一种精品肝素钠的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种精品肝素钠的制备方法，属于肝素钠制备技术领域。本发明将膨胀珍珠岩负载复合酶得到自制酶制剂，用其预处理粗品肝素钠，再经过氧化氢一次氧化即可制得精品肝素钠。实例证明，本发明方法独特新颖，不仅避免了传统精制方法中副产物的产生，从最大程度降低了产品活性损失，且简化了精制步骤，有效提高了精品肝素钠的效价和效价回收率，使得效价可达160～170u/mg，回收率达到98％以上。
【专利说明】
一种精品肝素钠的制备方法
技术领域
[0001]本发明公开了一种精品肝素钠的制备方法，属于肝素钠制备技术领域。
【背景技术】
[0002]肝素钠(HeparinSodium)是粘多糖硫酸酯类抗凝血药。肝素钠是由猪或牛的肠粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属粘多糖类物质。在体内外均具有抗凝血作用，是目前主流的抗凝血药品。但是普通肝素钠的生物利用度低，副作用大，后来人们发现肝素钠裂解获取的硫酸氨基葡聚糖片段的钠盐，平均分子量为4000?6000道尔顿，称为低分子肝素钠。低分子肝素钠注射液和肝素钠注射液一样属于抗凝血酶m(ATm)依赖性凝血酶抑制剂。但与肝素钠注射液相比，具有半衰期较长、抗血栓效果好、出血倾向较弱、给药方便，但价格比较贵。而达肝素为其中一种。达肝素钠注射液主要用于急性深静脉血栓的治疗，急性肾功能衰竭或慢性肾功能不全者进行血液透析和血液过滤期间防止体外循环系统中发生凝血，不稳定型冠心病，如不稳定型心绞痛和非Q-波型心肌梗塞，预防与手术有关的血栓形成。是目前主流的抗血栓类药物。
[0003]肝素的精制过程主要是对粗品肝素钠进行除蛋白提纯和脱色，达到国家药典标准要求。在我国肝素的精制多采用高锰酸钾和过氧化氢两步氧化法或过氧化氢分次加入的二次氧化法生产工艺；同时也有资料报道，采用酶解结合氧化法精制肝素的记载。但是上述几种工艺都存在不足;第一种高锰酸钾和过氧化氢两步氧化法存在二氧化锰吸食肝素，使肝素活性损失大，回收率低;过滤困难，生产周期长，色泽不好，质量差等缺点；第二种过氧化氧分次加入的二次氧化法工艺，因产品色泽较好，目前被普遍采用。但该工艺主要存在二次氧化氢处理对肝素结构造成破坏，难以得到较高效价的精品肝素产品的不足。
[0004]目前市面上肝素钠提取工艺种类繁多，但还是需要一种保证产品活性、色泽的同时，还可以使得原料生产成本低廉，工艺简单的制备肝素钠的方法。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题:针对目前常用高锰酸钾和过氧化氢两步氧化法或过氧化氢分次加入的二次氧化法生产精品肝素钠，由此产生的产品活性损失大、色泽差、副产物二氧化锰降低产品收率且效价低的缺陷，提供了一种将膨胀珍珠岩负载复合酶得到自制酶制剂，用其预处理粗品肝素钠，再经过氧化氢一次氧化即可制得精品肝素钠。该方法独特新颖，不仅避免了传统精制方法中副产物的产生，从最大程度降低了产品活性损失，且简化了精制步骤，有效提高了精品肝素钠的效价和效价回收率，使得效价可达160?170u/mg，回收率达到98%以上。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)称取40?50g膨胀珍珠岩分别用浓度为0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氢氧化钠溶液浸泡3?5h，移入布氏漏斗抽滤洗涤20?30min，得到表面改性的膨胀珍珠岩；
(2)按质量比为5:3:1将胰蛋白酶、碱性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者总体积3?5倍的去离子水，搅拌均匀后转入真空浓缩罐，在900?100Pa压力下浓缩至其原体积的1/2得复合酶液，按固液比为1:3将上述表面改性的膨胀珍珠岩浸入复合酶液，放入超声振荡仪以200?300W功率振荡浸渍过夜；
(3)浸渍结束后过滤分离得到滤渣，用真空冻干机在-40?-30°C下冻干后即得自制固定化复合酶制剂；
(4)称取I?2kg粗品肝素钠溶于其体积3?5倍质量浓度为3%氯化钠溶液中，搅拌10?20min后过滤去除滤渣得滤液，将得到的滤液装入陶瓷酶解罐中，再加入滤液总质量5?10%上述自制固定化复合酶制剂，用浓度为0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.5?8.5，常温酶解5?6h后过滤去除滤渣得无蛋白酶解液；
(5)向上述无蛋白酶解液中加入其体积1/10质量浓度为30%过氧化氢溶液，在20?25°C下静置氧化处理1?12h后过滤分离得到氧化液，向氧化液中加入其体积I?2倍的无水乙醇，放入4?6°C的冰水浴中静置沉淀6?8h，用卧式离心机以3000?5000r/min转速离心分离后得下层沉淀，真空干燥后即得精品肝素钠。
