一种细胞共培养装置及其制作方法、使用方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种细胞共培养装置及其制作方法、使用方法和应用，该细胞共培养装置包括底板，底板上放置有若干用于细胞培养的玻璃片，玻璃片上放置有遮挡物，每个玻璃片的一部分被遮挡物遮挡住，记为区域2，玻璃片未被遮挡物遮挡住的部分记为区域1，且玻璃片上带有用于区分区域1和区域2范围的标记。本发明提供的细胞共培养装置，在使用时通过将特定的细胞接种在特定的部位，即可根据接种部位确定细胞类型，不需要再对细胞进行分子标记，就可开展不同细胞之间的相互影响的研究，可用于研究不同状态之间的同种细胞通过直接接触而带来的相互影响，还可用于研究不同种细胞通过直接接触而带来的相互影响。
【专利说明】
一种细胞共培养装置及其制作方法、使用方法和应用
技术领域
[0001]本发明属于生物细胞培养实验装置领域，涉及一种用于研究细胞与细胞之间影响的细胞共培养装置及其制作方法、使用方法和应用。
【背景技术】
[0002]生物体是由多种细胞组成的有机整体，不同细胞之间通过相互影响，协调发挥作用，维持器官、组织的正常，细胞之间的相互影响一直是研究的热点。不同细胞之间存在相互影响，例如:少突胶质细胞与神经元细胞之间的细胞通讯影响髓鞘的形成，心肌细胞与成纤维细胞之间的相互影响参与心脏的发育过程，树突状细胞与T淋巴细胞之间的相互作用参与免疫反应中的抗原提成过程，等等。同种细胞不同状态之间也存在相互影响，例如:视网膜层内的凋亡信号可以在组织内扩散，使凋亡细胞周围的正常细胞发生凋亡；心肌梗死过程中，死亡信号可以通过缝隙连接传递，使死亡心肌细胞周围的正常细胞发生凋亡或坏死，等等。细胞之间的相互影响广泛，在机体生理和病理状态下发挥重要作用，值得进行系统的研究。
[0003]目前针对细胞之间的影响，实验方法很多，主要是采用细胞共培养，研究细胞之间的相互影响。细胞共培养的实验方法可以分为以下几类；(I)Transwell共培养体系。实验装置分为上室和下室，二者之间由一层聚碳酸酯膜半透膜(半透膜孔径:?3μπι)隔开，上室内培养一种细胞，下室内培养另一种细胞，细胞自身不能通过半透膜，但是细胞分泌的各种因子可以自由通透;此实验装置用于研究一种细胞分泌的细胞因子对另一种细胞的作用，不能用于研究一种细胞通过细胞接触方式，对另一种细胞的作用。(2)两种细胞在一个培养板内生长。两种不同种类的细胞先后按照一定比例接种于一个培养板，培养一段时间后，对两类细胞的标志蛋白通过免疫组化进行染色，区分培养板内的不同种类细胞，观察共培养过程对细胞生长的影响，此实验方法用于研究一种细胞通过分泌因子或者直接接触，对另一种细胞的影响。(3)两种细胞先后在一个培养板内生长。一种细胞接种到培养板内，培养一段时间之后，细胞之间达到接近80%的融合，随后再少量接种另一种细胞，培养板内形成两层细胞，下层为第一种细胞，上层为第二种细胞，此实验方法用于研究不同细胞之间通过直接接触对细胞之间的影响。(4)两种细胞在一个培养板内生长。两种不同种类的细胞按照一定比例接种于一个培养板，培养一段时间后，通过流式细胞术将两种细胞区分收集，随后进行生化分析，研究细胞之间的相互影响。(5)采用基因工程的方法，标记细胞后进行共培养。焚光蛋白标记其中一种细胞后，将其与其它细胞在一个培养板内培养，通过焚光区分两种细胞，随后观察一系列指标，研究两种细胞之间的影响。
