制肿瘤干细胞，促进化疗药物的敏感性。
[0085] 本领域技术人员应该理解，本领域技术人员结合现有技术以及上述实施例可以实 现所述变化例，在此不予赘述。这样的变化例并不影响本发明的实质内容，在此不予赘述。
[0086] 以上对本发明的较佳实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式;任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案作出许多可能的变 动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，这并不影响本发明的实质内容。因此，凡是未 脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、 等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
【主权项】
1. 一种具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，其特征在于，将能与β-catenin结合的 转录因子TCF4的氨基端(N端）的80个氨基酸序列命名为N240,在N240的N端连接核定位肤 化S，在N240的C端连接穿膜信号肤TAT，在化S和N240之间加入化S-化AG标签，所述具有肿瘤 抑制作用的新型真核重组蛋白功能区代号为:化S-His-化AG-N240-TAT; 所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白全长132个氨基酸，其中1~25为化S序列， 26~39为化S-FLAG标签序列，42~121为N240序列，122~132为TAT序列，所述化S-FLAG标签 序列与所述N240序列之间用RS两个氨基酸进行连接； 所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的氨基酸序列为：2. 如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白，其特征在于，所述具有 肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白对应的碱基序列为：3. -种如权利要求1所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特 征在于，包括： (1)化S-His-化AG-N240-TAT基因的克隆 WpcDNA/Myc-TCF4载体为模板用高保真PCR扩增试剂盒扩增含TCF4前80个氨基酸的 N240序列，在上下游引物中分别引入化s-Flag序列和TAT序列，在N端引入化S序列，得到初 级PCR产物，W所述初级PCR产物为模板扩增最终的化S-His-FLAG-N240-TAT序列，而后在最 终的化S-化S-化AG-N240-TAT序列两端分别引入内切酶化nd III和Κρη I酶切位点，得到 PCR产物， 用所述内切酶化nd III和Κρη I酶切所述PCR产物，再用胶回收试剂盒回收，得到PC贿每 切产物； 用所述内切酶化nd III和Κρη I酶切所述PCR产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳后用质粒抽 提试剂盒回收，得到质粒酶切产物pcDNA3.1质粒； 在溫度为3~5°C的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶切产物 PCDNA3.1质粒连接过夜，而后转化至E. coli化5α感受态细胞后涂布到含50μg/ml氨节青霉 素的LB固体培养基上，在溫度为36~38°C的环境下培养过夜； 挑取单菌落，LB固体培养基过夜培养后通过PCR初筛阳性克隆、质粒抽提试剂盒抽提， 得到阳性质粒:PCDNA3.1-NLS-His-化 AG-N240-TAT; (2化EK293细胞的转染与表达 将PCDNA3.1-化S-His-FLAG-N240-TAT通过脂质体转染试剂转染肥K293细胞48小时后， 加入新霉素进行加压筛选，构建表达化S-His-化AG-N240-TAT基因的肥K293稳转细胞株； (3)化S-Hi S-化AG-N240-TAT重组蛋白的分离纯化 对所述皿K293稳转细胞株进行扩大培养，而后收集细胞并抽提细胞总蛋白，蛋白抽提 液用0.45WI1的滤器过滤，使用Ni柱纯化带有化S标签的重组蛋白； 具体过程如下:转移树脂到Μ柱，待完全沉淀后，用双蒸水洗涂儀亲和层析柱，并防止 下一步Ni化沉淀；用dd肥0洗涂，除尽基质中的空气；10 X柱体积的Binding buffer平衡;上 样；10 X柱体积的Binding buffer洗涂，收集流出液;Elution buffer洗脱，进一步超滤浓 缩后得到所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白。4. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在 于，所述内切酶化nd III酶切位点对应的碱基序列为:AAGCTT。5. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在 于，所述内切酶Κρη I酶切位点对应的碱基序列为:GGTACC。6. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在 于，步骤（1)中，在溫度为4°C的环境下采用T4DNA连接酶将所述PCR酶切产物和所述质粒酶 切产物PCDNA3.1质粒连接过夜。7. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在 于，步骤(1)中，在溫度为37°C的环境下培养过夜。8. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在 于，步骤（1)中，在得到阳性质粒:PCDNA3.1-NLS-Hi S-化AG-N240-TAT后，对所述阳性质粒进 行测序，W验证基因克隆的正确性。9. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在 于，步骤（2)中，在构建表达化S-化S-FLAG-N240-TAT基因的皿K293稳转细胞株后，还通过 Western blot检测化S-His-化AG-N240-TAT蛋白的表达。10. 如权利要求3所述的具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白的制备方法，其特征在 于，还包括:将所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白经SDS-PAGE电泳、转膜后，通过 His单抗对所述具有肿瘤抑制作用的新型真核重组蛋白进行鉴定。
【文档编号】C07K19/00GK106084067SQ201610416328
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日 公开号201610416328.0, CN 106084067 A, CN 106084067A, CN 201610416328, CN-A-106084067, CN106084067 A, CN106084067A, CN201610416328, CN201610416328.0
【发明人】邹健, 殷莹, 平锋锋, 蒋孟军, 陈越新
【申请人】无锡市人民医院