[0007]本发明的应用方法是:将本发明制得的精品肝素钠按照医学配制，通过灌封、灭菌、包装等常规注射剂制备工艺，制成皮下注射的注射剂，使用时，注入人体即可，每日早晚一次，成人每次用量为15?20mg，连续注射3?5天，经检测，用作抗凝、抗血栓药物，治疗效果显著，最终测得抗凝血因子a的值为160?170IU/mg，抗凝血酶值为0.65?0.75IU/mg。
[0008]本发明的有益效果是:
(1)本发明方法独特新颖，避免了传统精制方法中副产物的产生，从最大程度降低了产品活性损失，且简化了静置步骤；
(2)本发明有效提高了精品肝素钠的效价和效价回收率，使得效价可达160?170u/mg，回收率达到98%以上，可广泛应用于医疗领域。
【具体实施方式】
[0009]首先称取40?50g膨胀珍珠岩分别用浓度为0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氢氧化钠溶液浸泡3?5h，移入布氏漏斗抽滤洗涤20?30min，得到表面改性的膨胀珍珠岩;然后按质量比为5:3:1将胰蛋白酶、碱性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者总体积3?5倍的去离子水，搅拌均匀后转入真空浓缩罐，在900?100Pa压力下浓缩至其原体积的1/2得复合酶液，按固液比为1:3将上述表面改性的膨胀珍珠岩浸入复合酶液，放入超声振荡仪以200?300W功率振荡浸渍过夜;浸渍结束后过滤分离得到滤渣，用真空冻干机在-40?-30°C下冻干后即得自制固定化复合酶制剂;接下来称取I?2kg粗品肝素钠溶于其体积3?5倍质量浓度为3%氯化钠溶液中，搅拌10?20min后过滤去除滤渣得滤液，将得到的滤液装入陶瓷酶解罐中，再加入滤液总质量5?10%上述自制固定化复合酶制剂，用浓度为0.lmol/L氢氧化钠溶液调节PH至7.5?8.5，常温酶解5?6h后过滤去除滤渣得无蛋白酶解液;最后向上述无蛋白酶解液中加入其体积1/10质量浓度为30%过氧化氢溶液，在20?25°C下静置氧化处理10?12h后过滤分离得到氧化液，向氧化液中加入其体积I?2倍的无水乙醇，放入4?6 °C的冰水浴中静置沉淀6?8h，用卧式离心机以3000?5000r/min转速离心分离后得下层沉淀，真空干燥后即得精品肝素钠。
[0010]实例I 首先称取40g膨胀珍珠岩分别用浓度为0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氢氧化钠溶液浸泡3h，移入布氏漏斗抽滤洗涤20min，得到表面改性的膨胀珍珠岩;然后按质量比为5:3:1将胰蛋白酶、碱性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者总体积3倍的去离子水，搅拌均匀后转入真空浓缩罐，在900Pa压力下浓缩至其原体积的1/2得复合酶液，按固液比为1:3将上述表面改性的膨胀珍珠岩浸入复合酶液，放入超声振荡仪以200W功率振荡浸渍过夜;浸渍结束后过滤分离得到滤渣，用真空冻干机在-40°C下冻干后即得自制固定化复合酶制剂;接下来称取Ikg粗品肝素钠溶于其体积3倍质量浓度为3%氯化钠溶液中，搅拌1min后过滤去除滤渣得滤液，将得到的滤液装入陶瓷酶解罐中，再加入滤液总质量5%上述自制固定化复合酶制剂，用浓度为0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.5，常温酶解5h后过滤去除滤渣得无蛋白酶解液;最后向上述无蛋白酶解液中加入其体积1/10质量浓度为30%过氧化氢溶液，在20°C下静置氧化处理1h后过滤分离得到氧化液，向氧化液中加入其体积I倍的无水乙醇，放入40C的冰水浴中静置沉淀6h，用卧式离心机以3000r/min转速离心分离后得下层沉淀，真空干燥后即得精品肝素钠。
[0011]本实例操作简便，将本发明制得的精品肝素钠按照医学配制，通过灌封、灭菌、包装等常规注射剂制备工艺，制成皮下注射的注射剂，使用时，注入人体即可，每日早晚一次，成人每次用量为15mg，连续注射3天，经检测，用作为抗凝、抗血栓药物，治疗效果显著，最终测得抗凝血因子a的值为160 IU/mg，抗凝血酶值为0.65 IU/mg。
[0012]实例2