[0004]尽管已经存在多种共培养方法，还有一类共培养研究是目前的实验方法不能满足的。例如目前需要进行研究的课题为:研究绿色荧光蛋白(GFP)在相互接触的心肌细胞之间的扩散过程，而目前的共培养方法均不适用于此研究。原因在于:(I)Transwell共培养体系;此方法的问题在于，此方法适用于研究两种细胞之间的相互作用，两种细胞之间不存在直接接触，因此不适用于上述课题。(2)两种细胞按一定比例同时接种于一个培养板内；此方法的问题在于，如果采用此共培养方法，需要提前通过病毒感染的方式，将GFP导入心肌细胞内，随后将感染病毒的心肌细胞与未感染病毒的心肌细胞，在一个培养板内共培养，观察GFP蛋白的扩散过程。此方法的缺陷在于培养后期细胞出现绿色荧光有两种情况，第一种情况:感染病毒量少的细胞，前期GFP表达量少，在前期不能被确认，病毒经过自身复制，后期GFP表达量增加，细胞会出现荧光;第二种情况:前期感染病毒，表达GFP并且出现荧光的心肌细胞，与周围未感染的细胞接触后，通过多种方式，GFP可以从感染病毒的细胞扩散至未感染病毒的细胞，未感染病毒的细胞也会出现荧光。此共培养方法不能区分出现荧光的细胞是第一种情况，还是第二种情况，因此该方法不适用于上述课题的研究。(3)两种细胞以上下两层的方式进行共培养;此方法的问题在于，心肌细胞在培养一段时间后，不仅会相互融合，还会以层叠的方式生长，时间越长，上下两层的细胞区分越不明显，因此该方法不能用于上述课题的研究。(4)细胞共培养后通过流式细胞术分离收集两种细胞;此方法的问题在于，此方法只能区分表达GFP的心肌细胞和不表达GFP的心肌细胞，不能确认GFP来源于病毒感染，还是GFP由其它细胞扩散而来，因此该方法不能用于上述课题的研究。(5)采用基因工程的方法标记细胞后进行共培养;此方法的问题在于，对细胞同时进行GFP和第二种分子标记，不能保证第二种分子始终局限于病毒感染的细胞，有可能也会通过细胞接触的方式转移，因此该方法不能用于上述课题的研究。因此需要开发设计一套能够用于上述课题的新的细胞共培养装置，使得不需要对细胞进行分子标记，即可研究不同状态之间的同种细胞通过直接接触而带来的相互影响。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种细胞共培养装置及其制作方法、使用方法和应用，使用该细胞共培养装置时不需要对细胞进行分子标记，即可研究不同状态之间的同种细胞通过直接接触而带来的相互影响，同时还能研究不同种细胞通过直接接触而带来的相互影响。
[0006]为达到上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0007]一种细胞共培养装置，包括底板，底板上放置有若干用于细胞培养的玻璃片，玻璃片上放置有遮挡物，每个玻璃片的一部分被遮挡物遮挡住，记为区域2，玻璃片未被遮挡物遮挡住的部分记为区域I，且玻璃片上带有用于区分区域I和区域2范围的标记。
[0008]所述的底板为表面平整的玻璃板，玻璃片为盖玻片，遮挡物为载玻片、盖玻片或透明胶带。
[0009]所述的细胞共培养装置的制造方法，其具体步骤如下:
[0010]选取表面平整、洁净的底板，在底板上放置若干表面平整、洁净的玻璃片，并在玻璃片上标上用于区分区域I和区域2范围的标记，然后用遮挡物遮挡住区域2，再进行消毒处理，即得到细胞共培养装置。
[0011]所述的消毒处理是采用钴源照射的方式消毒。
[0012]所述的细胞共培养装置在培养两种不同的细胞方面的应用。
[0013]所述的细胞共培养装置在培养两种不同细胞状态下的同种细胞方面的应用。
[0014]所述的细胞共培养装置的使用方法，其具体步骤如下:
[0015]I)将无菌的细胞共培养装置放入培养皿内，然后将细胞A接种至培养皿内进行培养，再将细胞共培养装置从培养皿内移走，此时细胞共培养装置中底板上未被覆盖的区域、玻璃片上的区域I及遮挡物上均贴敷有细胞A;
[0016]2)将遮挡物从细胞共培养装置中移去，露出未被细胞A贴敷的区域2，再移去底板，只保留玻璃片，此时玻璃片的区域I上贴敷有细胞A，区域2上未贴敷任何细胞；
[0017]3)将玻璃片移入24孔板内，向24孔板内接种携带基因X的病毒，孵育细胞，使病毒感染细胞A，此时玻璃片区域I上的部分细胞A被病毒感染，再将24孔板内的培养液换成新鲜培养液，清除培养液中游尚的病毒；
[0018]4)在24孔板内再次接种细胞A进行培养，此时玻璃片的区域I和区域2上均贴敷有第二次接种的细胞A，同时区域I上还贴敷有第一次接种的未被病毒感染的细胞A和第一次接种的被病毒感染的细胞A;
[0019]5)将玻璃片移入新的24孔板内继续进行细胞培养，最后收集区域2上贴敷的细胞进行生化分析，分析区域I内的细胞对区域2内细胞的影响。
[0020]所述的细胞共培养装置的使用方法，其具体步骤如下:
[0021]I)将无菌的细胞共培养装置放入培养皿内，然后将细胞A接种至培养皿内进行培养，再将细胞共培养装置从培养皿内移走，此时细胞共培养装置中底板上未被覆盖的区域、玻璃片上的区域I及遮挡物上均贴敷有细胞A;
[0022]2)将遮挡物从细胞共培养装置中移去，露出未被细胞A贴敷的区域2，再移去底板，只保留玻璃片，此时玻璃片的区域I上贴敷有细胞A，区域2上未贴敷任何细胞；
[0023]3)将玻璃片移入24孔板内，向24孔板内接种细胞B进行培养，此时玻璃片的区域I上同时贴敷有细胞A和细胞B，区域2上仅贴敷有细胞B;
[0024]4)将玻璃片移入新的24孔板内继续进行细胞培养，最后收集区域2上贴敷的细胞进行生化分析，分析区域I内的细胞对区域2内细胞的影响。
[0025]相对于现有技术，本发明的有益效果为:
[0026]本发明提供的细胞共培养装置结构简单，制作方法简便，而且容易使用，并且具有以下四点现有的细胞共培养装置所不具备的优势，具体如下:
[0027]I)本发明提供的细胞共培养装置可以用于研究两种不同细胞之间的影响:将细胞A接种在区域I，细胞B接种在区域2，可以研究细胞A对细胞B的影响，尤其是可以研究细胞A通过直接接触细胞B的方式对细胞B产生的影响；
[0028]2)本发明提供的细胞共培养装置还可以研究同种细胞不同状态之间的影响:将A状态的细胞C接种在区域I，B状态的细胞C接种在区域2，可以研究A状态的细胞C对B状态的细胞C的影响，尤其是可以研究A状态的细胞C通过直接接触B状态的细胞C的方式对B状态的细胞C产生的影响；
[0029]3)本发明提供的细胞共培养装置在使用前不需要对待研究的细胞进行标记:因为根据本发明的细胞共培养装置的使用方法，将特定的细胞接种在特定的部位，最后在区域2内的细胞都是同一类，根据标记确定区域2在玻璃片上的位置后，即可根据位置确定玻璃片上细胞的类型，无需通过细胞自身的标志蛋白或形态确定细胞类型；
[0030]4)在使用完本发明提供的细胞共培养装置培养细胞后，对区域2内的细胞进行收集，可以进行相关的生化分析，研究区域I内的细胞对区域2内细胞的蛋白表达影响:可以将区域2内的细胞直接进行原位固定，免疫组化染色分析，研究区域2细胞的形态变化，以及蛋白在细胞内的分布变化。