首先称取45g膨胀珍珠岩分别用浓度为0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氢氧化钠溶液浸泡4h，移入布氏漏斗抽滤洗涤25min，得到表面改性的膨胀珍珠岩;然后按质量比为5:3:1将胰蛋白酶、碱性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者总体积4倍的去离子水，搅拌均匀后转入真空浓缩罐，在950Pa压力下浓缩至其原体积的1/2得复合酶液，按固液比为1:3将上述表面改性的膨胀珍珠岩浸入复合酶液，放入超声振荡仪以250W功率振荡浸渍过夜;浸渍结束后过滤分离得到滤渣，用真空冻干机在_35°C下冻干后即得自制固定化复合酶制剂;接下来称取1.5kg粗品肝素钠溶于其体积4倍质量浓度为3%氯化钠溶液中，搅拌15min后过滤去除滤渣得滤液，将得到的滤液装入陶瓷酶解罐中，再加入滤液总质量8%上述自制固定化复合酶制剂，用浓度为0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.0，常温酶解5.5h后过滤去除滤渣得无蛋白酶解液;最后向上述无蛋白酶解液中加入其体积1/10质量浓度为30%过氧化氢溶液，在23°C下静置氧化处理I Ih后过滤分离得到氧化液，向氧化液中加入其体积1.5倍的无水乙醇，放入5°C的冰水浴中静置沉淀7h，用卧式离心机以4000r/min转速离心分离后得下层沉淀，真空干燥后即得精品肝素钠。
[0013]本实例操作简便，将本发明制得的精品肝素钠按照医学配制，通过灌封、灭菌、包装等常规注射剂制备工艺，制成皮下注射的注射剂，使用时，注入人体即可，每日早晚一次，成人每次用量为18mg，连续注射4天，经检测，用作为抗凝、抗血栓药物，治疗效果显著，最终测得抗凝血因子a的值为165IU/mg，抗凝血酶值为0.7 IU/mg 0
[0014]实例3
首先称取50g膨胀珍珠岩分别用浓度为0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氢氧化钠溶液浸泡5h，移入布氏漏斗抽滤洗涤30min，得到表面改性的膨胀珍珠岩;然后按质量比为5:3:1将胰蛋白酶、碱性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者总体积5倍的去离子水，搅拌均匀后转入真空浓缩罐，在100Pa压力下浓缩至其原体积的1/2得复合酶液，按固液比为1:3将上述表面改性的膨胀珍珠岩浸入复合酶液，放入超声振荡仪以300W功率振荡浸渍过夜;浸渍结束后过滤分离得到滤渣，用真空冻干机在-30°C下冻干后即得自制固定化复合酶制剂;接下来称取2kg粗品肝素钠溶于其体积5倍质量浓度为3%氯化钠溶液中，搅拌20min后过滤去除滤渣得滤液，将得到的滤液装入陶瓷酶解罐中，再加入滤液总质量10%上述自制固定化复合酶制剂，用浓度为0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.5，常温酶解6h后过滤去除滤渣得无蛋白酶解液;最后向上述无蛋白酶解液中加入其体积1/10质量浓度为30%过氧化氢溶液，在25 0C下静置氧化处理12h后过滤分离得到氧化液，向氧化液中加入其体积2倍的无水乙醇，放入60C的冰水浴中静置沉淀Sh，用卧式离心机以5000r/min转速离心分离后得下层沉淀，真空干燥后即得精品肝素钠。
[0015]本实例操作简便，将本发明制得的精品肝素钠按照医学配制，通过灌封、灭菌、包装等常规注射剂制备工艺，制成皮下注射的注射剂，使用时，注入人体即可，每日早晚一次，成人每次用量为20mg，连续注射5天，经检测，用作为抗凝、抗血栓药物，治疗效果显著，最终测得抗凝血因子a的值为170IU/mg，抗凝血酶值为0.75 IU/mg 0
【主权项】
1.一种精品肝素钠的制备方法，其特征在于具体制备步骤为: (1)称取40?50g膨胀珍珠岩分别用浓度为0.5mol/L硫酸溶液和0.3mol/L氢氧化钠溶液浸泡3?5h，移入布氏漏斗抽滤洗涤20?30min，得到表面改性的膨胀珍珠岩； (2)按质量比为5:3:1将胰蛋白酶、碱性蛋白酶和脂肪酶混合后加入三者总体积3?5倍的去离子水，搅拌均匀后转入真空浓缩罐，在900?100Pa压力下浓缩至其原体积的1/2得复合酶液，按固液比为1:3将上述表面改性的膨胀珍珠岩浸入复合酶液，放入超声振荡仪以200?300W功率振荡浸渍过夜； (3)浸渍结束后过滤分离得到滤渣，用真空冻干机在-40?-30°C下冻干后即得自制固定化复合酶制剂； (4)称取I?2kg粗品肝素钠溶于其体积3?5倍质量浓度为3%氯化钠溶液中，搅拌10?20min后过滤去除滤渣得滤液，将得到的滤液装入陶瓷酶解罐中，再加入滤液总质量5?10%上述自制固定化复合酶制剂，用浓度为0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.5?8.5，常温酶解5?6h后过滤去除滤渣得无蛋白酶解液； (5 )向上述无蛋白酶解液中加入其体积I /10质量浓度为30%过氧化氢溶液，在20?25 °C下静置氧化处理1?12h后过滤分离得到氧化液，向氧化液中加入其体积I?2倍的无水乙醇，放入4?6°C的冰水浴中静置沉淀6?8h，用卧式离心机以3000?5000r/min转速离心分离后得下层沉淀，真空干燥后即得精品肝素钠。
【文档编号】A61K31/727GK106084090SQ201610501525
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】郭舒洋, 张明, 林茂平
【申请人】郭舒洋