[0031]本发明提供的细胞共培养装置能够用于研究不同状态之间的同种细胞通过直接接触而带来的相互影响，同时还能研究不同种细胞通过直接接触而带来的相互影响，能够在培养两种不同的细胞方面进行应用，也能够在培养两种不同细胞状态下的同种细胞方面进行应用，具有良好的实用性和广泛的应用前景。
【附图说明】
[0032]图1为本发明提供的细胞共培养装置的制作流程示意图；
[0033]图2为本发明制作的细胞共培养装置的实物图；
[0034]图3为本发明提供的细胞共培养装置的使用流程示意图；
[0035]图4为肌细胞之间GFP的扩散过程图；
[0036]图5为互接触的心肌细胞间GFP扩散过程图。
【具体实施方式】
[0037]本发明提供了一种细胞共培养装置，应用于研究不同细胞之间的相互影响。不同种类的细胞之间可以通过接触的方式相互影响细胞的功能，在此类研究中，部分研究采用荧光分子标记的方式区分两种细胞，观察一种细胞对另一种细胞的影响;但是另一部分研究中，不适合采用荧光分子标记的方式区分两种细胞，对此类研究的开展造成一定的困难。本发明提供的细胞共培养装置，将特定的细胞接种在特定的部位，根据接种部位确定细胞类型，不需要再对细胞进行分子标记，就可开展不同细胞之间的相互影响的相关研究。
[0038]下面结合附图对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释，而不是限定。
[0039]如图1所示，本发明提供的细胞共培养装置，包括底板，底板上放置有若干用于细胞培养的玻璃片，玻璃片上放置有遮挡物，每个玻璃片的一部分被遮挡物遮挡住，记为区域2，玻璃片未被遮挡物遮挡住的部分记为区域I，且玻璃片上带有用于区分区域I和区域2范围的标记。其中底板仅要求表面平整即可，可以选用长方形盖玻片①或塑料板、金属板等；玻璃片可以选用圆形盖玻片②;遮挡物只要能达到遮挡住部分玻璃片的功能即可，可以选用长方形盖玻片或者透明胶带③。
[0040]如图1和图2所示，本发明在制作细胞共培养装置时具体包括以下步骤:
[0041]I)选取表面洁净的长方形盖玻片①(如图1A所示)；
[0042]2)在长方形盖玻片①上均匀放置6个圆形盖玻片②，在6个圆形盖玻片②上打上标记(如图1B所示)；
[0043]3)根据圆形盖玻片②上的标记，将圆形盖玻片②分为两个区域:区域I和区域2(如图1C所示)；
[0044]4)用长方形盖玻片或者透明胶带③覆盖区域2(如图1D所示)；
[0045]5)将装置通过钴源照射方式消毒，即完成细胞共培养装置的制作，制作好的细胞共培养装置的实物图如图2所示。
[0046]如图3所示，以研究绿色荧光蛋白(GFP)在相互接触的心肌细胞之间的扩散过程为例来说明本发明提供的细胞共培养装置的使用方法，其具体步骤如下:
[0047]I)将无菌的细胞共培养装置放入培养皿内(如图3A所示)；
[0048]2)将乳鼠心肌细胞接种至培养皿内，培养24h，如图3B所示，此时培养皿内、长方形盖玻片①上未被覆盖的区域、圆形盖玻片②上的区域I及透明胶带③上均贴敷有乳鼠心肌细胞；
[0049]3)将细胞共培养装置从培养皿内移走，如图3C所示，此时长方形盖玻片①上未被覆盖的区域、圆形盖玻片②上的区域I及透明胶带③上仍贴敷有乳鼠心肌细胞；
[0050]4)将透明胶带③从细胞共培养装置中移去，如图3D所示，此时细胞共培养装置上被透明胶带③覆盖的区域没有贴敷乳鼠心肌细胞，其他区域上仍贴敷有乳鼠心肌细胞；图3E是图3D对应的实物图，通过实验能够证实透明胶带③对圆形盖玻片②上的区域I和区域2的细胞贴敷无影响；
[0051]5)将长方形盖玻片①从细胞共培养装置中移去，只保留6个圆形盖玻片②，如图3F所示，此时圆形盖玻片②上的区域I上贴敷有乳鼠心肌细胞，区域2上没有贴敷乳鼠心肌细胞；
[0052]6)将6个圆形盖玻片②移入24孔板的6个孔内，如图3G所示；
[0053]7)向24孔板内接种携带GFP基因的病毒，孵育24h，使病毒感染乳鼠心肌细胞，如图3H所示，乳鼠心肌细胞只存在于圆形盖玻片②上的区域I上，且部分乳鼠心肌细胞被病毒感染，剩余部分乳鼠心肌细胞未被病毒感染；
[0054]8)将24孔板内的培养液换成新鲜培养液，清除液体中游离的病毒；
[0055]9)在24孔板内接种乳鼠心肌细胞(第二次接种心肌细胞)，培养24h，如图31所示，此时24孔板内及圆形盖玻片②上的区域I和区域2上均贴敷有第二次接种的乳鼠心肌细胞；
[0056]10)将6个圆形盖玻片移入新的24孔板，如图3J所示，圆形盖玻片②上的区域2上只贴敷有第二次接种的乳鼠心肌细胞，而区域I上贴服有第一次接种的未被病毒感染的乳鼠心肌细胞、第一次接种的被病毒感染的乳鼠心肌细胞和第二次接种的乳鼠心肌细胞;并且存在在区域I和区域2的交界处，区域I内的某一个第一次接种的被病毒感染的乳鼠心肌细胞与区域2内的某一个第二次接种的乳鼠心肌细胞直接相互接触的情况；
[0057]11)细胞继续培养12d;至此，圆形盖玻片②的区域I内的细胞包括3类:第一次接种的心肌细胞(感染病毒)，第一次接种的心肌细胞(未感染病毒)，第二次接种的心肌细胞;圆形盖玻片②区域2内的细胞均为第二次接种的心肌细胞。
[0058]用荧光显微镜实时观察在圆形盖玻片②区域2内的细胞状态，以及区域2内的GFP表达过程。区域I和区域2的细胞在分界线处存在细胞接触，这两部分细胞之间存在细胞联系(如图3J所示)。因为区域2内的细胞从未接触过病毒，细胞自身一定不会表达GFP，区域I内的部分细胞会表达绿色荧光;在培养12d后，如果在区域2内发现了表达绿色荧光的心肌细胞，则可以认为GFP—定是从区域I内的细胞传递过来，证明GFP可以在细胞之间通过某种方式传递，具体的实验结果如图4、图5所示。
[0059]图4给出了心肌细胞之间GFP的扩散过程，其中A-F为细胞荧光显微照片，A’-F’为细胞相差显微照片。虚线Boundary以下为区域I，虚线Boundary以上为区域2。可以看出细胞培养12d后，绿色荧光已经扩散至区域2的Frontier。
[0060]图5给出了相互接触的心肌细胞间GFP的扩散过程，其中细胞I位于区域I内，细胞2位于区域2内，且细胞I和细胞2相互接触。培养Sd后，细胞I出现荧光，细胞2未出现荧光；而培养12d后，细胞I和细胞2均出现荧光。
[0061]本发明提供的细胞共培养装置的优点在于:1)可以研究两种细胞之间的影响；细胞A接种在区域I，细胞B接种在区域2，研究细胞A对细胞B的影响。2)可以研究同种细胞不同状态之间的影响;A状态的细胞接种在区域I，B状态的细胞接种在区域2，研究A状态的细胞对B状态的细胞影响。3)不需要对细胞进行标记；区域2内的细胞都是同一类，确定区域2在盖玻片上的位置后，根据位置即可确定细胞的类型，无需通过细胞自身的标志蛋白或形态确定细胞类型。4)区域2内的细胞经过收集后，可以进行相关的生化分析，研究区域I内的细胞对区域2内细胞的蛋白表达影响;将区域2内的细胞直接进行原位固定，免疫组化染色分析，研究区域2细胞的形态变化，以及蛋白在细胞内的分布变化。这四点是目前已经报道的细胞共培养装置所不具备的优势。但是本发明提供的细胞共培养装置不能排除旁分泌对细胞的影响，只关注通过直接接触方式研究细胞对细胞的影响，因此在使用本发明提供的细胞共培养装置前，应该先进行transwel I共培养实验，排除旁分泌在细胞之间的影响。
【主权项】
1.一种细胞共培养装置，其特征在于:包括底板，底板上放置有若干用于细胞培养的玻璃片，玻璃片上放置有遮挡物，每个玻璃片的一部分被遮挡物遮挡住，记为区域2，玻璃片未被遮挡物遮挡住的部分记为区域I，且玻璃片上带有用于区分区域I和区域2范围的标记。2.根据权利要求1所述的细胞共培养装置，其特征在于:所述的底板为表面平整的玻璃板，玻璃片为盖玻片，遮挡物为载玻片、盖玻片或透明胶带。3.权利要求1或2所述的细胞共培养装置的制造方法，其特征在于，其具体步骤如下: 选取表面平整、洁净的底板，在底板上放置若干表面平整、洁净的玻璃片，并在玻璃片上标上用于区分区域I和区域2范围的标记，然后用遮挡物遮挡住区域2，再进行消毒处理，即得到细胞共培养装置。4.根据权利要求3所述的细胞共培养装置的制造方法，其特征在于:所述的消毒处理是采用钴源照射的方式消毒。5.权利要求1或2所述的细胞共培养装置在培养两种不同的细胞方面的应用。6.权利要求1或2所述的细胞共培养装置在培养两种不同细胞状态下的同种细胞方面的应用。7.权利要求1或2所述的细胞共培养装置的使用方法，其特征在于，其具体步骤如下: 1)将无菌的细胞共培养装置放入培养皿内，然后将细胞A接种至培养皿内进行培养，再将细胞共培养装置从培养皿内移走，此时细胞共培养装置中底板上未被覆盖的区域、玻璃片上的区域I及遮挡物上均贴敷有细胞A; 2)将遮挡物从细胞共培养装置中移去，露出未被细胞A贴敷的区域2，再移去底板，只保留玻璃片，此时玻璃片的区域I上贴敷有细胞A，区域2上未贴敷任何细胞； 3)将玻璃片移入24孔板内，向24孔板内接种携带基因X的病毒，孵育细胞，使病毒感染细胞A，此时玻璃片区域I上的部分细胞A被病毒感染，再将24孔板内的培养液换成新鲜培养液，清除培养液中游尚的病毒； 4)在24孔板内再次接种细胞A进行培养，此时玻璃片的区域I和区域2上均贴敷有第二次接种的细胞A，同时区域I上还贴敷有第一次接种的未被病毒感染的细胞A和第一次接种的被病毒感染的细胞A; 5)将玻璃片移入新的24孔板内继续进行细胞培养，最后收集区域2上贴敷的细胞进行生化分析，分析区域I内的细胞对区域2内细胞的影响。8.权利要求1或2所述的细胞共培养装置的使用方法，其特征在于，其具体步骤如下: 1)将无菌的细胞共培养装置放入培养皿内，然后将细胞A接种至培养皿内进行培养，再将细胞共培养装置从培养皿内移走，此时细胞共培养装置中底板上未被覆盖的区域、玻璃片上的区域I及遮挡物上均贴敷有细胞A; 2)将遮挡物从细胞共培养装置中移去，露出未被细胞A贴敷的区域2，再移去底板，只保留玻璃片，此时玻璃片的区域I上贴敷有细胞A，区域2上未贴敷任何细胞； 3)将玻璃片移入24孔板内，向24孔板内接种细胞B进行培养，此时玻璃片的区域I上同时贴敷有细胞A和细胞B，区域2上仅贴敷有细胞B; 4)将玻璃片移入新的24孔板内继续进行细胞培养，最后收集区域2上贴敷的细胞进行生化分析，分析区域I内的细胞对区域2内细胞的影响。
【文档编号】C12M3/00GK106085848SQ201610479284
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】岳志杰, 余志斌, 张琳, 赵星成, 王云英, 焦博, 圣娟娟, 茹凝玉
【申请人】中国人民解放军第四军医大学